何行健 薛 宏 劉昌文 鄭 穎 劉 勇 李學(xué)聲 葉征明 艾均文

(湖南省蠶?？茖W(xué)研究所，湖南長(zhǎng)沙 410127)

全蠶粉用黃血高度油蠶品種的選育初報(bào)

何行健 薛 宏 劉昌文 鄭 穎 劉 勇 李學(xué)聲 葉征明 艾均文

(湖南省蠶?？茖W(xué)研究所，湖南長(zhǎng)沙 410127)

在家蠶品種選育過(guò)程中發(fā)現(xiàn)并鑒定了一例黃血高度油蠶的突變體，初步確定其基因型為黃血白卵油蠶(YYw－3oew－3oe)。在此基礎(chǔ)上針對(duì)黃血基因與白卵油蠶基因的純合開展了系統(tǒng)分離，通過(guò)連續(xù)7代自交分離與蛾區(qū)選擇得到了遺傳性狀穩(wěn)定的黃血白卵油蠶新品種，進(jìn)而對(duì)該純系品種進(jìn)行飼養(yǎng)調(diào)查與全蠶粉中1－脫氧野尻霉素(DNJ)和尿酸鹽等成分分析。結(jié)果表明:純系后代黃血高度油蠶的性狀能穩(wěn)定遺傳，其產(chǎn)卵量為421粒，良卵率為97.15%，全齡經(jīng)過(guò)在24 d左右，小蠶期平均減蠶率5.03%，大蠶期減蠶率為0.65%，死籠率為0.98%，4齡起蠶蟲蛹率為96.66%;純系全蠶粉中DNJ含量為0.482 5%，略高于對(duì)照種皓月A的0.446 5%;尿酸鹽含量為0.468 5%，極顯著低于對(duì)照種的3.868 5%。該研究為進(jìn)一步選育出全蠶粉用黃血高度油蠶組合打下了堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)。

家蠶;黃血;白卵油蠶;全蠶粉;品種選育

養(yǎng)蠶是中華民族先民的偉大發(fā)明。早在5 000多年前就發(fā)現(xiàn)了蠶絲作為紡織服飾材料的利用價(jià)值，并創(chuàng)造了蠶業(yè)的偉大輝煌，形成了在世界市場(chǎng)上的長(zhǎng)期壟斷地位。但是，栽桑養(yǎng)蠶、繅絲織綢這一傳統(tǒng)產(chǎn)業(yè)越來(lái)越受到其它紡織產(chǎn)品與農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)的擠壓，急切需要科技創(chuàng)新與產(chǎn)業(yè)多元化來(lái)實(shí)現(xiàn)產(chǎn)業(yè)轉(zhuǎn)型升級(jí)。家蠶全身都是寶，其藥用價(jià)值也不斷得到發(fā)現(xiàn)挖掘。李時(shí)珍在《本草綱目》［1］中詳細(xì)記述:“蠶，孕絲蟲也?！残Q類入藥，俱用食桑者”;白僵病蠶被廣泛用于治療中風(fēng)、喉風(fēng)喉痹、乳癰初起、大風(fēng)癘疾等疾病的藥方中。古醫(yī)書《神農(nóng)本草經(jīng)》［2］中也有相關(guān)記錄:“白僵蠶，味咸。主治小兒驚癇夜啼，去三蟲，滅黑鼾，令人面色好，男子陰瘍病。生平澤”?，F(xiàn)代研究表明［3－14］，家蠶幼蟲制備的全蠶粉中富含1－脫氧野尻霉素(DNJ)、類胡蘿卜素、黃酮類化合物、多肽、不飽和脂肪酸、氨基酸、多糖等，而其中有些主要成分具有降血糖、抑制腫瘤和提高免疫力的功效，這些成果為推動(dòng)家蠶全蠶粉相關(guān)研究的不斷深入與其產(chǎn)品的多元化開發(fā)提供了新的思路。

不同品種家蠶全蠶粉的藥用、食用價(jià)值存在較大差異。施新琴［4］、沈以紅等［15］研究表明，家蠶地理系統(tǒng)、品種甚至種級(jí)的不同都可能影響DNJ的富集。廣東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院蠶業(yè)與農(nóng)產(chǎn)品加工研究所對(duì)多化性黃血蠶的功能成分分析［16］和降血脂作用研究［17］的結(jié)果表明，黃血蠶比普通蠶具有更高的藥用價(jià)值。王安皆等［18］、馬寶俊等［19］、杜鑫等［20］認(rèn)為，油蠶中所含尿酸鹽結(jié)晶明顯低于普通蠶，更適合作為全蠶粉產(chǎn)品的原料，并建議選育合適的油蠶品種?；谏鲜鲅芯浚x育一個(gè)聚合黃血和油蠶基因的家蠶品種用于制備全蠶粉，具有一定的現(xiàn)實(shí)意義。2011年我們發(fā)現(xiàn)并分離了一例符合選育目標(biāo)的黃血高度油蠶突變體［21］，委托西南大學(xué)對(duì)其進(jìn)行基因鑒定［22］，確定其相關(guān)基因型為YYw－3oew－3oe。本文針對(duì)黃血基因與白卵油蠶基因的純合開展了系統(tǒng)分離，就獲得的純系材料進(jìn)行了飼養(yǎng)調(diào)查與相關(guān)成分的檢測(cè)分析，現(xiàn)將試驗(yàn)結(jié)果報(bào)告如下。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

黃血高度油蠶品種:湘白卵油蠶［22］，在湖南省蠶?？茖W(xué)研究所發(fā)現(xiàn)和保存，黃血選育品種自然突變產(chǎn)生，其突變?nèi)后w有黃血和白血個(gè)體分離，黃血個(gè)體幼蟲皮膚高度透明，繭色金黃，成蟲復(fù)眼白色，產(chǎn)白色卵;黃血和油蠶基因經(jīng)初步鑒定為黃血(Y)［23］和白卵油蠶(w－3oe)［22］，基因型YYw－3oew－3oe。為方便記錄，沿用鑒定時(shí)的符號(hào)oex。

雜交或回交品種:932、夏芳B、7532、秋白A等，從中選擇體質(zhì)強(qiáng)健、蠶期表現(xiàn)較好的個(gè)體，作為黃血高度油蠶品種選育時(shí)的雜交或回交品種。

對(duì)照品種:皓月A，選擇皓月A作為對(duì)照品種的原因是，oex中有皓月A血統(tǒng)，而皓月A為現(xiàn)行春用品種規(guī)定的對(duì)照種菁松×皓月中的日系親本。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 黃血高度油蠶的純系分離 F1～F4代混合收蟻，進(jìn)行系統(tǒng)分離選擇，在確保黃血和高度油蠶2個(gè)目的性狀不丟失的前提下，嚴(yán)格進(jìn)行“五選”，選留優(yōu)良個(gè)體繼代。F5代單蛾圈卵收蟻，在固定目的性狀的同時(shí)進(jìn)行區(qū)間選擇，并按母號(hào)留種。F6代用所留母號(hào)分別混合收蟻，并淘汰有白血個(gè)體分離的母號(hào)。F7代后初步確定純系并擴(kuò)繁。

1.2.2 oex純系性狀調(diào)查 (1)oex純系產(chǎn)附情況調(diào)查。因oex蠶卵為白色，較難分出未受精卵和其它不良卵，故以實(shí)際孵化情況進(jìn)行產(chǎn)附情況調(diào)查。隨機(jī)選取10個(gè)卵圈，催青時(shí)在蠶卵黑暗處理前點(diǎn)數(shù)再出卵的情況，記為再出卵數(shù);收蟻第2天上午，點(diǎn)數(shù)孵化卵殼數(shù)，記為良卵數(shù);點(diǎn)數(shù)未孵化卵，記為死卵數(shù)，計(jì)算良卵率［良卵率(%)=良卵數(shù)/(良卵數(shù)+再出卵數(shù)+死卵數(shù))×100］。(2)oex純系齡期經(jīng)過(guò)與生命率調(diào)查。每天5:00、11:00、17:00和23:00記錄溫、濕度，并按蛾區(qū)記錄收蟻、各齡眠和起的日期與時(shí)間，上蔟、采繭日期，主要技術(shù)處理，蠶體發(fā)育情況，淘汰情況等。蠶期結(jié)束后采用算術(shù)平均和方差分析的方法，對(duì)記錄數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

1.2.3 oex黃血高度油蠶全蠶粉的相關(guān)成分分析尿酸鹽的含量用高效液相色譜法(HPLC)［24］檢測(cè); DNJ的含量用反相高效液相色譜法(RP－HPLC)［25］檢測(cè)。所有樣品檢測(cè)均在湖南省農(nóng)產(chǎn)品加工研究所完成。

1.2.4 改良途徑和選擇方法探索 以oex純系為基礎(chǔ)材料，利用體質(zhì)強(qiáng)健、配合力好、易繁的成對(duì)推廣品種932、夏芳B、7532、秋白A等做輪回親本，多次回交，并通過(guò)血緣的相對(duì)替換和隔離進(jìn)行品種改良。

圖1 黃血高度油蠶純系分離圖示

2 結(jié)果與分析

2.1 黃血高度油蠶的純系分離

突變體oex油蠶為隱性突變，后代不分離，僅需對(duì)黃血進(jìn)行純化?？紤]到測(cè)交試驗(yàn)較為麻煩，我們采取以單蛾后代分離情況淘汰“母號(hào)”的方法進(jìn)行純系分離。黃血高度油蠶純系分離情況見圖1，以突變體產(chǎn)生的第1代為F1，F(xiàn)1～F4代混合飼養(yǎng)，分離淘汰不良個(gè)體和非目標(biāo)個(gè)體，選擇黃血個(gè)體繼代;F5代收取10個(gè)蛾圈的蠶卵進(jìn)行單蛾育，選擇無(wú)白血個(gè)體分離的蛾區(qū)，以蛾區(qū)號(hào)為“母號(hào)”自交留種;F6代各“母號(hào)”分別混合收蟻，4齡時(shí)觀察血色，若有白血個(gè)體分離，淘汰該母號(hào)，無(wú)白血個(gè)體分離的剩余母號(hào)在F7代分別混合收蟻，再無(wú)白血個(gè)體分離時(shí)，則選留蠶期表現(xiàn)較好的“母號(hào)”作為選育基礎(chǔ)材料，其余“母號(hào)”納入保育系統(tǒng)，F(xiàn)8代以后單蛾育。后代雖然仍可能有黃血和白血基因雜合的蛾區(qū)，但概率極低，可當(dāng)作純系使用。這樣，既實(shí)現(xiàn)了純系分離，又確保了所得純系的質(zhì)量。

從理論上講，僅從黃血純化的角度，只要連續(xù)3代就能實(shí)現(xiàn)純系分離，但在實(shí)際操作過(guò)程中，為了確保后代群體性狀優(yōu)良，前期進(jìn)行了多代飼養(yǎng)和篩選。實(shí)驗(yàn)室飼養(yǎng)結(jié)果表明，獲得的oex純系性狀表現(xiàn)良好，發(fā)蛾、交配、產(chǎn)卵情況都很好，無(wú)明顯的生理障礙。

2.2 oex純系性狀調(diào)查

2.2.1 oex純系產(chǎn)附情況調(diào)查 從2014年春oex純系的產(chǎn)附情況(表1)可以看出，黃血高度油蠶oex純系產(chǎn)卵量略低，平均為421粒，比對(duì)照種皓月A低74粒;良卵率可達(dá) 97.15%，與對(duì)照種皓月 A (96.97%)相仿。良卵率經(jīng)反正弦平方根處理后的方差分析結(jié)果為P=0.55＞0.05，F(xiàn)(1，19)=0.37，表明oex純系和皓月A在良卵率上無(wú)顯著差異。

表1 2014年春oex純系的產(chǎn)附情況

表2 2015年春oex純系的生命率

2.2.2 oex純系的齡期經(jīng)過(guò)與生命率調(diào)查 從表2－3看，在相同飼育條件下，oex小蠶期減蠶率(5.03%)比對(duì)照種皓月A(2.23%)平均高2.91個(gè)百分點(diǎn);1齡期經(jīng)過(guò)比對(duì)照種長(zhǎng)10 h。大蠶期減蠶率(0.65%)比對(duì)照種皓月A(15.82%)低15.18個(gè)百分點(diǎn);5齡期經(jīng)過(guò)比對(duì)照種短1 d左右。oex和皓月A雖然飼養(yǎng)條件相同，但由于隔壁蠶室進(jìn)行血液型膿病攻毒試驗(yàn)(攻毒時(shí)間為2齡起蠶)，因隔離不徹底，使皓月A感染了血液型膿病，造成了皓月A的4齡期減蠶率(4.56%)比oex(0.54%)高4.02個(gè)百分點(diǎn)，5齡期減蠶率(11.80%)比oex(0.11%)高11.69個(gè)百分點(diǎn)，死籠率比oex高12.99個(gè)百分點(diǎn)，4齡起蠶蟲蛹率比oex低26.00個(gè)百分點(diǎn);這也初步表明oex對(duì)血液型膿病的抗性要比對(duì)照種皓月A強(qiáng)。

表3 2015年春oex純系的齡期經(jīng)過(guò)

2.3 oex黃血高度油蠶全蠶粉的成分分析

2015年秋對(duì)oex純系全蠶粉中DNJ和尿酸鹽的含量進(jìn)行了檢測(cè)(表4)，結(jié)果表明:oex黃血高度油蠶全蠶粉中DNJ的含量為0.482 5%，略高于對(duì)照種皓月A的0.446 5%;尿酸鹽的含量為0.468 5%，極顯著低于對(duì)照種皓月A的3.868 5%。

表4 2015年秋oex黃血高度油蠶全蠶粉的2種成分檢測(cè)

2.4 改良途徑和選擇方法探索

從oex純系的飼養(yǎng)情況可以看出，oex純系具有卵量較少，小蠶期經(jīng)過(guò)較長(zhǎng)，稚蠶減蠶率較高，發(fā)育不齊等不良性狀，但這些性狀均為數(shù)量性狀，應(yīng)該可以改良。為此，我們選擇現(xiàn)行品種中蠶期表現(xiàn)較好的幾個(gè)品種如932、夏芳B、7532和秋白A等作為輪回親本，與oex純系雜交后多代回交;為防止2個(gè)目標(biāo)基因的丟失，需要自交和回交連續(xù)交替進(jìn)行，至少回交4代以上;自交和回交的后代均混合收蟻飼養(yǎng);當(dāng)達(dá)到所需回交代數(shù)時(shí)，其后代采取單蛾飼育或同母號(hào)混合飼育，并連續(xù)同飼育區(qū)自交，淘汰出現(xiàn)白血個(gè)體的母號(hào)或蛾區(qū)，實(shí)現(xiàn)黃血基因的純合。黃血高度油蠶品種的選育過(guò)程見圖2。

圖2 黃血高度油蠶品種的選育過(guò)程圖示

目前，我們已完成2代回交，從試驗(yàn)預(yù)期和選育過(guò)程來(lái)看，自交后代目標(biāo)個(gè)體較少，且仍有小蠶期發(fā)育較緩的現(xiàn)象。因此，自交后代應(yīng)收足夠多的蟻量，一般混收1 g以上蟻量;不能在小蠶期過(guò)多淘汰青頭蠶，應(yīng)推遲提青時(shí)間，或正常提青后分批飼養(yǎng)?？紤]到將來(lái)雜種優(yōu)勢(shì)的利用問(wèn)題，在選育過(guò)程中我們選擇了2對(duì)現(xiàn)行品種的中、日系親本932、7532和夏芳B、秋白A分別作為輪回親本，開展了特色材料的成對(duì)選育，以期獲得的黃血高度油蠶新品種具有較高而穩(wěn)定的配合力。

3 小結(jié)和討論

將黃血高度油蠶品種定位為全蠶粉用品種，在一定程度上也具有輕簡(jiǎn)性特點(diǎn)。研究表明［3，15］，全蠶粉用家蠶最適宜利用時(shí)期為5齡第3～4天。在品種選育時(shí)，不需要考慮絲質(zhì)，簡(jiǎn)化了選育工作;在生產(chǎn)上，不需要考慮5齡后期的飼養(yǎng)、上蔟、采繭、收烘和繅絲等工作，節(jié)省了人力、物力和財(cái)力。國(guó)際上已有部分國(guó)家成功地將藥用或食用發(fā)展為家蠶的主要利用途徑，如韓國(guó)飼養(yǎng)的家蠶80%以上用于制備全蠶粉，已形成規(guī)?；庐a(chǎn)業(yè)［11］。但到目前為止，國(guó)內(nèi)對(duì)全蠶粉用特殊用途的家蠶品種選育方面的研究，僅見西南大學(xué)［26］和山東省蠶業(yè)研究所［18］等單位有相關(guān)報(bào)道，這可能與我國(guó)家蠶的主要利用方向較為單一有關(guān)，其藥用或食用價(jià)值沒有得到應(yīng)有的重視。同時(shí)，國(guó)內(nèi)尚未制訂特殊用途品種相關(guān)的審定標(biāo)準(zhǔn)，這也在一定程度上妨礙了此類品種的選育與開發(fā)。

以全蠶粉用為目標(biāo)的黃血高度油蠶的開發(fā)利用具有潛在的市場(chǎng)前景，選育相應(yīng)的優(yōu)良特色品種是開發(fā)利用的前提，而好的基礎(chǔ)材料是品種選育的必要保障。湘白卵油蠶的純系分離試驗(yàn)初步確定，純系聚合有黃血(Y)和白卵油蠶(w－3oe)2個(gè)目標(biāo)基因，在一定的飼養(yǎng)條件下，卵、幼蟲、蛹和成蟲4個(gè)階段均未出現(xiàn)高致死現(xiàn)象，生理障礙不明顯，可作為選育的基礎(chǔ)材料。以單蛾后代分離情況淘汰“母號(hào)”的方法進(jìn)行純系分離在理論上很難將顯性基因純化，在對(duì)具有該特色的新品種選育過(guò)程中，應(yīng)注意嚴(yán)格淘汰出現(xiàn)血色個(gè)體分離的蛾區(qū)，并進(jìn)行連續(xù)多代選擇，或在經(jīng)過(guò)3～4代連續(xù)自交選擇后，通過(guò)測(cè)交試驗(yàn)直接淘汰出現(xiàn)非黃血個(gè)體所對(duì)應(yīng)的整個(gè)蛾區(qū)，以達(dá)到血色遺傳性狀穩(wěn)定之目的。DNJ和尿酸鹽含量分析表明，湘白卵油蠶的DNJ含量略高于對(duì)照親本，但尿酸鹽含量極顯著低于普通家蠶品種。至于其他活性成分含量尚待今后的試驗(yàn)進(jìn)一步測(cè)定。

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S882.2

A

1007－0982(2016)02－0047－06

2015－10－09;接受日期:2016－02－25

現(xiàn)代農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系建設(shè)專項(xiàng)(編號(hào) CARS－22);湖南省農(nóng)業(yè)廳農(nóng)業(yè)科技重點(diǎn)項(xiàng)目(編號(hào)2009－01－05)。

第1作者信息:何行健(1982—)，男，湖南岳陽(yáng)，本科，農(nóng)藝師。Tel:15084819509，E-mail:huadi0913@163.com

信息:艾均文(1968—)，男，研究員。Tel:13574832818，E-mail:aijunwen718@sina．com