劉影俠 杜貝貝 岳 玲 黃 濤 司馬楊虎，2 徐世清，2

(1蘇州大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)與生物科學(xué)學(xué)院，江蘇蘇州 215123; 2現(xiàn)代絲綢國家工程實驗室，江蘇蘇州 215123)

不同繭色類型家蠶品種資源的繭殼和蠶蛹的總黃酮含量及蠶蛹的黃酮類物質(zhì)組成分析

劉影俠1杜貝貝1岳 玲1黃 濤1司馬楊虎1，2徐世清1，2

(1蘇州大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)與生物科學(xué)學(xué)院，江蘇蘇州 215123;2現(xiàn)代絲綢國家工程實驗室，江蘇蘇州 215123)

我國彩色繭絲家蠶品種資源豐富，而且彩色繭絲具有保濕、抑菌、抗氧化、防紫外線等特性;而蠶蛹不僅富含蛋白質(zhì)而且含有多種活性物質(zhì)及大量人體所需的微量元素。因此，繭殼和蠶蛹的開發(fā)日趨倍受關(guān)注 。以7533限等17個不同繭色類型家蠶品種資源為材料，檢測蠶繭繭殼和蠶蛹中黃酮類化合物的含量，并通過高效液相色譜法(High Performance Liquid Chromatography，簡稱HPLC)分析蠶蛹中的黃酮類物質(zhì)蘆丁、異槲皮苷、紫云英苷、槲皮素和綠原酸的含量。結(jié)果顯示，不同繭色家蠶品種資源蠶繭繭殼中黃酮類化合物含量由高到低的順序為綠色繭＞黃色繭＞白色繭，而不同繭色類型家蠶品種資源間蠶蛹中黃酮類化合物含量差異不顯著。并且蠶蛹的黃酮類物質(zhì)中不含綠原酸;綠色繭家蠶品種資源蠶蛹中的槲皮素、異槲皮苷含量比其他繭色家蠶品種資源蠶蛹的含量高，黃色繭家蠶品種資源蠶蛹不含或含有較低的蘆丁。這為更好地開發(fā)利用天然彩色繭和蠶蛹資源提供重要的參考。

家蠶;天然彩色繭;黃酮類化合物;蠶蛹;槲皮素

家蠶是一種重要的經(jīng)濟昆蟲，其所衍生的各類產(chǎn)品正逐步向成熟的產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)階段發(fā)展。家蠶繭色分為白色繭和彩色繭，彩色繭主要分為黃紅繭系和綠繭系兩大類，黃紅繭系包括淡黃、金黃、肉色、紅色、銹色等，綠繭系包括淡綠和綠色2種［1］。黃紅繭系的繭絲顏色來自桑葉中的2種類胡蘿卜素，一種是非極性的胡蘿卜素，另一種是極性的含氧類胡蘿卜素，又稱之為葉黃素;而綠繭系的繭絲顏色主要來自黃酮類化合物［6］。研究者還發(fā)現(xiàn)家蠶繭熒光的產(chǎn)生主要與重組家蠶體內(nèi)黃酮類物質(zhì)的高表達相關(guān)［2－3］。

黃酮類化合物(Flavonoids)，主要指具有色酮環(huán)與苯環(huán)為基本結(jié)構(gòu)的一類化合物的總稱，是一類小分子的天然活性物質(zhì)。研究表明，黃酮類化合物對人體具有消除氧自由基、抗氧化、抗過敏、抗炎、抗菌、抗突變、抗腫瘤、保肝、雌激素樣作用，以及保護心腦血管系統(tǒng)、抗病毒和殺蟲等生理活性，且毒副作用?。?］。另外，黃酮類化合物還具有防止鈣質(zhì)流失和改善動物生長等作用［5］。槲皮素是一種多羥基黃酮類化合物，化學(xué)名為3，3'，4'，5，7－五羥基黃酮，具有多種生物學(xué)活性及很高的藥用價值，其藥理作用廣泛，不僅有抗氧化及清除自由基的作用，還有抗癌、抗炎、抗菌、抗病毒、降糖降壓、免疫調(diào)節(jié)及心血管保護等作用［5］。此外，還具有止瀉、抗血栓、抗肥胖、抗抑郁等作用［6］。家蠶蛹自古以來就是滋補食療的珍品，其豐富的有效活性成分具有獨特的藥理作用。本文分析比較了不同繭色類型家蠶品種資源繭殼和蠶蛹中黃酮類化合物的含量，并采用高效液相色譜法(High Performance Liquid Chromatography，簡稱HPLC)測定蠶蛹中的綠原酸、蘆丁、異槲皮苷、紫云英苷、槲皮素5種活性成分的含量，以期對蠶蛹藥材質(zhì)量控制標準的提高，以及為含蠶蛹的成藥制劑質(zhì)量控制提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 蠶品種資源及其處理 7533限等17個試驗用家蠶品種資源均由蘇州大學(xué)遺傳與發(fā)育研究室提供，具體家蠶品種資源名稱及繭色詳見表1。

表1 家蠶品種資源及其繭色分類

1.1.2 主要試劑和儀器 蘆丁標準品，由國藥集團化學(xué)試劑有限公司提供;異槲皮苷(批號: 15070211)、槲皮素(批號:15090717)、綠原酸(批號:15041814)、紫云英苷(批號:14120515)、蘆丁(批號:14082710)對照品，均由中國食品藥品檢定研究院提供(以上所有試劑均為供含量測定用)。甲醇(色譜純)，由美國Fisher公司提供;乙醇等化學(xué)試劑均為分析純，上海生工生物工程有限公司產(chǎn)品;水為超純水。

1.1.3 主要儀器 KQ－500DB型數(shù)控超聲波器，昆山超聲波儀器有限公司產(chǎn)品;DK－8B型電熱恒溫水槽及DHG－9246A型電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱，均為上海精宏實驗設(shè)備有限公司產(chǎn)品;安捷倫液相色譜儀Agilent 1200、KQ－500DB型數(shù)控超聲波器，均為昆山超聲波儀器有限公司產(chǎn)品;分光光度儀，美國貝克曼庫爾特有限公司(BECKMAN COULTER)產(chǎn)品。

1.2 試驗方法

1．2．1 繭殼和蠶蛹樣品的制備 7533限等17個不同品種資源，采用常規(guī)桑葉育飼養(yǎng)家蠶，結(jié)繭化蛹3 d后分別采繭、削繭取出蠶蛹。(1)繭殼和蠶蛹中總黃酮含量測定樣品的制備。隨機選取7533限等13個不同品種資源(表1中的前13個品種資源，以下相同)雌、雄各10粒的蠶蛹、繭殼分別裝袋，并按表1中的代號進行編號，蠶蛹保存于－70℃的冰箱中備用，對應(yīng)繭殼常溫保存?zhèn)溆谩y定時將蠶蛹從冰箱中取出，然后用剪刀將蠶蛹剪成兩半置于恒溫烘箱中50℃干燥96 h以上，最后用研缽研磨成蠶蛹粉。繭殼的烘繭條件:初烘時溫度設(shè)定為100℃，時間2 h;復(fù)烘時溫度設(shè)定為95℃，時間2 h，用剪刀剪碎試樣繭殼。(2)蠶蛹中5種黃酮類物質(zhì)含量測定樣品的制備。隨機選取2個白色繭品種(7533限、菁松 B)、2個黃色繭品種(皓42JH橘、皓12黃)、2個綠色繭品種(0903JGJ、大造)的蠶蛹各20粒(雌、雄混合)分別裝袋，并按表1中的代號進行編號，按照1．2．1項“(1)繭殼和蠶蛹中總黃酮含量測定樣品的制備”的方法制備蠶蛹粉。

1.2.2 蘆丁標準曲線的建立 稱取10 mg蘆丁標準品，置于50 mL的容量瓶內(nèi)，加入75%的乙醇溶液定容至50 mL，得到0.2 mg/mL的蘆丁標準溶液。然后分別取蘆丁標準溶液0、1、2、4、5、6 mL后加入0.3 mL 5%的NaNO2溶液，搖勻后靜置6 min，加入0.3 mL 10%的Al(NO3)3溶液，混合后靜置6 min，加入4 mL 1 mol/L的NaOH溶液混勻，加入75%的乙醇溶液定容至25 mL，使蘆丁標準溶液的濃度分別為0、0.008、0.016、0.032、0.040、0.048 mg/mL，然后在510 nm下測定吸光值，空白區(qū)用純水代替蘆丁標準溶液，處理同上，3個重復(fù)。得到回歸方程y= 10.982 0 x+0.001 1，相關(guān)系數(shù)R2=0.997 6，質(zhì)量濃度與對應(yīng)的吸光度呈良好的線性關(guān)系(圖1)。

1.2.3 不同繭色類型家蠶品種資源的繭殼和蠶蛹的總黃酮含量測定 (1)試樣液的制備。①蠶蛹粉試樣液的制備。用電子天平分別準確稱取0.3 g 7533限等13個各繭色類型家蠶品種資源雌、雄的蠶蛹粉，加入到10 mL的75%的乙醇溶液中，超聲波預(yù)先處理20 min，再在60℃的水浴鍋中抽提3 h，過濾除去不溶物，最后將濾液放置于4℃的冰箱中避光過夜，吸取上層液作為下一步試驗的蠶蛹粉試樣液。②蠶繭殼試樣液的制備。蠶繭殼試樣液的制備和蠶蛹粉的方法相似，即用電子天平分別準確稱取0.5 g 7533限等13個各繭色類型家蠶品種資源雌、雄的蠶繭殼，放入試管中，每支試管加入75%的乙醇溶液10 mL，然后放置到超聲波中處理30 min，放到60℃的水浴鍋里抽提4 h，過濾除去雜質(zhì)，收集第1次抽提的濾液，將剩余的蠶繭殼再重復(fù)抽提1～2次，直到蠶繭殼上的色素全部被抽提出來，最后將各次抽提的濾液合并定容于25 mL的標準容量瓶中至25 mL，放置于4℃的冰箱中避光過夜，同樣也是吸取上層液作為下一步試驗的繭殼試樣液［7－8］。

(2)總黃酮類化合物含量的測定。①蠶蛹粉中總黃酮類化合物含量的測定。采用分光光度法，分別準確量取1 mL 7533限等13個各繭色類型家蠶品種資源雌、雄的蠶蛹粉試樣液于10 mL的容量瓶中，加入0.3 mL 5%的NaNO2溶液搖勻，靜置6 min，加入 0.3 mL 10%的 Al(NO3)3溶液混勻，靜置6 min，加入4 mL 1 mol/L的 NaOH溶液后，再用75%的乙醇溶液定容至10 mL，于510 nm下測定吸光值，以75%的乙醇溶液代替蠶蛹粉試樣液作空白校正。對照標準曲線求出蠶蛹中總黃酮類化合物的含量。②蠶繭殼中總黃酮類化合物含量的測定。分別準確量取5 mL 7533限等13個各繭色類型家蠶品種資源雌、雄的繭殼試樣液于10 mL的容量瓶中，按照1.2.3(2)項“①蠶蛹粉中總黃酮類化合物含量的測定”方法，測定蠶繭繭殼中的總黃酮類化合物的含量。

1.2.4 不同繭色類型家蠶品種資源蠶蛹中5種黃酮類物質(zhì)含量的HPLC測定 (1)色譜條件。Sepax GP－C18色譜柱(4.6 mm×250 mm×5 μm);柱溫: 30℃;流速:0.8 mL/min;進樣量:20 μL;流動相A: 0.05%H3PO4水溶液;流動相B:乙腈;波長:254 nm。在此條件下各組分分離度良好(表2)。

表2 各組分色譜分離梯度

(2)標準溶液的制備。稱取綠原酸1.0 mg、異槲皮苷1.0 mg、槲皮素2.5 mg、紫云英苷2.5 mg、蘆丁2.5 mg，然后加入80%的甲醇溶液分別定容于10 mL的容量瓶中至10 mL，得到100 mg/L綠原酸溶液，100 mg/L異槲皮苷溶液，250 mg/L槲皮素溶液，250 mg/L紫云英苷溶液，250 mg/L蘆丁溶液作為標準儲備液。分別取1 mL標準儲備液定容到50 mL的容量瓶中至50 mL，配成標準使用液。然后，再將標準使用液稀釋成不同濃度的標準溶液，具體質(zhì)量濃度如表3所示。

表3 4種黃酮類化合物以及綠原酸溶液的質(zhì)量濃度mg/L

(3)HPLC下蘆丁等標準曲線的建立。分別用綠原酸、蘆丁、異槲皮苷、紫云英苷和槲皮素標準溶液進樣20 μL，按照1.2.4項“(1)色譜條件”測定峰面積。然后以標準溶液質(zhì)量濃度(mg/L)為橫坐標，以峰面積積分值為縱坐標，繪制標準曲線(圖2－6)。

圖2 綠原酸標準曲線

圖3 異槲皮苷標準曲線

圖4 槲皮素標準曲線

圖5 紫云英苷標準曲線

圖6 蘆丁標準曲線

(4)供試樣品溶液的制備。分別取7533限和菁松B(白色繭)、皓42JH橘和皓12黃(黃色繭)、0903JGJ和大造(綠色繭)的蠶蛹粉，精確秤取0.3 g，置于具塞試管中，加入80%的甲醇溶液10 mL，塞上試管塞，超聲波處理(250 W，37 kHz)30 min，在60℃水浴中抽提4 h，過濾除去不溶物，將濾液置于4℃的冰箱中避光過夜，吸取上層液作為試樣液，進行家蠶蛹黃酮類化合物的組成鑒定。

2 結(jié)果與分析

2.1 繭殼和蠶蛹中總黃酮類化合物的含量

2.1.1 不同繭色類型家蠶品種資源繭殼中總黃酮類化合物的含量 7533限等3類繭色類型13個家蠶品種資源雌、雄繭殼中總黃酮類化合物的含量如圖7所示。綠色繭繭殼中黃酮類化合物的含量最高，平均含量為1.30 mg/g左右，比白色繭繭殼中的含量高近4倍，其次是黃色繭繭殼中的含量為0.90 mg/g，白色繭繭殼中的含量較低，平均含量為0.34 mg/g。對繭色間的差異顯著性進行了比較(t檢驗)，綠色繭繭殼中黃酮類化合物含量極顯著高于白色繭繭殼中的含量(P＜0.01)，而黃色繭繭殼中黃酮類化合物含量與白色繭繭殼之間不存在差異性，并且綠繭系彩色繭的繭色深淺與黃酮類化合物的含量高低直接相關(guān)。但是，也有一些黃色繭品種資源的繭殼中黃酮類化合物的含量低于白色繭品種資源的現(xiàn)象，說明并非所有彩色繭品種資源的繭殼中黃酮類化合物的含量都比白色繭品種資源的高。

圖7 7533限等3類繭色類型13個家蠶品種資源繭殼中總黃酮類化合物的含量

2.1.2 不同繭色類型家蠶品種資源蠶蛹中總黃酮類化合物的含量 7533限等3類繭色類型13個家蠶品種資源雌、雄蠶蛹中總黃酮類化合物的含量見圖8。白色、黃色以及綠色3類繭色家蠶品種資源蠶蛹中的黃酮類化合物的含量介于 2.30～4.40 mg/g。對繭色間的差異顯著性進行了分析(t檢驗)，結(jié)果顯示3種繭色家蠶品種資源蠶蛹中黃酮類化合物的含量不存在顯著性差異。分析圖8，可以發(fā)現(xiàn)同一品種資源蠶蛹中黃酮類化合物的含量遠遠高于其在繭殼中的含量，分別高1～10倍不等，并且在一些品種資源間，蠶蛹中黃酮類化合物的含量相差很大，這就為挖掘高黃酮蠶蛹品種資源和開發(fā)家蠶蛹的藥用價值提供了一定的參考。

圖8 7533限等3類繭色類型13個家蠶品種資源蠶蛹中總黃酮類化合物的含量

2.2 繭殼和蠶蛹中總黃酮類化合物含量的關(guān)系分析

從圖9中可知，有些家蠶品種資源相比其他家蠶品種資源，蠶蛹和繭殼中黃酮類化合物的含量都比較高，如L6JR×0903JGJ(♀黃色繭，繭殼中的含量為2.127 6 mg/g，蠶蛹中的含量為3.692 4 mg/g)、L6JR×0903JGJ肉 (♀黃色繭，繭殼中的含量為1.922 7 mg/g，蠶蛹中的含量為3.624 1 mg/g)等;有些家蠶品種資源的蠶蛹和繭殼中黃酮類化合物的含量都比較低，如黃42皓·皓(♀黃色繭，繭殼中的含量為0．306 4 mg/g，蠶蛹中的含量為2.781 8 mg/g)等。在這2種情況中，蠶蛹和繭殼中的黃酮類化合物含量都表現(xiàn)出明顯的一致性，即繭殼和蠶蛹中均含有較高或較低的黃酮類化合物。但也存在一些家蠶品種資源相比其他家蠶品種資源，蠶蛹中黃酮類化合物的含量較高而繭殼中的含量較低，如皓10R金(♂黃色繭，繭殼中的含量為0.306 9 mg/g，蠶蛹中的含量為3.358 5 mg/g)等;還有一些家蠶品種資源繭殼中黃酮類化合物的含量較高，而蠶蛹中的含量偏低，如 0826(♀黃色繭，繭殼中的含量為1.358 1mg/g，蠶蛹中的含量為2.728 7mg/g)等。

圖9 7533限等3類繭色類型13個家蠶品種資源蠶蛹和繭殼中總黃酮類化合物的含量

2.3 家蠶蛹黃酮類化合物的組成及其鑒定

取7533限、菁松B、大造、0903JGJ、皓42 JH橘、皓12黃 6個家蠶品種資源的蠶蛹，分別按照“1.2.4”項下的“(4)供試樣品溶液的制備”方法制備供試樣品溶液、進樣測定，獲得各供試樣品溶液色譜圖譜(圖10)。

圖10 7533限(A)、菁松B(B)、大造(C)、0903JGJ(D)、皓42JH橘(E)、皓12黃(F)蠶蛹中蘆丁、異槲皮苷、紫云英苷和槲皮素4種黃酮類化合物有效成分HPLC圖

通過HPLC檢測，7533限等6個家蠶品種資源的家蠶蛹的黃酮類化合物中均未檢測到綠原酸，家蠶蛹中蘆丁、異槲皮苷、紫云英苷、槲皮素4種黃酮類化合物的含量檢測匯總結(jié)果如圖11所示:不同繭色類型家蠶品種資源蠶蛹中總黃酮類化合物的含量不同，相同繭色不同家蠶品種資源蠶蛹中黃酮類化合物的種類和含量也存在明顯的差異，綠色繭家蠶品種資源蠶蛹的槲皮素、異槲皮苷的含量，比其他繭色家蠶品種資源蠶蛹的槲皮素、異槲皮苷的含量高，這2種黃酮類化合物可作為綠色繭的標記物;黃色繭家蠶品種資源蠶蛹不含或含有較低的蘆丁。桑葉中含有豐富的綠原酸，家蠶以桑葉為食料，但是家蠶蛹中卻檢測不到綠原酸，說明綠原酸并不能像黃酮類化合物一樣被家蠶修飾吸收。

圖11 HPLC測定家蠶蛹中4種黃酮類化合物的含量

3 討論

天然彩色繭的色素來源于桑葉或蠶體內(nèi)自身合成，無毒無害、色彩自然、色調(diào)柔和，具有天然彩色棉無法比擬的優(yōu)勢，因此近年來絲綢類產(chǎn)品快速興起，家蠶逐漸得到科學(xué)界和工業(yè)界的廣泛關(guān)注和重視［9－11］。也有研究發(fā)現(xiàn)，彩色繭家蠶品種資源中黃酮類化合物的總量普遍高于白色繭，而且黃酮類化合物具有抗氧化、抗過敏、抗炎、抗菌等作用，進而推測彩色繭絲具有這些白色繭絲所沒有的特性［12－14］。在對家蠶繭色的研究中，類胡蘿卜素和類黃酮類化合物被證實與彩色繭的成色機制密切相關(guān)［1］。但是，對蠶蛹中黃酮類化合物的研究還相對較少，蠶蛹中黃酮類化合物的分離研究則更少。本文研究結(jié)果顯示，天然綠色和黃色蠶繭的繭殼與白色蠶繭的繭殼相比，含有較高的黃酮類化合物，但也存在少數(shù)彩色繭的繭殼黃酮類化合物的含量低于部分白色蠶繭的繭殼的現(xiàn)象;絕大部分品種資源蠶蛹中的黃酮類化合物含量都比相同家蠶品種資源蠶繭繭殼的含量高。

目前市場上的黃酮類功能食品琳瑯滿目，如防衰老食品、提高免疫力食品、降脂食品、降壓食品等，產(chǎn)品以液體、固體和半液體等多種形式存在，如桑葉茶、桑葉營養(yǎng)蕎麥面、苦蕎保健茶等［15］。很多研究表明，蠶蛹中鐵、鋅、銅、錳的含量超過牛奶、大豆、豬肝，特別是蠶蛹蛋白中富含鋅、鉀等［16－19］。隨著研究的不斷廣泛和深入，使得蠶蛹作為具有特殊意義的一種熱門食品或食品添加劑的角色而出現(xiàn)在我們的生活中［17］，蠶蛹中功能性活性成分的研究將有助于蠶蛹的深度開發(fā)利用。本文通過對7533限等13個家蠶品種資源的研究發(fā)現(xiàn)，天然彩色繭中綠色繭家蠶品種資源蠶蛹的總黃酮類化合物的含量顯著高于黃色繭和白色繭家蠶蠶蛹，并且不同家蠶品種資源的蠶蛹中黃酮類化合物的含量也存在明顯差異。

通過對7533限等6個不同繭色類型家蠶品種資源蠶蛹中黃酮類化合物蘆丁、異槲皮苷、紫云英苷、槲皮素和綠原酸的含量的檢測，發(fā)現(xiàn)蠶蛹中均不含有綠原酸，并且綠色繭類型家蠶品種資源蠶蛹中槲皮素、異槲皮苷含量也高于其他繭色的蠶蛹。槲皮素在體外對各種自由基的清除作用已被許多實驗所證明［21］，因此可以推測綠色繭家蠶品種資源蠶蛹的營養(yǎng)價值高于其他繭色的蠶蛹，這不僅可用于蠶蛹藥材質(zhì)量控制標準的提高，也可為含蠶蛹的成藥制劑質(zhì)量控制提供參考。但是蠶蛹中黃酮類化合物的種類眾多、成分極其復(fù)雜、含量較低，并具有多種多樣的生物活性［22］;因此，從蠶蛹中提取或分離純化黃酮類化合物具有重要的應(yīng)用前景。

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S881.2

A

1007－0982(2016)02－0022－08

2016－01－29;接受日期:2016－03－22

現(xiàn)代農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系建設(shè)專項(編號CARS－22)。

第1作者信息:劉影俠(1991—)，女，安徽宿州，碩士研究生。E-mail:lyx1534367485@163．com

信息:司馬楊虎，男，教授，碩士生導(dǎo)師。Tel:0512－65880255，E-mail:simyh@suda．edu．cn