隆林　范紅梅　周麗

【摘 要】 目的：建立興仁金線蓮HPLC指紋圖譜。方法：采用Phenomenex C18 （4.6mm×250mm，5μm）；流動(dòng)相：乙腈（A）-0.4%磷酸水溶液（B）梯度洗脫程；流速：1.0ml/min；檢測(cè)波長(zhǎng)：327nm；柱溫：30℃。運(yùn)用中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)軟件（2004A版）進(jìn)行指紋圖譜分析。結(jié)果：分別優(yōu)化了檢測(cè)波長(zhǎng)、流動(dòng)相以及HPLC色譜梯度洗脫條件，標(biāo)定了20個(gè)共有指紋特征峰，確定了以槲皮素、山柰素和異鼠李素3個(gè)化合物，建立了12個(gè)不同批次的興仁金線蓮HPLC指紋圖譜，相似度較高。結(jié)論：該方法方法學(xué)考察符合指紋圖譜技術(shù)要求，為興仁金線蓮質(zhì)量控制提供依據(jù)。

【關(guān)鍵詞】 興仁金線蓮；指紋圖譜；槲皮素；山柰素；異鼠李素；高效液相色譜法

【中圖分類號(hào)】R284.1 【文獻(xiàn)標(biāo)志碼】 A 【文章編號(hào)】1007-8517（2016）04-0040-05

Abstract：Objective To establish a HPLC fingerprint of Anoectochilus xingrensis. Methods The chromatographic separation was performed on a Phenomenex C18 column （4.6×250mm， 5μm）， mobile phase was acetonitrile-0.4%phosphoric acid. and the separation process was carried out using a gradient elution， the corresponding concentration gradient of acetonitrilewhich was based on a mobile phase of the mixture solution with acetonitrile （A） - 0.4% phosphoric acid （B） at the flow rate of 1.0 mL/min. The detection wavelength was 327nm， and the column temperature was 30℃. The chromatographic fingerprints were analyzed with the similarity evaluation system for chromatographic fingerprint of TCM （2004A edition）. Results Totally 20 common fingerprint peaks and 3 constituents including quercetin， kaempferide and isorhamnetin were identified after optimization of the detection wavelength， mobile phase and HPLC chromatography gradient elution conditions. Furthermore， the similarity of HPLC fingerprints of 12 different batches of Anoectochilus xingrensis was high.Conclusion The present methodology meets the technical raquirements of fingerprint and could be a basis for the intrinsic quality control standard for Anoectochilus xingrensis.

Keywords：Anoectochilus Xingrensis；Fingerprint；Quercetin；Kaempferide；Isorhamnetin；HPLC

興仁金線蓮（Anoectochilus xingrensis Z.H.Tsi et X.H.Jin）是吉占和、金效華等在貴州興仁等地發(fā)現(xiàn)并命名的新種[1]，為蘭科（Orchidaceae）開唇蘭屬多年生草本植物。該植物民間用于冶療高血壓、高血脂、糖尿病、腫瘤、肺結(jié)核咳血、重癥肌無(wú)力、肝炎、腎炎、小兒急驚風(fēng)、風(fēng)濕性及類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、婦女白帶以及毒蛇蛟傷等癥，素有“藥王”、“金草”、“神草”、“烏人參”等美稱，全草入藥。

興仁金線蓮主要分布于貴州省黔西南州，其植株比其他金線蓮大，產(chǎn)量高，資源非常豐富，屬于地產(chǎn)藥材。近年來(lái)，人們對(duì)藥食同源有了更近一步的理解，興仁金線蓮開始出現(xiàn)在高擋及野味餐館的桌面上。目前，對(duì)興仁金線蓮的鑒別僅局限于植物形態(tài)上，全憑經(jīng)驗(yàn)，極難區(qū)分。鑒于其具有較高的藥用價(jià)值及經(jīng)濟(jì)價(jià)值，研究應(yīng)用HLPC法，建立指紋圖譜，為興仁金線蓮的資源開發(fā)及質(zhì)量評(píng)價(jià)提供參考。

1 儀器與材料

1.1 儀器 LC-20AD高效液相色譜儀（含LC-20AD二元泵、CTO-10AS柱溫箱、SPD-M20A檢測(cè)器）；日本島津AUY220電子天平（萬(wàn)分之一）；賽多利斯CPA2250電子天平（十萬(wàn)分之一）；電熱恒溫干燥箱（上海博訊實(shí)驗(yàn)有限公式醫(yī)療設(shè)備）；數(shù)顯恒溫水浴鍋（江蘇金壇市中大儀器廠）。

1.2 試劑試藥 槲皮素（批號(hào)：100081-200907）、山柰素（批號(hào)：110861-200606）、異鼠李素（批號(hào)：110860-201109）均由中國(guó)藥品生物制品檢定所提供。興仁金線蓮由興義師范學(xué)院周麗副教授提供，由中國(guó)科學(xué)院昆明植物研究所彭華研究員鑒定。乙腈為色譜純，水為超純水，其余試劑均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件 色譜柱：Phenomenex C18 （4.6×250mm，5μm）；流動(dòng)相：乙腈（A）-0.4%磷酸水溶液（B）；梯度洗脫程序：0→5→10→30→45→70→80→85min，乙腈（A）對(duì)應(yīng)的濃度梯度5%→10%→20%→25%→30%→40%→5%→5%；流速：1.0ml/min；柱溫：30℃；進(jìn)樣量：10uL；檢測(cè)波長(zhǎng)：327nm。

2.2 對(duì)照品溶液的制備 精密稱取槲皮素10.39mg，加甲醇定容至100ml量瓶中，取3ml于同一25ml量瓶中； 精密稱取山柰素8.58mg，加甲醇定容至50ml量瓶中，取1ml于同一25ml量瓶中；精密稱取異鼠李素8.58mg，加甲醇定容至100ml量瓶中，取5ml于同一25ml量瓶中，加甲醇制成混合對(duì)照品液。

2.3 供試品溶液的制備 取興仁金線蓮藥材粉末2.5g，精密稱定，精密加入5%鹽酸乙醇溶液50ml，稱定重量，水浴回流4h，取出，放冷，用乙醇補(bǔ)足減失的重量，濾過(guò)，取續(xù)濾液即得。

2.4 精密度試驗(yàn) 取“2.3”項(xiàng)下制備的S4供試品溶液，連續(xù)進(jìn)樣6次，記錄指紋圖譜，以槲皮素、山柰素和異鼠李素為參照峰，分別對(duì)共有峰的相對(duì)保留時(shí)間和相對(duì)峰面積進(jìn)行考察，各共有峰相對(duì)保留時(shí)間和相對(duì)峰面積的RSD值均小于3%。表明儀器的精密度良好。

2.5 穩(wěn)定性考察 取“2.3”項(xiàng)下制備的S4供試品溶液，分別于0、8、16、24、32、48h進(jìn)樣分析，記錄指紋圖譜，以槲皮素、山柰素和異鼠李素為參照峰，考察共有峰的相對(duì)保留時(shí)間和相對(duì)峰面積。結(jié)果表明，各共有峰相對(duì)保留時(shí)間和相對(duì)峰面積的RSD值均小于3%，表明供試品溶液在48h內(nèi)穩(wěn)定。

2.6 重復(fù)性試驗(yàn) 精密稱取同一批興仁金線蓮粉末（S4）5份，按“2.3”項(xiàng)操作，制備5份供試品溶液，按“2.1”項(xiàng)色譜條件測(cè)定，記錄指紋圖譜，以槲皮素、山柰素和異鼠李素為參照峰，考察共有峰的相對(duì)保留時(shí)間和相對(duì)峰面積。結(jié)果表明，各共有峰相對(duì)保留時(shí)間和相對(duì)峰面積的RSD值小于3.0%，表明該方法重復(fù)性良好。

2.7 指紋圖譜建立與分析

2.7.1 對(duì)照試驗(yàn) 取“2.2”項(xiàng)下方法制備的混合對(duì)照品溶液10ul，注入高效液相色譜儀，記錄色譜圖，見圖1。

2.7.2 指紋圖譜的建立 分別稱取12個(gè)批次的興仁金線蓮粉末，按“2.3”項(xiàng)操作，平行制備供試品溶液，取供試品溶液按“2.1”項(xiàng)方法進(jìn)行分析，記錄圖譜。對(duì)保留時(shí)間8～80min的色譜峰進(jìn)行分析，均有20個(gè)穩(wěn)定的特征峰，確定其為共有指紋峰，S4的HPLC圖譜見圖2，12批興仁金線蓮HPLC指紋圖譜共有模式圖及對(duì)照?qǐng)D譜見圖3。

2.7.3 共有峰相對(duì)保留時(shí)間和相對(duì)峰面積的測(cè)定 在前期研究的基礎(chǔ)上[1]，選定含量較穩(wěn)定、重復(fù)性好的槲皮素、山柰素和異鼠李素等作為參照峰，計(jì)算各峰的保留時(shí)間和相對(duì)峰面積，結(jié)果見表1。

2.7.4 指紋圖譜相似度計(jì)算 采用中國(guó)藥典委員會(huì)“中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)2004A版”軟件，將12批次興仁金線蓮指紋圖譜導(dǎo)入，以S4號(hào)作為相似度計(jì)算時(shí)校正的參照?qǐng)D譜，以平均數(shù)法生成參照?qǐng)D譜。由于采用梯度洗脫的方式及實(shí)驗(yàn)中不可避免因素的影響，各批次供試品指紋圖譜中色譜峰保留時(shí)間產(chǎn)生一定遷移，因而不采用自動(dòng)校正的方式，而是通過(guò)多點(diǎn)校正法對(duì)色譜峰保留時(shí)間進(jìn)行校正，選擇包含槲皮素、山柰素和異鼠李素在內(nèi)的共20個(gè)共有峰作為校正的Mark峰，最終生成12批次興仁金線蓮的指紋圖譜。計(jì)算各批次興仁金線蓮相似度，表明有較高的相似性，見表2。

3 討論

3.1 檢測(cè)波長(zhǎng)的選擇 實(shí)驗(yàn)采用二級(jí)管陣列檢測(cè)器，考察槲皮素、山柰素和異鼠李素3個(gè)化合物以及供試品液的指紋圖譜，最佳吸收波長(zhǎng)在250～380nm范圍，比較它們的最佳吸收波長(zhǎng)下的指紋色譜峰。結(jié)果表明：在327nm下檢測(cè)得到的特征峰最多，各個(gè)峰的分離度較好，且基線平穩(wěn)，因此確定327nm作為興仁金線蓮指紋圖譜的檢測(cè)波長(zhǎng)。

3.2 流動(dòng)相的選擇 參考了甲醇-0.4%磷酸溶液（50∶50）[2]和乙腈-0.03%磷酸水溶液（24∶76）[3]，進(jìn)行等度洗脫，色譜峰分不開，且特征峰少，經(jīng)反復(fù)試驗(yàn)，最終確定用乙腈-0.4%磷酸水溶液作為流動(dòng)相，進(jìn)行梯度洗脫，供試品三成份峰能與其它峰得以分離，特征峰多且峰形較好。

3.3 HPLC條件優(yōu)化 設(shè)定不同的洗脫梯度，根據(jù)其洗脫梯度下的色譜峰的峰形及分離度，最終確定最佳洗脫梯度，即流動(dòng)相：乙腈（A）-0.4%磷酸水溶液（B）；梯度洗脫程序：0→5→10→30→45→70→80→85min，乙腈（A）對(duì)應(yīng)的濃度梯度5%→10%→20%→25%→30%→40%→5%→5%。該方法簡(jiǎn)單、準(zhǔn)確、重現(xiàn)性好。

3.4 指標(biāo)性成份的選擇 根據(jù)福建金線蓮化學(xué)成份研究，結(jié)果表明該植物中富含黃酮類化合物，結(jié)構(gòu)以槲皮素、山柰素和異鼠李素型黃酮醇苷為主[4-6]，具有較好的藥理作用。前期研究中，興仁金線蓮中這三種成分含量較高，且穩(wěn)定[7]，在建立的指紋圖譜中都有很好的顯示，故選作指標(biāo)性成分。

3.5 指紋圖譜相似度評(píng)價(jià) 實(shí)驗(yàn)采用HPLC法，通過(guò)DAD檢測(cè)法確定了指紋圖譜的檢測(cè)波長(zhǎng)，以興仁金線蓮的有效成份槲皮素、山柰素和異鼠李素為指標(biāo)性成分而建立指紋圖譜，確定了20個(gè)共有峰。興仁金線蓮相似度評(píng)價(jià)結(jié)果表明，12批供試品的HPLC指紋圖譜相似度較高，10批處于0.9以上，同時(shí)也具有一定的差異。S5和S8號(hào)樣品的相似度較低，在0.85以上，且各共有峰保留時(shí)間穩(wěn)定，符合中藥指紋圖譜的技術(shù)要求。說(shuō)明本實(shí)驗(yàn)的方法所建立的指紋圖譜精密度高，重復(fù)性好，穩(wěn)定性可靠，可以作為控制興仁金線蓮質(zhì)量的依據(jù)之一。

綜述，本文采用高效液相色譜法，建立了興仁金線蓮的指紋圖譜，標(biāo)定了20個(gè)共有指紋特征峰，指認(rèn)了其中的三個(gè)成分，為興仁金線蓮質(zhì)量控制提供了依據(jù)。

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（收稿日期：2015.12.26）