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二肽基肽酶-IV介導(dǎo)內(nèi)皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化在糖尿病腎纖維化過(guò)程中的作用及機(jī)制研究*

2016-03-31 08:55宋麗孫玉紅施森
關(guān)鍵詞:肽酶內(nèi)皮內(nèi)皮細(xì)胞

宋麗,孫玉紅,施森

(1四川醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院麻醉科;2藥理學(xué)教研室;3附屬醫(yī)院血管外科,四川瀘州646000)

論著

二肽基肽酶-IV介導(dǎo)內(nèi)皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化在糖尿病腎纖維化過(guò)程中的作用及機(jī)制研究*

宋麗1,孫玉紅2,施森3

(1四川醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院麻醉科;2藥理學(xué)教研室;3附屬醫(yī)院血管外科,四川瀘州646000)

目的:探討二肽基肽酶-IV在糖尿病腎纖維化中的作用及機(jī)制。方法:動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中建立糖尿病CD-1小鼠慢性腎纖維化模型,予以二肽基肽酶-IV抑制劑干預(yù)4周后,檢測(cè)正常組、糖尿病組及干預(yù)組中腎臟組織中二肽基肽酶-IV的表達(dá)及內(nèi)皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化的變化。細(xì)胞實(shí)驗(yàn)中培養(yǎng)人微血管內(nèi)皮細(xì)胞,分別予以TGFβ2及二肽基肽酶-IV抑制劑或siRNA干預(yù),觀察各組中二肽基肽酶-IV、內(nèi)皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化及TGFβ/smad信號(hào)通路的變化。結(jié)果:與正常小鼠相比,糖尿病小鼠腎組織表現(xiàn)出明顯纖維化改變、高表達(dá)的二肽基肽酶-IV以及明顯增強(qiáng)的內(nèi)皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化;二肽基肽酶-IV抑制劑干預(yù)后腎纖維化及內(nèi)皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化明顯緩解及抑制。細(xì)胞實(shí)驗(yàn)中,二肽基肽酶-IV抑制劑或siRNA能明顯降低TGFβ2誘導(dǎo)的內(nèi)皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化及TGFβ/smad信號(hào)通路。結(jié)論:二肽基肽酶-IV抑制劑能通過(guò)抑制內(nèi)皮細(xì)胞間質(zhì)轉(zhuǎn)化來(lái)改善糖尿病腎纖維化。

二肽基肽酶-IV;糖尿病腎纖維化;內(nèi)皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化

腎臟纖維化是腎臟疾病發(fā)展過(guò)程中的最終通路,導(dǎo)致腎臟結(jié)構(gòu)和功能惡化腎臟過(guò)濾功能的破壞[1]。腎纖維化是由長(zhǎng)期的損傷與細(xì)胞外基質(zhì)的過(guò)度積累所導(dǎo)致的正常的傷口愈合過(guò)程失調(diào)而引起。在纖維化過(guò)程中,腎成纖維細(xì)胞中發(fā)揮重要的作用,但對(duì)成纖維細(xì)胞的來(lái)源及機(jī)制尚不清楚[2]。最新研究發(fā)現(xiàn)在基質(zhì)生產(chǎn)的成纖維細(xì)胞的起源中,內(nèi)皮細(xì)胞間質(zhì)轉(zhuǎn)型(endothelial-to-mesenchymal transition,EndoMT)是肌成纖維細(xì)胞或活化的成纖維細(xì)胞的一個(gè)重要來(lái)源,EndoMT顯著性標(biāo)志是是由CD31和血管內(nèi)皮鈣黏蛋白(VE-cadherin)等血管內(nèi)皮細(xì)胞標(biāo)記物的丟失和以及α-平滑肌肌動(dòng)蛋白等間充質(zhì)蛋白的表達(dá)增加。研究表明EndoMT參與異常的心室壁收縮能力及心電所導(dǎo)致的心纖維化[3]。EndoMT也參與了肺纖維化,特發(fā)性高血壓,角膜纖維化[4-5]。許多生長(zhǎng)因子和信號(hào)通路支配調(diào)節(jié)EndoMT在胚胎心臟和心肌的纖維化中的作用。有研究發(fā)現(xiàn)EndoMT也參與早期腎臟纖維化[6],2008年zeisberge等首次在小鼠模型上證實(shí)EndoMT在腎纖維化中的重要作用[7]。關(guān)于其作用機(jī)制研究眾多,目前普遍認(rèn)為T(mén)GFβ信號(hào)通路起到重要作用[8]。

二肽基肽酶-IV(DPP-IV)是T細(xì)胞活化CD26抗原,它廣泛分布于人體器官及組織。DPP-IV能選擇性地切割內(nèi)源性胰高血糖素樣肽-1(GLP-1)和葡萄糖依賴(lài)性促胰島素多肽(GIP)的脯氨酸或丙氨酸,從而降低血糖。由于其分布的廣泛及多效性的作用,DPP-IV抑制劑的使用也能潛在的保護(hù)器官,而腎臟是DPP-IV表達(dá)最高的器官之一[9]。研究表明,DPP-IV抑制劑能通過(guò)抑制TGFβ/smad信號(hào)通路改善心衰[10]。

DPP-IV抑制劑是否能通過(guò)TGFβ通路改善糖尿病小鼠腎纖維化目前鮮有報(bào)道。我們利用糖尿病小鼠慢性腎纖維化模型來(lái)設(shè)計(jì)本實(shí)驗(yàn)探討DPP-IV抑制劑是否能通過(guò)抑制TGFβ/smad信號(hào)通路介導(dǎo)EndoMT從而改善糖尿病腎纖維化。

1 材料與方法

1.1 1型糖尿病模型

8周CD1雄性小鼠隨機(jī)分為兩組,實(shí)驗(yàn)組腹腔注射鏈脲佐菌素(STZ)200 mg/kg,STZ溶解于pH 4.4的枸櫞酸鈉緩沖液中,對(duì)照組注射注射用水。3 d后檢測(cè)血糖,高于300 mg/dL確定造模成功。正常飲食飼養(yǎng)小鼠至干預(yù)。

1.2 DPP-IV抑制劑干預(yù)

STZ注射20周后,糖尿病小鼠隨機(jī)分為糖尿病組和干預(yù)組,干預(yù)組以DPP-IV抑制劑KR-62436(Sigma)10 mg/kg/day溶于飲用水中。糖尿病組正常飲食。

1.3 標(biāo)本收集

(1)實(shí)驗(yàn)中定時(shí)監(jiān)測(cè)血糖、體重變化。干預(yù)4周后收集尿液,眼球取血后,取腎組織,分別制成冰凍切片、石蠟切片及部分組織-70℃保存。

(2)測(cè)各組尿素、肌酐等腎功能情況。

(3)免疫熒光檢測(cè)FSP-1/CD31及α-SMA/CD31,雙染陽(yáng)性提示處于內(nèi)皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化的內(nèi)皮細(xì)胞。

(4)western blot檢測(cè)FSP-1、α-SMA、CD31、DPP-IV。

1.4 細(xì)胞實(shí)驗(yàn)

1.4.1 細(xì)胞培養(yǎng)

人微血管內(nèi)皮細(xì)胞接種于6孔板后,孵育于EGM-2培養(yǎng)液,待細(xì)胞融合至70%時(shí)予以干預(yù)。具體分為3組:對(duì)照組,TGF β2(5 ng/mL)組,TGFβ2+ KR-62436(5.7 μM)組。

1.4.2 DPP-IV siRNA轉(zhuǎn)染

培養(yǎng)好的人微血管內(nèi)皮細(xì)胞分為3組:對(duì)照組,TGFβ2組,TGFβ2+DPP-IV siRNA。其中對(duì)照組及TGFβ2組細(xì)胞轉(zhuǎn)入對(duì)照空白siRNA,TGFβ2+DPPIV siRNA組轉(zhuǎn)入DPP-IV siRNA(ATCGGGAAGTGGCGTGTTCAA),轉(zhuǎn)染前2 h更換無(wú)血清無(wú)雙抗1640培養(yǎng)液。用無(wú)血清無(wú)雙抗1640培養(yǎng)液稀釋siRNA和轉(zhuǎn)染試劑lipofectamineTM 2000(Invitrogen,USA),將稀釋液混合,形成siRNA-轉(zhuǎn)染試劑復(fù)合物,將其加入細(xì)胞中,siRNA終濃度為100 nmol/L,6 h后更換為正常培養(yǎng)液,24 h后TGFβ2組及TGFβ2+DPPIV siRNA組予以TGFβ2(5 ng/ml)刺激。

1.4.3 內(nèi)皮細(xì)胞間質(zhì)轉(zhuǎn)型及DPP-IV檢測(cè)

48 h后提取蛋白,western blot檢測(cè)FSP-1、α-平滑肌細(xì)胞肌動(dòng)蛋白(α-SMA)、CD31、DPP-IV、smad-3、phospho-smad 3。

1.4.4 遷移實(shí)驗(yàn)

將上述各組細(xì)胞置于遷移小室,觀察48 h后各組細(xì)胞遷移情況。

2 結(jié)果

2.1 小鼠模型

圖1 DPP-IV抑制劑KR-62436干預(yù)后小鼠的體重、血糖、心臟及腎臟重量變化

圖2 DPP-IV抑制劑KR-62436干預(yù)后小鼠腎臟組織學(xué)染色及蛋白肌酐比值

與對(duì)照組相比,糖尿病小鼠體重明顯降低,血糖顯著升高,腎臟和肝臟重量明顯增加。與糖尿病小鼠相比,KR-62436干預(yù)后,體重、血糖水平及器官重量(腎,肝,和心臟)均無(wú)明顯變化(見(jiàn)圖1A-D)。與對(duì)照組小鼠比較,STZ誘導(dǎo)20周后糖尿病小鼠表現(xiàn)出嚴(yán)重纖維化(腎小球明顯增大,間質(zhì)系膜擴(kuò)張,相對(duì)纖維化面積擴(kuò)張、尿微量白蛋白水平及血肌酐升高)。而KR-62436治療的糖尿病的小鼠恢復(fù)正常的腎臟組織學(xué)結(jié)構(gòu)及尿微量蛋白水平降低(見(jiàn)圖2A-F、圖3)。

圖3 小鼠蛋白尿肌酐比值圖

2.2 腎組織免疫熒光及Western blot結(jié)果

通過(guò)定量分析免疫熒光中共同表達(dá)血管內(nèi)皮標(biāo)記CD31和間充質(zhì)標(biāo)記α-SMA的細(xì)胞,糖尿病小鼠腎組織中EndoMT過(guò)程的細(xì)胞數(shù)比正常小鼠腎臟明顯增多(見(jiàn)圖4 A-C)。KR-62436治療后雙染陽(yáng)性細(xì)胞則顯著減少。Western blot也提示與正常腎組織比較,糖尿病小鼠腎組織中DPP-IV、α-SMA、FSP1蛋白表達(dá)增加,而CD31則低于正常小鼠。與糖尿病小鼠相比較,KR-62436處理后DPP-IV、α-SMA、FSP1蛋白表達(dá)降低,CD31表達(dá)增加。這一結(jié)果表明糖尿病腎臟中EndoMT明顯強(qiáng)于正常小鼠腎臟,而DPPIV抑制劑能抑制EndoMT。

圖4 EndoMT在糖尿病腎組織中的表達(dá)

2.3 細(xì)胞實(shí)驗(yàn)結(jié)果

HMVEC培養(yǎng)48 h后,與正常組培養(yǎng)相比較,TGFβ2干擾組中,α-SMA、DPP-IV、smad-3及phospho–smad 3蛋白水平明顯增高,KR-62436組蛋白明顯抑制上述蛋白表達(dá)。同時(shí)我們也可以觀察到KR-62436能顯著提高被TGF β2抑制的CD 31表達(dá)。

2.4 細(xì)胞轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)結(jié)果

細(xì)胞轉(zhuǎn)染DPP-IV siRNA后,DPP-IV水平明顯抑制,α-SMA、TGFβR1及TGFβR 2也明顯降低,而CD 31水平則增加。這表明DPP 4在EndoMT中起著重要作用,而且該作用與TGF/smad信號(hào)通路相關(guān)。在細(xì)胞遷徙試驗(yàn)中可以看到,TGF β2干預(yù)下遷移細(xì)胞較正常組明顯增加,而DPP-IVsiRNA轉(zhuǎn)染后可減少遷移細(xì)胞(見(jiàn)圖5 A-D)。

圖5 DPP-IV抑制劑或siRNA轉(zhuǎn)染后人微血管內(nèi)皮細(xì)胞中細(xì)胞遷移變化

3 討論

糖尿病腎病是目前全世界非常嚴(yán)重及發(fā)病率較高的疾病之一,可發(fā)展成終末期腎臟病,最終需要腎替代療法。腎臟纖維化的程度決定殘余腎功能,因此抑制腎纖維化和恢復(fù)腎的正常結(jié)構(gòu)是研究包括糖尿病腎病在內(nèi)的慢性腎臟疾病的治療目標(biāo)。

研究表明腎成纖維細(xì)胞是EndoMT的重要來(lái)源之一,在腎纖維化中占著重要作用[11]。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)DPP-IV抑制劑KR-62436是抑制成纖維細(xì)胞活化過(guò)程的一個(gè)有效的治療方案。腎組織DPP-IV表達(dá)最高的器官之一,而DPP-IV抑制劑的使用也能潛在的保護(hù)器官[12],本研究也發(fā)現(xiàn),與未干預(yù)糖尿病小鼠相比較,我們發(fā)現(xiàn),糖尿病小鼠腎臟DPP-IV蛋白表達(dá)明顯增加,免疫組化揭示DPP-IV強(qiáng)表達(dá)于腎臟系膜,內(nèi)皮細(xì)胞,腎小管小管。研究發(fā)現(xiàn)DPP-IV抑制劑維格列汀給藥24周能防止STZ誘導(dǎo)的雄性SD糖尿病大鼠腎臟損傷[13]。本實(shí)驗(yàn)利用STZ誘導(dǎo)的一型糖尿病CD1小鼠模型檢測(cè)糖尿病誘導(dǎo)20周后KR-62436干預(yù)是否能改善腎臟纖維化。我們發(fā)現(xiàn),這種干預(yù)在不改變血糖體重等生理基礎(chǔ)的前提下能顯著改善腎纖維化,這說(shuō)明以DPP-IV為靶向治療糖尿病腎臟是有治療價(jià)值的。本實(shí)驗(yàn)免疫組化結(jié)果表明與糖尿病小鼠相比較,DPP-IV抑制劑KR-62436治療的糖尿病的小鼠腎臟組織學(xué)結(jié)構(gòu)明顯改善,尿微量蛋白水平也明顯降低。DPP-IV抑制劑可通過(guò)抑制TGF-β/Smad信號(hào)來(lái)改善心臟功能,而本實(shí)驗(yàn)也證實(shí)DPP-IV抑制劑能抑制TGF-β/Smad信號(hào),這也是其在內(nèi)皮間質(zhì)轉(zhuǎn)型中的可能機(jī)制。目前對(duì)EndoMT和體內(nèi)多種疾病關(guān)系的研究越來(lái)越受到人們關(guān)注,對(duì)調(diào)控EndoMT的作用機(jī)制進(jìn)行了多方向多層面的探討,未來(lái)對(duì)內(nèi)皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化過(guò)程更全面更深入的認(rèn)識(shí)將有助于為解決多種疾病提供更加有效的診療措施。

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(2015-10-27收稿)

Effect and mechanisms of dipeptidyl peptidase-IV on endothelial-to-mesenchymal transition in diabetic kidney fibrosis

Song Li1,Sun Yuhong2,Shi Sen3
1Deparment of Anesthesiology,the Affiliated Hospital of Sichuan Medical University,2Department of Pharmacy, Sichuan Medical University;3Deparment of Vascular Surgery,the Affiliated Hospital of Sichuan Medical University, Luhzou 646000,Sichuan Province,China

Objective:To analyze the roles and mechanisms of dipeptidyl peptidase-IV(DPP-IV)on endothelial-to-mesenchymal transition in diabetic kidney fibrosis.Methods:Diabetic CD1 mice were used as chronic diabetic kidney fibrosis model.Mice were treated with or without DPP-IV inhibitor for 4 weeks,kidney samples from each groups were used to analyze the pathological changes,DPP-IV protein levels,and endothelialto-mesenchymal transition.In vitro,human microvascular endothelial cells were stimulated with or without TGFβ2,and after treatment with DPP-IV inhibitor or siRNA,cell migration,DPP-IV protein levels,endothelialto-mesenchymal transition,and TGFβ/smad signaling were analyzed.Results:Diabetic CD-1 mice exhibited significant kidney fibrosis and high levels of DPP-IV expression when compared with control mice.DPP-IV inhibitor-treated diabetic mice exhibited a suppression of DPP-IV protein expression and an amelioration of kidney fibrosis associated with the inhibition of EndoMT.In cultured endothelial cells,we found that DPP-IV inhibitor inhibited TGFβ2-induced EndoMT and TGFβ/Smad signaling.Conclusion:DPP-IV inhibitor can ameliorate kidney fibrosis by suppressing EndoMT and TGFβ/Smad signaling.

Dipeptidyl peptidase-IV;Diabetic kidney fibrosis;Endothelial-to-mesenchymal transition

R587.1;R-33

A

10.3969/j.issn.1000-2669.2016.01.002

國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(81500643)

宋麗(1980-),女,碩士,講師

施森(1980-),男,碩士,副主任醫(yī)師。E-mail:shisen80@163.com

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