李澤培,唐川康,史孝敏,彭燕

（四川醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院消化內(nèi)科，四川瀘州646000）

辣椒素對浸水-束縛應(yīng)激大鼠胃動力作用及機制研究*

李澤培,唐川康,史孝敏,彭燕

（四川醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院消化內(nèi)科，四川瀘州646000）

目的：研究辣椒素（CAP）對浸水束縛應(yīng)激（模型）導(dǎo)致的大鼠胃動力障礙的作用及其機制。方法：選取雄性SPF級SD大鼠40只隨機均分為對照組、模型組、模型組+CAP組和CAP組4組，每組10只。采用浸水束縛應(yīng)激法建立胃動力障礙大鼠模型，胃管注入CAP 1 mg/g，連續(xù)4周。實驗?zāi)y定大鼠胃酚紅排空率，并取胃竇組織用RT-PCR方法檢測c-kit mRNA、SCF mRNA的轉(zhuǎn)錄水平。結(jié)果：①胃酚紅排空率：CAP組胃酚紅排空率顯著高于對照組和模型組（P＜0.05），模型組+CAP組、對照組胃酚紅排空率顯著高于模型組（P＜0.05）；②c-kit mRNA、SCF mRNA的轉(zhuǎn)錄水平：模型組c-kit mRNA轉(zhuǎn)錄水平顯著低于對照組，CAP組c-kit mRNA轉(zhuǎn)錄水平顯著高于模型組（P＜0.05）；模型+CAP組、CAP組SCF mRNA轉(zhuǎn)錄水平顯著高于對照組和模型組（P＜0.05），對照組SCF mRNA轉(zhuǎn)錄水平顯著高于模型組（P＜0.05）。結(jié)論：小劑量CAP 4周可促進正常大鼠及模型大鼠胃動力，其機制可能與CAP調(diào)節(jié)SCF的表達有關(guān)，但與c-kit、Cajal間質(zhì)細胞的相關(guān)性尚不明確。

辣椒素；胃動力；Cajal間質(zhì)細胞；c-kit；SCF

Key wordsCapsaicin;Gastric motility;Interstitial cells of Cajal;C-kit;SCF.

胃腸動力障礙性疾?。╠isorders of gastrointestinal motility，DGIM）的發(fā)病率逐年上升，目前已成為消化系統(tǒng)中發(fā)病率最高，最缺少治療手段的疾病之一。辣椒素（capsaicin,CAP）是紅辣椒中的主要活性成分，其化學(xué)名稱為反8-甲基-N-香草基-6-壬烯基酰胺，近年CAP對胃腸動力的作用已引學(xué)者重視。大量研究顯示適量的CAP對胃腸動力具有促進作用[1-3]，CAP對胃腸動力的作用機制目前尚不清楚。本實驗通過研究CAP對水浸-束縛應(yīng)激（water immersionrestraint stress，WIRS）模型大鼠胃酚紅排空率的影響，以及胃竇組織c-kit和SCF mRNA的轉(zhuǎn)錄水平，探討CAP對大鼠胃動力的作用及可能機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

成年雄性SPF級SD大鼠40只，體重180～250 g（瀘州醫(yī)學(xué)院動物實驗中心提供）。

1.2 主要試劑及儀器主要試劑

95%的辣椒素（河南倍特生物技術(shù)有限公司）,酚紅（國藥集團化學(xué)試劑有限公司）,總RNA提取試劑盒（Trizol試劑盒）（北京TIANGEN）,RT-PCR試劑盒（成都博瑞克生物技術(shù)有限公司）,DNA Maker（北京TIANGE）,瓊脂糖法國（BIOWEST公司）；主要實驗儀器：低溫高速離心機（美國Thermo公司）,紫外分光光度儀（SHIMADZU公司）,電子分析天平（Mettler公司）,-70℃超低溫冰箱（美國Thermo公司）,水平電泳儀（美國Bio-Rad公司）,PCR擴增儀（杭州博日公司）,凝膠成像系統(tǒng)（美國Bio-Rad公司）,全波長分光光度計（美國Thermo公司）。

1.3 實驗方法

1.3.1 CAP飼料的配制方法

精確稱取95%的CAP 105.3 mg（含CAP 100 mg），完全溶解于30 mL的食用油（金龍魚）中，再加入食用面粉100 g，混勻，所得即為CAP含量1 mg/g的飼料。

1.3.2 造模方法及驗證

1.3.2.1 模型組每日上午進行造模

將大鼠四肢束縛固定于鼠板上，然后將鼠板垂直浸入(19±1)℃水中，水面平胸骨劍突，持續(xù)1 h。造模結(jié)束后大鼠自由攝食進水，連續(xù)4周。正常組自由攝食進水，連續(xù)4周。

1.3.2.2 4周后測定大鼠胃酚紅排空率

在20 mL的大鼠胃內(nèi)容物中加入20 mL濃度為0.5 mol/L的NaOH攪拌混勻。取5 mL上清液，加入0.5 mL濃度為20%的三氯乙酸去蛋白離心10 min。取上清液，用分光光度計測在560 nm波長下待測液的吸光度值，為實測酚紅吸光度。另取2 mL酚紅溶液，先后加入18 mL蒸餾水、20 mL濃度為0.5 mol/L的NaOH、4 mL濃度為20%的三氯乙酸攪拌混勻，用分光光度計測在560 nm波長下測標準液的吸光度值，為標準酚紅吸光度。大鼠的胃酚紅排空率=(1—實測酚紅吸光度/標準酚紅吸光度)×100%。

1.3.3 實驗分組及CAP干預(yù)實驗

SD大鼠40只，體重180～250 g，用代謝籠飼養(yǎng)，溫度（24±1）℃，通風(fēng)良好，隨機分為4組，每組10只。即：

A組（對照組）：自由攝食進水，連續(xù)4周；

B組（模型組）：每日模型1 h，模型結(jié)束后自由攝食進水，連續(xù)4周；

C組（模型組+CAP組）：每日模型1 h，模型結(jié)束后胃管注入CAP飼料（CAP含量為1 mg/g）5 g/ kg/只，待CAP飼料食用完后，再給予普通飼料喂養(yǎng)，連續(xù)4周；

D組（CAP組）：每日胃管注入CAP飼料（CAP含量為1 mg/g）5 g/kg/只，待CAP飼料食用完后，再給予普通飼料喂養(yǎng)，連續(xù)4周。

1.3.4 標本采集

4周后所有大鼠禁食24 h，于次日早晨給予濃度為50 mg/dL的酚紅溶液2 mL/鼠灌胃。灌入酚紅溶液30 min后處死大鼠。將賁門與幽門結(jié)扎，取出鼠胃沿胃大彎側(cè)剪開，用蒸餾水將胃內(nèi)容物沖洗到器皿中定容為20 mL，用于測定酚紅排空率。取胃竇組織存于-70℃超低溫冰箱，用RT-PCR方法檢測c-kit mRNA及SCF mRNA的轉(zhuǎn)錄水平。

1.3.5 檢測指標和方法

1.3.5.1 大鼠胃酚紅排空率的測定

同1.3.2.2,1.3.5.2 RT-PCR檢測c-kit mRNA及SCF mRNA的轉(zhuǎn)錄水平。

1.3.5.2 組織總RNA的提取

取100 mg大鼠胃竇組織，加入1 mL裂解液RZ，液氮研磨；后依次加入氯仿，無水乙醇進行RNA沉淀，經(jīng)洗滌后加入RNase-free ddH2O溶解RNA沉淀，測其濃度及純度備用。

1.3.5.3 RT-PCR反應(yīng)及瓊脂糖電泳檢測

每個標本的RNA用Rnase free H2O配成相同濃度，按RT試劑盒說明書合成cDNA，以此為模板進行RT-PCR反應(yīng)。反應(yīng)條件為：94℃5 min，94℃30 s，退火溫度30 s，72℃1 min，72℃1 min，30個循環(huán)（其中GAPDH、c-kit、SCF退火溫度分別為57.3℃、56.2℃、53.0℃）。根據(jù)GenBank上公布的基因序列分別設(shè)計大鼠c-kit、SCF及GAPDH的引物（見表1）。取每一樣本PCR反應(yīng)產(chǎn)物各5 uL加入瓊脂糖凝膠電泳槽樣孔內(nèi)，上樣孔內(nèi)加入DNA Marker進行電泳，結(jié)束后膠置于紫外凝膠成像系統(tǒng)成相，分析并保存實驗結(jié)果。

表1 c-kit、SCF及GAPDH的引物序列和擴增產(chǎn)物長度

1.3.5.4 結(jié)果分析

電泳后紫外凝膠成像結(jié)果用Quantity One軟件測定條帶灰度值，用c-kit、SCF分別與GAPDH條帶灰度值的比值作為mRNA的相對表達量，分析各組相對表達量之間是否具有統(tǒng)計學(xué)意義。

1.4 統(tǒng)計學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 模型驗證

2.1.1 動物一般情況

正常組（ZC組）：大鼠一般狀態(tài)好，活動靈活，進食正常，大小便正常，無死亡；

模型組（MX組）：大鼠精神狀態(tài)差，行動遲緩，進食較少，大便干結(jié)，但無死亡。

2.1.2 大鼠胃酚紅排空率

正常組、WIRS模型組大鼠胃酚紅排空率分別為：61.76%±1.22%，53.07%±2.19%，WIRS模型組胃酚紅排空率顯著低于正常組（P＜0.05，見圖1）。

圖1 兩組大鼠胃酚紅排空率的直方圖

2.2 CAP干預(yù)的實驗結(jié)果

2.2.1 動物一般情況

A組：大鼠一般狀態(tài)好，活動靈活，進食正常，大小便正常；

B組：大鼠精神狀態(tài)差，行動遲緩，進食較少，大便干結(jié)，其中3只大鼠實驗過程中精神萎靡，但未死亡；

C組：大鼠精神狀態(tài)良好，行動稍遲緩，進食正常，大小便正常；

D組：大鼠一般狀態(tài)好，活動靈活，進食量較多，大小便正常。

2.2.2 大鼠胃酚紅排空率

各組大鼠胃酚紅排空率：組間比較采用單因素方差分析LSD法，結(jié)果顯示D組胃酚紅排空率顯著高于A、B、C組（P＜0.05），A、C組胃酚紅排空率顯著高于B組（P＜0.05，見表2）。

表2 各組大鼠胃酚紅排空率（±s）

表2 各組大鼠胃酚紅排空率（±s）

注：a.與A組比較,P＜0.05；b.與B組比較,P＜0.05；c與C.組比較,P＜0.05

組別A B C D動物數(shù)（只）10 10 10 10胃排空率（%）62.91±1.10 55.33±1.79a61.88±2.07b70.78±2.42abc

2.2.3 胃竇組織c-kit mRNA、SCF mRNA的表達

2.2.3.1 大鼠胃竇組織c-kit mRNA的表達

RT-PCR結(jié)果顯示：大鼠胃竇組織c-kit mRNA表達水平：A組、D組c-kit mRNA轉(zhuǎn)錄水平顯著高于B組（P＜0.05，見表3、2）。

圖2 RT-PCR檢測各組c-kit mRNA的表達

2.2.3.2 大鼠胃竇組織SCF mRNA的表達

RT-PCR結(jié)果顯示：大鼠胃竇組織SCF mRNA表達水平：A組SCF mRNA轉(zhuǎn)錄水平顯著高于B組（P＜0.05），C組、D組SCF mRNA轉(zhuǎn)錄水平顯著高于A、B組（P＜0.05，見表3）。

圖3 RT-PCR檢測各組SCF mRNA的表達

表3 RT-PCR檢測各組c-kit mRNA、SCFmRNA的表達（±s）

表3 RT-PCR檢測各組c-kit mRNA、SCFmRNA的表達（±s）

注：與A組比較,P＜0.05；與B組比較,P＜0.05

組別A B C D動物數(shù)（只）10 10 10 10 c-kit 0.624±0.016 0.606±0.011a0.622±0.011 0.633±0.013aSCF 0.894±0.011 0.853±0.009a0.932±0.009ab0.949±0.012ab

3 討論

近年來研究發(fā)現(xiàn)CAP對胃腸動力有一定影響，有關(guān)CAP與胃腸動力關(guān)系的實驗結(jié)果不一。多數(shù)研究認為小劑量CAP可促進胃動力，而大劑量時則對胃動力產(chǎn)生抑制作用。Mozsi K等[1]研究發(fā)現(xiàn)CAP能促進胃腸道疾病患者的胃排空。Bartho等[4]報道，CAP可誘發(fā)豚鼠食道出現(xiàn)兩相收縮，即瞬時收縮和持久收縮。Bartho等[5]報道CAP可引起豚鼠回腸平滑肌的收縮，且此作用與神經(jīng)末梢釋放的生物活性物質(zhì)刺激平滑肌細胞和肌間神經(jīng)元有關(guān)。本實驗通過配制CAP大鼠飼料，CAP的用量為5 mg/kg/d，連續(xù)喂食4周，結(jié)果顯示：CAP組胃酚紅排空率顯著高于正常對照組與模型組，模型+CAP組胃酚紅排空率顯著高于模型組，提示CAP可能對正常大鼠及模型大鼠胃動力具有改善作用，這與Mozsi等的研究一致。

胃腸運動主要受神經(jīng)系統(tǒng)與體液因素調(diào)節(jié)。其中腸神經(jīng)系統(tǒng)-Cajal間質(zhì)細胞（interstitial cells of Cajal，ICC）-平滑肌細胞組成的網(wǎng)絡(luò)是胃腸動力的基本功能單位，對胃腸道的運動功能起決定性作用[6]。大量研究發(fā)現(xiàn)ICC可維持胃腸平滑肌節(jié)律性運動，并有產(chǎn)生起搏電位和傳導(dǎo)慢波電位、調(diào)節(jié)神經(jīng)遞質(zhì)等功能[7-8]酪氨酸激酶受體（c-kit）是ICC表面表達的特異性標志物，其在腸神經(jīng)信號傳遞中起重要作用，檢測其含量可作為消化系Cajal間質(zhì)細胞的定量指標[9]。 c-kit與其自然配體-干細胞生長因子（stem cell factor，SCF）結(jié)合后啟動的信號途徑，對維持ICC的生長、發(fā)育及表型起著重要作用[10]。

慢波信號主要由ICC的一種亞型-腸肌從ICC（ICC-MY）產(chǎn)生，慢波傳遞至胃腸道平滑肌細胞，使平滑肌細胞外的Ca2+內(nèi)流，使之產(chǎn)生興奮性收縮來調(diào)節(jié)胃腸道的節(jié)律性運動，胃腸道動力障礙與慢波信號的減弱有密切關(guān)系[11-13]。Klein等[14]研究發(fā)現(xiàn)ICC缺失小鼠的小腸缺少慢波活動，并出現(xiàn)不協(xié)調(diào)性收縮。Chen J等[15]研究發(fā)現(xiàn)破壞ICC結(jié)構(gòu)可導(dǎo)致大鼠胃腸道慢波紊亂。

腸神經(jīng)系統(tǒng)（the enteric nervous system ENS）參與腸道動力的調(diào)節(jié)，很多胃腸動力障礙性疾病都存在ENS的紊亂。病理狀態(tài)下ENS結(jié)構(gòu)的紊亂發(fā)生在ICC病變之后，ICC的減少往往伴隨著腸道神經(jīng)元和腸道膠質(zhì)細胞的減少[16,17]。Rolle等[18]發(fā)現(xiàn)腸內(nèi)神經(jīng)元發(fā)育不良與新生兒期ICC細胞網(wǎng)絡(luò)系統(tǒng)的缺失有密切關(guān)系。ICC可能通過刺激神經(jīng)細胞的干細胞因子影響ENS，神經(jīng)細胞則是通過生成氮氧化物合酶，誘導(dǎo)產(chǎn)生NO刺激ICC細胞的增生[19]。由此提示c-kit、SCF與胃腸動力可能有一定聯(lián)系。

本實驗通過研究c-kit與SCF基因RT-PCR結(jié)果顯示模型組c-kit mRNA轉(zhuǎn)錄水平顯著低于正常對照組，但CAP組c-kit mRNA轉(zhuǎn)錄水平與正常對照組差異無統(tǒng)計學(xué)意義；模型組SCF mRNA轉(zhuǎn)錄水平顯著低于正常對照組，CAP組SCF mRNA轉(zhuǎn)錄水平顯著高于正常對照組與模型組。據(jù)此我們推論模型引起的大鼠胃排空率減慢，可能與應(yīng)激影響SCF/ c-kit信號途徑，影響ICC的功能有關(guān)；CAP可能對SCF的表達有一定影響，但與c-kit、Cajal間質(zhì)細胞的相關(guān)性尚不明確。

綜上所述，本實驗研究發(fā)現(xiàn)正常大鼠及模型大鼠攝食小劑量CAP飼料4周可促進或改善胃動力，可能與CAP調(diào)節(jié)SCF的表達有關(guān)，為臨床胃動力障礙的治療提供方向，但CAP與c-kit、Cajal間質(zhì)細胞的相關(guān)性尚不明確有待進一步研究。

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（2015-10-04收稿）

Effects and mechanisms of capsaicin on gastric motility in water immersion restraint stress rats

Li Zepei,Tang Chuankang,Shi Xiaomin,Pen Yan
Department of Gastroenterology,the First Affiliated Hospital of Sichuan Medical University,Luzhou 646000, Sichuan Province,China

Objective：To investigate the effects and mechanisms of capsaicin（CAP）on gastric motility in water immersion restraint stress rats.Methods：Forty male SD rats were randomly divided into 4 groups(n=10): normal control group,model group,model+CAP group,and CAP group.The model of water immersion restraint stress was created by injecting capsaicin 1mg/g for 4 consecutive weeks.At the end of the experiment,gastric emptying rate of phenol red was tested and the expression of c-kit and SCF mRNAs were evaluated in the gastric antrum tissues.Results:①The gastric emptying rate in CAP group was significantly higher than that in the control and model groups(P＜0.05),and the gastric emptying rate in the model+CAP and control groups were significantly higher than that in the model group(P＜0.05).②The expression of c-kit mRNA in model group was significantly lower than that in the control group(P＜0.05),and the expression of c-kit mRNA in CAP group was significantly higher than that in the model group(P＜0.05).The expression of SCF mRNA in model+CAP and CAP groups was significantly higher than that in the control and model groups(P＜0.05),and the expression of SCF mRNA in control group was significantly higher than that in the model group(P＜0.05).Conclusion：The CAP fed for 4 weeks could improve the gastric emptying rate in the normal and WIRS rats.The effect of CAP on gastric motility may come from the altered expression of SCF,but have no obvious relationship with interstitial cells of Cajal and the expression of c-kit.

R453.9；R-33

A

10.3969/j.issn.1000-2669.2016.01.006

*四川省科技廳項目基金（編號：12037）

李澤培（1987—），男，住院醫(yī)師，碩士生

彭燕（1963—），女，主任醫(yī)師。E-mail:1806857826@qq.com