翟嵩 孫明珠 王文俊 李亞萍 張欣 李梅黨 雙鎖

?

pEGFP-prohibitin真核表達重組質(zhì)粒的構(gòu)建及其在人肝癌細胞系Hep G2中的表達

翟嵩 孫明珠 王文俊 李亞萍 張欣 李梅黨 雙鎖

【摘要】目的 構(gòu)建pEGFP-prohibitin真核表達質(zhì)粒，并鑒定其在pEGFP-prohibitin轉(zhuǎn)染的人肝癌細胞系Hep G2中的表達。方法 采用高保真PCR擴增獲得prohibitin的全長編碼序列，構(gòu)建真核表達載體pEGFP-prohibitin，并通過基因測序和BLAST比對鑒定重組質(zhì)粒；提取pEGFP-prohibitin和pEGFP-N1質(zhì)粒，并通過TurboFect轉(zhuǎn)染試劑轉(zhuǎn)染Hep G2細胞；采用實時PCR和Western印跡方法分別在MRNA水平和蛋白質(zhì)水平檢測prohibitin蛋白在轉(zhuǎn)染后Hep G2細胞中的表達。結(jié)果 成功構(gòu)建pEGFP-prohibitin真核表達重組質(zhì)粒，并將其成功轉(zhuǎn)染Hep G2細胞；pEGFP-prohibitin轉(zhuǎn)染組細胞prohibitin的表達量比空載轉(zhuǎn)染組和未轉(zhuǎn)染組細胞明顯增加。結(jié)論 成功構(gòu)建真核表達載體pEGFP-prohibitin，并證明抗增殖蛋白prohibitin在pEGFP-prohibitin轉(zhuǎn)染人肝癌細胞系Hep G2中高表達。

【關(guān)鍵詞】prohibitin蛋白；基因表達；重組質(zhì)粒；轉(zhuǎn)染

抗增殖蛋白prohibitin屬于細胞膜蛋白超家族，是一種正常人體細胞內(nèi)廣泛存在的多功能蛋白［1］，在物種間高度保守［2］。prohibitin為線粒體分子伴侶蛋白，有利于維持線粒體的形態(tài)和功能，異常表達可引起線粒體損傷，從而可能啟動細胞內(nèi)源性凋亡［3］。近年來研究發(fā)現(xiàn)，prohibitin與多種疾病的發(fā)生發(fā)展有著密切的關(guān)系，尤其是在肝臟疾病的發(fā)生發(fā)展中起關(guān)鍵作用［4］。應(yīng)用蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)研究發(fā)現(xiàn)，prohibitin在 HCB體外細胞培養(yǎng)系統(tǒng)表達上調(diào)［5］。通過對其功能的研究將有助于進一步認識肝臟疾病的發(fā)生機制，從而為臨床治療提供一個新的靶點。但到目前為止，prohibitin高表達對于HCV所導(dǎo)致的肝細胞凋亡中所發(fā)揮的生物學(xué)影響及其具體作用機制尚不清楚，本研究為了進一步探討prohibitin高表達的生物學(xué)效應(yīng)，構(gòu)建了真核表達重組系統(tǒng)，并對pEGFP-prohibitin轉(zhuǎn)染人肝癌細胞系Hep G2中高表達進行鑒定，為進一步的生物學(xué)功能研究提供依據(jù)。

材料和方法

一、材料

人肝癌細胞系Hep G2由西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院生化教研室保存。真核表達質(zhì)粒pEGFP-N1購自美國BDBiosciences Clontech公司；Top 10化學(xué)感受態(tài)細胞購自德國Qiagen公司；限制性內(nèi)切酶HindIII、限制性內(nèi)切酶KpnI、DNA連接試劑盒、反轉(zhuǎn)錄第一鏈cDNA合成試劑盒、SYBR○RPremix Ex TaqTMII、電泳用瓊脂糖均購自日本Ta KaRa公司；高保真PCR試劑盒、TurboFect Transfection Reagent購自美國Therm o公司；HRP標記的羊抗兔Ig G抗體、兔抗人prohibitin多克隆抗體、兔抗人GAPDH多克隆抗體購自美國Santa公司。

二、細胞培養(yǎng)

人肝癌細胞系Hep G2細胞使用含10％胎牛血清的DMEM高糖細胞培養(yǎng)基，置于37℃、體積分數(shù)為0.05的CO2細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，嚴格無菌操作，每天換液1次。電子顯微鏡下觀察細胞密度達到80％以上時即可進行細胞傳代，嚴格按照細胞培養(yǎng)傳代方法，2～3 d按1∶1比例傳代1次。

三、細胞總RNA提取

第一鏈cDNA反轉(zhuǎn)錄合成及prohibitin基因全長編碼序列擴增具體實驗方法參考文獻［6］；按照瓊脂糖凝膠DNA純化回收試劑盒說明進行目的DNA片段的純化和回收?；厥盏腄NA片段，紫外分光光度儀測定濃度后，-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

四、pEGFP-prohibitin真核表達重組質(zhì)粒的構(gòu)建

選取含有CMV啟動子的pEGFP-N1質(zhì)粒載體及其多克隆位點，根據(jù)Omega去內(nèi)毒素質(zhì)粒中提試劑盒說明進行pEGFP-N1質(zhì)粒抽提，抽提好的質(zhì)粒-20℃保存?zhèn)溆谩?yīng)用限制性內(nèi)切酶HindIII和KpnI分別消化純化回收的目的基因片段，應(yīng)用限制性內(nèi)切酶HindIII和KpnI消化pEGFP-N1質(zhì)粒；根據(jù)DNA連接試劑盒說明，將雙酶切后的pEGFP-N1與prohibitin片段連接，使之成為重組質(zhì)粒pEGFP-prohibitin。連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化Top10感受態(tài)細胞，轉(zhuǎn)化的菌液涂布于具有卡那霉素抗性的LB平板培養(yǎng)基，37℃倒置過夜培養(yǎng)。經(jīng)卡那霉素抗性篩選出陽性菌落，挑取5個菌落分別接種于卡那霉素陽性的LB液體培養(yǎng)基中，37℃振蕩過夜，提取質(zhì)粒，方法同前。

五、PCR鑒定重組質(zhì)粒pEGFP-prohibitin

將重組質(zhì)粒pEGFP-prohibitin進行PCR，PCR產(chǎn)物進行瓊脂糖凝膠電泳觀察能否擴增得到約819 bp的目的DNA，以此鑒定prohibitin基因片段是否插入pEGFP-N1載體，是否與pEGFP-N1載體成功連接。將PCR鑒定為陽性的克隆送北京天根生化科技有限公司測序，通過NCBI數(shù)據(jù)庫在線軟件BLAST將測序結(jié)果進行序列一致性比對。細胞轉(zhuǎn)染具體方法見參考文獻［7-9］。

六、實時PCR檢測prohibitin MRNA

使用SYBR○RPremix Ex TaqTMII試劑在Bio-Rad iQ5實時PCR儀上進行。引物由Ta KaRa公司合成（PAGE級），prohibitin：上游5′-AAACAGGTGGCTCAGCAGGAA-3′，下游5′-CAGTGAGTTGGCAATCAGCTCAG-3′。GAPDH：上游5′-GCACCGTCAAGGCTGAGAAC-3′，下游5′-TGGTGAAGACGCAGTGGA-3′。反應(yīng)體系25μL：2×SYBR○R

Premix 12.5μL，上下游引物各1μL，模板cDNA1μL，dd H2O9.5μL。反應(yīng)條件：95℃5 s；95℃30 s，60℃30 s，72℃10 s，50個循環(huán)；72℃10 s。結(jié)果由Bio-Rad iQ5軟件分析，通過2-△△Ct計算抗增殖蛋白基因的相對差異表達倍數(shù)。

七、Western印跡檢測prohibitin蛋白的表達

棄去轉(zhuǎn)染pEGFP-prohibitin、pEGFP-N1空載質(zhì)粒48 h后及對照未轉(zhuǎn)染空白細胞培養(yǎng)液，用預(yù)冷PBS洗兩遍，加入RIPA裂解液，冰上裂解30 min，收集細胞到EP管中。4℃12 000 r/min離心15 min，收集上清液。按照BCA蛋白濃度測定試劑盒進行蛋白定量，進行SDS-PAGE凝膠電泳。電轉(zhuǎn)移至PVDF膜，Western印跡檢測prohibitin，一抗為兔抗人prohibitin多克隆抗體（1∶1 000稀釋），二抗為HRP標記的羊抗兔Ig G（1∶200）。ECL顯色，曝光X線片。GAPDH的檢測：一抗為兔抗人GAPDH多克隆抗體，二抗為HRP標記的羊抗兔Ig G（1∶200）。使用Syngene凝膠圖像分析系統(tǒng)對Western印跡圖像進行分析，得到條帶的灰度值。將各組細胞prohibitin與內(nèi)參GAPDH表達水平灰度值比進行比較［5，6］。

八、統(tǒng)計方法

采用SPSS16.0統(tǒng)計軟件分析，數(shù)據(jù)多組均數(shù)比較利用單因素方差分析ANOVA，兩組比較使用t檢驗，P＜0.05表示差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié)　果

一、pEGFP-prohibitin質(zhì)粒的構(gòu)建及鑒定

（一）prohibitin全長CDS的擴增 如圖1所示，經(jīng)高保真PCR得到約819 bp的prohibitin基因片段，與預(yù)期結(jié)果一致。

圖1　prohibitin高保真PCR產(chǎn)物和雙酶切pEGFP-N1產(chǎn)物電泳圖

（二）pEGFP-prohibitin重組質(zhì)粒的構(gòu)建HindIII和KpnI雙酶切pEGFP-N1質(zhì)粒，獲得一條約4.7 kb的線性質(zhì)粒條帶，此結(jié)果與預(yù)期結(jié)果相一致。圖2顯示質(zhì)粒PCR鑒定結(jié)果，以pEGFP-prohibitin為模板擴增prohibitin，得到約819 bp的片段，結(jié)果與預(yù)期一致。經(jīng)BLAST比對分析pEGFP-prohibitin測序結(jié)果顯示與prohibitin（NM_002634.2）完全相同，插入片段為prohibitin基因，插入方向正確，讀碼框無移位。

圖2　質(zhì)粒PCR電泳圖

（三）pEGFP-prohibitin和pEGFP-N1質(zhì)粒的中量提取 使用Omega去內(nèi)毒素質(zhì)粒中量提取試劑盒抽提pEGFP-prohibitin和pEGFP-N1質(zhì)粒。經(jīng)紫外分光光度儀檢測，pEGFP-prohibitin質(zhì)粒濃度為125.6μg/ML，A260/A280比值是1.95。pEGFP-N1質(zhì)粒濃度是199.6μg/ML，A260/A280比值是1.97。說明抽提的質(zhì)粒質(zhì)量比較好，可用于后續(xù)實驗。

二、prohibitin蛋白在轉(zhuǎn)染細胞中高表達的鑒定

（一）倒置熒光顯微鏡觀察 轉(zhuǎn)染24 h后，倒置熒光顯微鏡下觀察，pEGFP-prohibitin轉(zhuǎn)染組和pEGFP-N1空載轉(zhuǎn)染組細胞中都可以觀察到明亮的綠色熒光，但是未轉(zhuǎn)染空白對照組沒有觀察到明亮的綠色熒光（圖3）。而且熒光的強度在轉(zhuǎn)染后24 h可達到最強度，此后隨著時間的推移緩慢地減弱。

圖3　轉(zhuǎn)染后24 h三組細胞熒光顯微鏡及對應(yīng)的光鏡觀察結(jié)果（HE，×40）

（二）實時PCR檢測prohibitin MRNA在三組細胞中的表達 prohibitin MRNA的相對表達量用2-△△Ct值表示。轉(zhuǎn)染組細胞prohibitin MRNA表達量是未轉(zhuǎn)染組的5.715倍、空載轉(zhuǎn)染組的2.460倍。用單因素方差分析及兩兩比較對三組細胞prohibitin MRNA表達量進行分析，pEGFP-prohibitin轉(zhuǎn)染組prohibitin MRNA表達量明顯高于另外兩組（P＜0.05），這說明通過轉(zhuǎn)染pEGFP-prohibitin真核表達重組質(zhì)粒，prohibitin MRNA發(fā)生了表達上調(diào)。但是空載轉(zhuǎn)染對照組以及未轉(zhuǎn)染對照組細胞prohibitin MRNA表達差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。

三、Western印跡檢測三組細胞內(nèi)prohibitin蛋白表達差異情況

使用Western印跡方法檢測48 h后轉(zhuǎn)染組、空載轉(zhuǎn)染組和未轉(zhuǎn)染對照組三組細胞中的prohibitin表達情況（圖4）。細胞中prohibitin與內(nèi)參GAPDH條帶的灰度，兩者灰度值的比值反映了prohibitin蛋白的表達變化情況?；叶确治鲲@示，pEGFP-prohibitin轉(zhuǎn)染組細胞prohibitin/GAPDH灰度值比是0.952±0. 080，pEGFP-N1轉(zhuǎn)染組細胞prohibitin/GAPDH灰度值比是0.429±0.070，未轉(zhuǎn)染對照組細胞prohibitin/ GAPDH灰度值比是0.309±0.045。pEGFP-prohibitin轉(zhuǎn)染組細胞prohibitin/GAPDH灰度值比分別是空載轉(zhuǎn)染組的2.219倍和未轉(zhuǎn)染組的3.081倍。三組細胞中的prohibitin蛋白表達差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01），轉(zhuǎn)染組明顯高于空載轉(zhuǎn)染組和未轉(zhuǎn)染組，但是空載轉(zhuǎn)染組和未轉(zhuǎn)染組之間不具有顯著性差異。上面實驗結(jié)果表明，將pEGFP-prohibitin真核表達重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染進入Hep G2細胞中后，與對照組細胞相較，prohibitin發(fā)生了表達上調(diào)。

圖4　Western印跡檢測三組細胞內(nèi)prohibitin蛋白表達情況

討　論

蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)的應(yīng)用使一系列新蛋白質(zhì)被發(fā)現(xiàn)，蛋白質(zhì)是機體生物功能的主要承擔者，任何疾病發(fā)生發(fā)展過程中表達異常的蛋白一定與致病機制存在著某種聯(lián)系。因此，尋找表達異常的蛋白并研究其功能是探索致病機制的可行思路［10］。目前丙型肝炎的檢出率逐年升高，而尚無有效疫苗能夠預(yù)防HCV傳播，現(xiàn)行的丙型肝炎的治療方法仍然具有一定的局限，因此對其致病機制的研究及探尋新的治療藥物或方法是目前亟待解決的問題，加強對HCV感染后機體異常表達蛋白的研究則是揭示HCV感染與肝細胞相互之間作用機制的重要途徑［11-13］。運用蛋白組學(xué)方法篩選HCV感染中表達異常的蛋白則是循此思路探索HCV致病機制的重要環(huán)節(jié)［14-16］。

prohibitin是一種高度保守的蛋白質(zhì)，廣泛分布于細菌、酵母、原蟲、植物和哺乳動物等真核生物細胞中，具有高度的同源性［2］。人prohibitin基因位于染色體17q21，相對分子質(zhì)量為32×103的prohibitin蛋白［17］。越來越多的研究發(fā)現(xiàn)prohibitin在許多腫瘤細胞中表達增強，因此推測prohibitin可能與腫瘤的發(fā)生發(fā)展有著密切的關(guān)系［6］，但是prohibitin高表達在肝臟疾病發(fā)病機制方面所發(fā)揮的作用尚不清楚［18］。

為了進一步闡明prohibitin的功能，詮釋prohibitin表達上調(diào)在肝細胞損傷中所發(fā)揮的作用，本研究運用高保真PCR擴增獲得prohibitin的全長編碼序列，并將其插入pEGFP-N1質(zhì)粒多克隆位點，構(gòu)建出讀碼框無移位和序列正確的真核表達載體pEGFP-prohibitin。使用去內(nèi)毒素質(zhì)粒抽提試劑盒提取pEGFP-prohibitin和pEGFP-N1質(zhì)粒，通過TurboFect轉(zhuǎn)染試劑轉(zhuǎn)染Hep G2細胞，通過多次實驗摸索優(yōu)化條件，得到最佳轉(zhuǎn)染效率。進一步利用倒置熒光顯微鏡觀察prohibitin在Hep G2細胞中的表達，通過實時PCR和Western印跡分別在MRNA水平和蛋白質(zhì)水平檢測prohibitin蛋白的表達情況。實驗結(jié)果表明，pEGFP-prohibitin真核表達重組質(zhì)粒成功轉(zhuǎn)染Hep G2細胞，pEGFP-prohibitin轉(zhuǎn)染組細胞prohibitin的表達量比空載轉(zhuǎn)染組和未轉(zhuǎn)染組細胞發(fā)生了明顯增加，prohibitin在轉(zhuǎn)染的Hep G2細胞中過表達，為進一步研究prohibitin高表達的生物學(xué)效應(yīng)提供了基礎(chǔ)，為了解肝臟疾病發(fā)病機制和基因治療HCV感染提供基礎(chǔ)實驗資料和依據(jù)。

參 考 文 獻

1 彭琳，黃裔騰，許鎰洧，等. Prohibitin與乳腺癌.癌變·畸變·突變，2012，1：75-77.

2 Tsutsu mi T，Matsuda M，Aizaki H，et al. Proteo mics analysis of mitochondrial proteins reveals overexpression of a mitochondrial protein chaperon，PHB，in cells expressing hepatitis Cvirus core protein. Hepatology，2009，50：378-386.

3 Rizwani W，Alexandrow M，Chellappan S. Prohibitin physically interacts with MCMproteins and inhibits ma Mmalian DNAreplication. Cell Cycle，2009，8：1621-1629.

4 McClung JK，Danner DB，Stewart DA，et al.Isolation of a cDNAthat hybrid selects antiproliferative MRNAfro Mratliver. Biochem Biophys Res comMun，1989，164：1316-1322.

5 Dang SS，Sun MZ，Yang E，et al. Prohibitin is overexpressed in Huh-7-HCVand Huh-7. 5-HCVcells harboring in vitro transcribed full-length hepatitis Cvirus RNA. Virol J，2011，8：424.

6 黨雙鎖，孫明珠，尋萌，等.抑制素在人肝癌細胞SMMC-7721和Huh-7中的表達及其編碼序列擴增.中國肝臟病雜志，2010，2：1-5.

7 徐濤，彭云云，李琳，等.pEGFP-C2 -NLRC5重組質(zhì)粒的構(gòu)建及其表達.安徽醫(yī)科大學(xué)學(xué)報，2014，49：5-8.

8 郭靜雅，陳昌友，王志強，等.人CXCR3 B基因轉(zhuǎn)染細胞株的構(gòu)建、鑒定及生物學(xué)功能研究.細胞與分子免疫學(xué)雜志，2011，27：1288-1294.

9 任麗偉，丁愛軍，徐貴江，等.提高基因轉(zhuǎn)染效率方法的研究.中國畜牧獸醫(yī)，2010，5：82-84.

10 Dia Mond DL，Proll SC，Jacobs JM，et al. HepatoProteo mics：applying proteo mic technologies to the study of liver function and disease. Hepatology，2006，44：299-308.

11 Bigger CB，Guerra B，Brasky KM，et al. Intrahepatic gene expression during chronic hepatitis Cvirus infection in chim panzees.JVirol，2004，78：13779-13792.

12 趙四海，尋萌，楚雍烈，等.丙型肝炎病毒全基因組培養(yǎng)細胞中轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)基因的差異表達.浙江大學(xué)學(xué)報（醫(yī)學(xué)版），2008，37：164-169.

13 Gao X，Zheng J，Beretta L，et al. The 2009 hu man liver proteo me project（HLPP）workshop. Proteo mics，2010，10：3058-3061.

14 張學(xué)群，姜穎，厲有名，等.蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)在非酒精性脂肪肝研究中的應(yīng)用.中華肝臟病雜志，2006，14：798-800.

15 劉艷麗，閆巖，白文濤，等.HCV核心蛋白在Hep G2細胞中對COX-2表達的影響.細胞與分子免疫學(xué)雜志，2006，22：343-345.

16 王文勇，張志培，黃立軍，等.丙型肝炎病毒核心蛋白對突變p53 和Bcl-2表達的影響及意義.中華肝臟病雜志，2005，13：148-149.

17 Sato T，Saito H，Swensen J，et al. The hu man prohibitin gene located on chro Moso me 17q21 is Mutated in sporadic breaset cancer. Cancer Res，1992，52：1643-1646.

18 孫明珠，黨雙鎖.抗增殖蛋白在肝臟疾病中的研究進展.中國肝臟病雜志，2011，3：61-64.

（本文編輯：錢燕）

Establish ment and expression of recom binant pEGFP-prohibitin plasmid in HepG2 cell line

ZHAISong，SUNMing-zhu，WANGWen-jun，LIYa-ping，ZHANGXin，LIMei，DANGShuang-suo. Department of infectious diseases，thesecond affiliated hospital of medicalschool of Xi’an Jiaotong University，Xi’an 710004，China

【Abstract】Objective To construct eukaryotic expression plasmid of enhanced green fluorescent protein plasmids （pEGFP）prohibitin，and to observe its expression in transfected Hep G2 cells. Methods The full coding sequence of prohibitin was am plified by high fidelity poly merase chain reaction（PCR）. Mean w hile，the eukaryotic expression vector of pEGFP-prohibitin was constructed and identified by gene sequencing and basic local align ment search tool（BLAST）. Plasmids of pEGFP-prohibitin and pEGFP-N1 were extracted and transfected into Hep G2 cells by TurboFect oligofectamine reagent，expression of w hich in transfected Hep G2 cells was assessed by real time PCRat MRNAlevel and western blot at protein level. Results Recombinant pEGFP-prohibitin plasmid was successfully constructed then transfected into Hep G2 cells，prohibitin expression in w hich was apparently higher than that in Mock-vehicle and non-transfection groups. Conclusion The eukaryotic expression vector of pEGFP-prohibitin was constructed successfully，and prohibitin was confirmed to be up-regulated in Hep G2/pEGFP-prohibitin cells.

【Key words】Prohibitin；Gene expression；Recombinant plasmid；Transfection

收稿日期：（2015-07-07）

Corresponding author：DANGShuang-suo，Email：dang212@126.com

通信作者：黨雙鎖，Email：dang212@126.com

基金項目：國家自然科學(xué)基金資助項目（81170393）

作者單位：710004 西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院第二附屬醫(yī)院感染科