陳國妮，孫飛龍，閆亞茹

(西安工程大學環(huán)境與化學工程學院，西安 710048)

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馬齒莧類黃酮提取工藝及抑菌效果的研究

陳國妮，孫飛龍，閆亞茹

(西安工程大學環(huán)境與化學工程學院，西安 710048)

摘要：為了優(yōu)化馬齒莧類黃酮的超聲波提取工藝，利用中心組合(Box-Benhnken)試驗設計原理，采用三因素三水平的響應面分析法，用design expert軟件對其提取工藝參數(shù)進行優(yōu)化；并采用濾紙片法測定其對各菌的抑菌效果。結(jié)果表明：在乙醇濃度75%、超聲時間35min、溫度35℃時，其最佳總黃酮提取量為21.3517mg/g，與理論預測值21.8816mg/g接近，說明響應面法可用于優(yōu)化馬齒莧類黃酮超聲波提取工藝；馬齒莧類黃酮對大腸桿菌和酵母菌有較強的抑制作用，最低抑菌濃度均為0.313mg/mL，對金黃色葡萄球菌的抑制作用最強，最低抑菌濃度為 0.156mg/mL。

關鍵詞：馬齒莧；類黃酮；響應面法；提取工藝 ；抑菌效果

0引言

馬齒莧(Portulaca oleracea L.)為馬齒莧科一年生草本植物，藥食兩用?，F(xiàn)代研究表明，馬齒莧不但含有豐富的營養(yǎng)成分[1]，此外，相關文獻記載還含有多種活性物質(zhì)，包含生物堿、類黃酮(也叫黃酮類化合物)、多糖、甾醇、有機酸、苷類、酚類化合物及油脂等成分[2]。正是馬齒莧所含有的這些較多的活性成分，使其具有多樣的活性功能，尤其是活性成分中的類黃酮，具有較強的抗菌抑菌、抗氧化和抗癌等多種藥效功能，因此有一定開發(fā)利用的必要[3]。

目前，已見報道周燕芳使用超聲波法提取黃皮葉中的黃酮類化合物，結(jié)果顯示與常規(guī)的浸提法相比，超聲波法能縮短處理的時間[4]。但目前的類黃酮提取方法普遍存在提取效率低等的不足，同時，對于相關馬齒莧類黃酮抑菌活性的研究也甚少，所以本文采取超聲輔助醇提取馬齒莧類黃酮的方法，并采用濾紙片法對其抑菌活性等進行研究。

本文采用超聲波提取技術，運用響應面分析方法，探尋其提取馬齒莧類黃酮的最佳工藝。此外，對其抗菌活性功能進行研究，以便為其應用于各種綠色食品、保健食品提供幫助，開發(fā)更安全、高效的天然食品防腐劑，提供理論基礎與技術指導。

1試驗材料與方法

1.1試劑與儀器

馬齒莧采自西安市市郊。無水乙醇、亞硝酸鈉、硝酸鋁、氫氧化鈉、氯化鈉均為分析純。牛肉膏、蛋白胨、瓊脂粉、酵母膏均為生化試劑。大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、酵母菌來源于陜西省微生物研究所。

DGF-1AB型立式電熱鼓風干燥箱(天津市泰斯特儀器有限公司)；XS-04型多功能粉碎機(上海兆申科技有限公司)；752N型紫外可見分光光度計(上海精密科學儀器有限公司)；申科R-205型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器(上海申順生物科技有限公司)；SK5200LH型超聲波清洗器(上海科導超聲儀器有限公司)；SHZ-D(Ⅲ)型循環(huán)水式真空泵(鞏義市英峪予華儀器廠)；HIRAYAMA型高壓蒸汽滅菌鍋(浙江科通儀器有限公司)；PYX-DHS-50×65型隔水電熱恒溫培養(yǎng)箱(上海市躍進醫(yī)療有限公司)。

1.2試驗方法

1.2.1原料的預處理

馬齒莧除去殘根雜質(zhì)，洗凈，自然陰干后置于65℃烘箱中烘干。取出，用多功能粉碎機粉碎，過60目篩成干粉，備用。

1.2.2馬齒莧類黃酮的提取與測定

(1) 馬齒莧類黃酮的提取。稱取馬齒莧干粉1.0g放入250mL錐形瓶中，加入30mL95%乙醇，在室溫下浸泡并搖勻，放到50W的超聲波清洗器超聲30min。用真空泵抽濾處理后的馬齒莧乙醇提取液，濾液用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀濃縮(溫度70℃)，獲得馬齒莧黃酮濃縮液，密封保存[5]。

(2) 類黃酮定性檢測。將提取液點于濾紙片上，置于氨水瓶口，顯微黃色，移開濾紙片數(shù)分鐘后，微黃色又消褪，說明該提取物中含有類黃酮存在[6]。

(3) 馬齒莧總黃酮得率計算。取蘆丁標準品10mg，用70%乙醇定容于10.0mL的容量瓶，配成標準溶液，進行比色測定并繪制標準曲線[7]。移取1.0mL黃酮提取液于10.0mL容量瓶中，加5% 亞硝酸鈉溶液0.4mL，靜置5min，10%硝酸鋁溶液0.4mL，靜置5min，4.2% 氫氧化鈉溶液4.0mL，加蒸餾水標定至刻度，搖勻，放置15min，以不加黃酮的混合溶液作為參比，依次加入樣品液，在波長510nm下測其吸光度，帶入標準曲線方程，計算出總黃酮的濃度，按下式得到總黃酮提取率。測定標準品蘆丁濃度C(g/L)與吸光度A所得標準曲線方程如下：

C=0.0925A+0.0002R2=0.9998

式中Y——總黃酮得率/mg·g-1

C——吸光度A時由標準曲線方程計算出樣品液的質(zhì)量濃度/g·L-1

V——樣品液的體積/mL

m——稱取樣品的質(zhì)量/g

1.2.3響應面法優(yōu)化馬齒莧中總黃酮的提取條件

在單因素試驗的基礎上，采用中心組合Box-Behnken設計方案[8]，設計的因素水平見表1，采用響應面法分析該3因素對自變量總黃酮得率的影響，并優(yōu)化其提取條件。

表1　中心組合Box-Behnken的因素水平表

1.2.4馬齒莧類黃酮抑菌性能的測定

(1) 抑菌活性的測定(濾紙片法)。用移液管吸取0.2mL的各菌懸液，輕輕吹于含有固體培養(yǎng)基的培養(yǎng)皿中，再用無菌涂布棒將菌懸液涂抹均勻。用無菌鑷子夾取充分蘸有黃酮液的無菌濾紙片(直徑6mm)，瀝干后輕輕均勻貼在固體培養(yǎng)基表面，同樣的方法設置空白組作對照(蘸有乙醇溶液的濾紙片)。

然后將各個培養(yǎng)皿放于恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)，觀察抑菌效果，測量各抑菌圈的直徑大小，每組重復測三次求其平均值(單位為mm)。

(2) MIC值的測定。將純化后的馬齒莧黃酮用倍比稀釋法稀釋成不同濃度，分別用1mL無菌移液管移取0.5mL，浸泡滅菌的濾紙片，搖勻，靜置一段時間后，取出置于涂抹各菌懸液的固體培養(yǎng)基上，分散均勻。然后將各皿放在恒溫培養(yǎng)箱，一段時間后取出觀察并測量抑菌圈直徑。無抑菌圈的濃度定則為最低抑菌濃度(MIC)[9]。

2試驗結(jié)果與討論

2.1馬齒莧類黃酮的提取工藝結(jié)果

2.1.1響應面法優(yōu)化馬齒莧總黃酮的提取條件

采用Box-Behnken進行試驗設計，設計及結(jié)果如表2。以乙醇濃度/%(A)、超聲時間/min(B)、溫度℃(C)為自變量，總黃酮得率Y為響應值，采用desinger expert軟件對響應面分析。響應值Y與自變量A、B、C擬合得到響應面的二次方程為：Y(mg/g)=-281.35442+5.41226A+4.61381B+0.41839C-1.8500010-3AB+0.012425AC-6.3065010-3BC-0.03735A2-0.057617B2-0.015266C2。

2.1.2響應面試驗設計及結(jié)果

響應面分析方案及方差分析如表2、表3所示。

表2　響應面分析方案及結(jié)果

表3　回歸模型方差分析及結(jié)果

注：“*”表示P<0.05；“**”表示P<0.01

由表3可知，模型中一次項A為顯著，B極為顯著，二次項B2顯著，C2極為顯著；整體模型的顯著水平P<0.05，表明該模型極顯著。Pred(R2)為0.9376而Adj(R2)是0.8252，說明擬合的模型方程較好，該模型可以用來指導實際實驗。

2.1.3各因素相互作用對總黃酮得率的影響

乙醇濃度/%(A)、超聲時間/min(B)、溫度℃(C)三因素對提取率(Y)的響應面圖，見圖1。

從響應面3D圖的最高點和等值線可以看出，有極值存在于所選范圍內(nèi)，是響應面的最高點，也是等值線最小橢圓的中心點；從響應面圖的陡勢可直觀看出，乙醇濃度與溫度相互作用的曲面變化顯著，即對總黃酮得率影響最大。

2.1.4條件優(yōu)化與驗證

通過design expert軟件得到的最優(yōu)提取工藝條件為：乙醇濃度77.82%、超聲時間36.72min、溫度37.79℃，理論得率為21.8816mg/g。不足之處在于所測的馬齒莧黃酮提取率較高，分析原因是本試驗采用乙醇為提取劑，乙醇的極性大，把葉綠素等成分提取了出來，這就造成所測吸光值較大，因此計算出的馬齒莧總黃酮得率偏大。

2.1.5最佳提取工藝確定

通過design expert軟件得到實際最佳提取工藝條件：乙醇濃度75%、超聲時間35min、溫度35℃，試驗所得結(jié)果為21.3517mg/g，實際得率與理論得率相誤差為2.48%，二者較為接近。

2.2馬齒莧類黃酮的抑菌效果

2.2.1馬齒莧類黃酮的抑菌活性

由表4結(jié)合圖2、3、4可知，馬齒莧黃酮對大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、酵母菌等均有一定的抑制作用，濃度越高，其抑菌效果越明顯，其中對金黃色葡萄球菌的抑菌效果最明顯。馬齒莧黃酮對大腸桿菌和酵母菌有較強的抑制作用，最低抑菌濃度均為0.313mg/mL；對金黃色葡萄球菌的抑制作用最強，最低抑菌濃度為 0.156mg/mL。完全沒有抑菌圈的最低樣品濃度為最低抑菌濃度(MIC)。

2.2.2最低抑菌濃度的測定結(jié)果

表4　馬齒莧黃酮類化合最小抑菌濃度(MIC)

3結(jié)論

(1) 本文采用超聲波輔助醇提取馬齒莧類黃酮，與秦學會等的超聲波水提馬齒莧類黃酮得率8.24 mg/g相比較，黃酮得率有所提高[10]。該方法具有高效、快捷、低耗能，對提取物活性成分影響小等特點。

(2) 文中所選的響應面優(yōu)化手段較于其他方法：具有可研究多因素間的交互作用，試驗次數(shù)少、周期短，所求得回歸方程精度高，分析結(jié)果更加清晰直觀等優(yōu)點，為天然活性物質(zhì)的提取提供一定的參考與指導作用，實用性較高。

(3) 在3個單因素試驗基礎上，以總黃酮得率為響應值，運用響應面分析法得到最優(yōu)提取工藝條件為：乙醇濃度75%，超聲時間35min，溫度35℃。

(4) 馬齒莧黃酮對大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、酵母菌等均有一定的抑制作用，對大腸桿菌和酵母菌有較強的抑制作用，最低抑菌濃度均為0.313mg/mL；對金黃色葡萄球菌的抑制作用最強，最低抑菌濃度為 0.156mg/mL。

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Study on Extraction Process of Flavonoids from Purslane and Their Antibacterial Effect

CHEN Guo-ni，SUN Fei-long，YAN Ya-ru

(School of Environmental & Chemical Engineering，Xi’an Polytechnic University，Xi’an 710048,China)

Abstract:In order to optimize the ultrasonic assisted extraction process of flavonoids from purslane，the response surface methodology with three factors and three levels was used according to the principles of central composite design (Box-Benhnken).The optimum extraction process parameters were obtained by the software of design expert; The bacteriostatic effect of flavonoids from purslane against E.coli，Staphylococcus aureus and saccharomycetes were measured using filter-paper method，as follows: the ethanol volume fraction was 75%，the extracting time was 35min，and the tempreture was 35℃.Under these conditions，the value of flavone extraction yield was21.3517 mg/g approximating to the predicted value 21.8816 mg/g.The results indicated that the response surface methodology could be used to optimize the ultrasonic assisted extraction process of flavonoids from purslane; E.coli，Saccharomycetes were inhibited by the flavonoids from purslane，the MIC was 0.313mg/mL，and Staphylococcus aureus was strongly inhibited，the MIC was 0.156mg/mL.

Key words:purslane; flavonoids; response surface methodology; extraction process; antibacterial effect

doi:10.3969/j.issn.1005-1295.2016.01.002

中圖分類號：TS201.2

文獻標志碼:A

文章編號：1005-1295(2016)01-0006-05

作者簡介：陳國妮( 1989-)，女，碩士，研究方向為天然活性物質(zhì)的提取。通信作者： 孫飛龍(1975-)，男，博士，副教授，研究方向為天然活性物質(zhì)的提取，

通信地址：710048 陜西西安市碑林區(qū)金花南路19號 西安工程大學環(huán)境與化學工程學院，E-mail: sunfeilong@xpu.edu.cn。

基金項目：陜西省教育廳科研計劃項目資助(15JK1315)；西安工程大學博士科研啟動項目(BS1011)

收稿日期：2015-07-30;修稿日期： 2015-08-24