弓 強(qiáng)，張春明，牛顏冰

（1.山西中醫(yī)學(xué)院，山西晉中030619； 2.山西省興縣綜合檢驗(yàn)檢測中心，山西興縣033600；

3.山西農(nóng)業(yè)大學(xué)，山西太谷，030801）

地膚病毒病的病原分析

弓 強(qiáng)1，張春明2，牛顏冰3

（1.山西中醫(yī)學(xué)院，山西晉中030619； 2.山西省興縣綜合檢驗(yàn)檢測中心，山西興縣033600；

3.山西農(nóng)業(yè)大學(xué)，山西太谷，030801）

目的：分析地膚病毒病的病原。方法：在生物學(xué)檢測的基礎(chǔ)上，提取病毒雙鏈RNA（dsRNA），合成單鏈cDNA后經(jīng)多重PCR擴(kuò)增、測定序列并分析，對地膚病毒病進(jìn)行了鑒定。結(jié)果：有明顯花葉癥狀的地膚由蠶豆萎蔫病毒2號（Broad bean wilt virus 2，BBWV2）侵染所致。將地膚分離物（Isolate-DF）中部分病毒序列進(jìn)行比對分析，發(fā)現(xiàn)其與已報(bào)道的15個不同來源BBWV2序列的同源性為79.9%～88.0%。結(jié)論：通過分子鑒定，首次證實(shí)我國藥用植物地膚上發(fā)生的花葉病毒病系由BBWV2侵染所致。

地膚；生物學(xué)檢測；多重PCR擴(kuò)增；蠶豆萎蔫病毒2號

地膚（（Kochia scopria））別名掃帚菜、掃帚苗、綠帚，為藜科（Chenopodiaceae）地膚屬一年生草本植物，原產(chǎn)歐洲、亞洲，我國山東、江蘇、河南、河北、山西等地有人工栽培［1］。地膚是傳統(tǒng)的中藥材，全草入藥，種子即是中藥材中的“地膚子”，嫩莖葉可食用，又是理想的油脂原料［2］。地膚的藥用價(jià)值始載于《名醫(yī)別錄》，其中記載“地膚苦、寒。入肝、大腸、小腸三經(jīng)”［3］，主治心血管疾病、尿痛、尿急、小便不利、蕁麻疹，外用治皮癬及陰囊濕疹等［4］。地膚營養(yǎng)價(jià)值豐富，是一種極好的野生蔬菜，含有人體所需的多種氨基酸，種子中含有三萜甙和脂肪油，碘值約140左右［2］。同時(shí)地膚中豐富的亞油酸具有降低人體內(nèi)血清膽固醇和甘油三酯的功能，并可軟化血管和阻止血栓形成，是心血管病患者的良好藥物［3］。此外，地膚營養(yǎng)成分豐富，可作為牧草及加工成家禽和家畜的飼料［5］。

筆者在對山西省晉中地區(qū)進(jìn)行中藥病害調(diào)查時(shí)，發(fā)現(xiàn)地膚表現(xiàn)出嚴(yán)重的花葉病毒病癥狀，嚴(yán)重影響該植物的質(zhì)量和產(chǎn)量。為了確定該病害的病原，本研究利用生物學(xué)接種、病毒dsRNA提取、單鏈cDNA的合成、多重PCR擴(kuò)增等手段對表現(xiàn)花葉病的地膚樣品進(jìn)行了病毒病原的分離檢測與鑒定，確定其為BBWV2侵染所致，并對Isolate-DF分離物中部分病毒核酸序列進(jìn)行了比對分析。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

病樣采自山西省晉中地區(qū)，植株葉片表現(xiàn)出典型花葉癥狀的地膚病株葉片。

主要試劑：莫洛尼鼠白血病病毒逆轉(zhuǎn)錄酶（MMLV）、RNasin核酸酶抑制劑等，購自Promega公司；克隆載體pMD 18-T購自TaKaRa公司、Taq plusDNA polymerase、Taq DNA polymerase、瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒等，購自生工生物（上海）公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 生物學(xué)接種試驗(yàn) 將呈現(xiàn)花葉、皺縮現(xiàn)象的疑似染病地膚的葉片磨碎，汁液接種于盆栽培育的番茄幼苗上，并以接種健康植株汁液的番茄幼苗為對照，定時(shí)觀察癥狀并記錄。

1.2.2 植物病原雙鏈RNA（dsRNA）的提取 參考牛顏冰等［6］和Tzanetakis I E等［7］的方法提取植物病原雙鏈RNA（dsRNA）。

1.2.3 單鏈cDNA的合成 以提取的病樣dsRNA為模板，OligodT為引物進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄擴(kuò)增，并以健康地膚作陰性對照。所使用OligodT引物為：5′-TATGACACGCGTCGACTAGC（T）16-3′。

20 μL反應(yīng)體系為：dsRNA模板3 μL、Primer OligodT 1 μL、dNTP Mixtures（10 mM）6 μL、ddH2O 4.7 μL，90℃水浴5 min，迅速冰上冷卻3 min；再加入5×RT Buffer 4 μL、RNase inhibitor 0.5 μL、M-MLV Reverse Transcriptase 0.8 μL；反應(yīng)程序?yàn)椋?2℃1 h，70℃15 min，反應(yīng)結(jié)束后保存于-20℃。

1.2.4 多重PCR擴(kuò)增 以上面合成的單鏈cDNA為模板、以CMV-CP-F/R、BBWV2-F/R、PVX-CPF/R為特異引物進(jìn)行多重PCR擴(kuò)增，以健康地膚作為陰性對照。

50 μL反應(yīng)體系為：ddH2O 38 μL、10×PCR Buffer 5 μL、dNTP Mixtures（10 mM）1 μL、Primer F/R（CMV-CP、PVX-CP、BBWV2）0.5 μL/0.5 μL、Taq plus DNA polymerase 0.5 μL、cDNA 2.5 μL。反應(yīng)程序?yàn)椋?4℃3 min；94℃30 s，56℃30 s，72℃1 min，36個循環(huán)；72℃10 min，4℃保存。反應(yīng)結(jié)束后進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳檢測。

1.2.5 PCR產(chǎn)物克隆及序列分析 將所得的PCR產(chǎn)物經(jīng)電泳割膠回收純化后，與載體PMD18-T連接，并轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α，經(jīng)克隆、篩選及菌液PCR鑒定后，將帶有重組質(zhì)粒的菌株，以菌液形式進(jìn)行測序經(jīng)形式直接送至生工生物（上海）生物工程有限公司測序。

測序結(jié)果經(jīng)Blast比對進(jìn)行同源性分析和分子進(jìn)化分析；序列分析由DNAMAN、Clustal X、DNASTAR等軟件完成，系統(tǒng)進(jìn)化樹用MEGA 4.0軟件構(gòu)建。

2 結(jié)果與分析

圖1 染病地膚汁液接種番茄幼苗后的癥狀

2.1 生物學(xué)檢測結(jié)果

經(jīng)摩擦接種實(shí)驗(yàn)，將其上攜帶的病毒接種到番茄幼苗上。接種后番茄苗上表現(xiàn)與地膚上類似的癥狀，即典型的花葉、卷曲、皺縮等癥狀（圖1）。

2.2 病毒雙鏈RNA（dsRNA）的提取

成功從表現(xiàn)典型花葉、卷曲、皺縮等癥狀的地膚植株中提取dsRNA，以健康地膚植株作為對照。dsRNA用1.0%的瓊脂糖凝膠電泳檢測，在瓊脂糖凝膠中分離得到大小3 000～7 000 bp的明亮條帶（圖2）。依據(jù)其基因組大小推測該病毒可能為馬鈴薯X病毒屬（PVX）、黃瓜花葉病毒屬（CMV）和蠶豆萎蔫病毒屬（BBWV）等成員之一，或多種病毒的復(fù)合物。

圖2 病毒dsRNA瓊脂糖凝膠電泳

2.3 多重PCR擴(kuò)增

以健康地膚作陰性對照。經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測，擴(kuò)增產(chǎn)物大小為1 183 bp，與BBWV2-F/R引物設(shè)計(jì)預(yù)期擴(kuò)增片段相符（圖3）。

圖3 多重PCR檢測結(jié)果

2.4 序列分析

樣品由生工生物（上海）生物工程有限公司進(jìn)行測序，其所插入片段大小均為1 183 bp，將該分離物命名為Isolate-DF。并對該分離物與GenBank收錄的15個不同來源的BBWV-2進(jìn)行同源性比較分析（表1、圖4）。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，Isolate-DF與中國福建分離物BC（FJ485685）同源性最高，達(dá)到88.0%；而與日本分離物L(fēng)（AB018700）同源性最低，僅為79.9%。

表1 Isolate-DF與15個BBWV-2分離物的同源性比較

3 結(jié)論與討論

1979年Morris& Dodds首次對dsRNA技術(shù)報(bào)道至今，其已在植物病毒研究中大量應(yīng)用［8］。因?yàn)榇蠖鄶?shù)植物病毒是RNA病毒，其在復(fù)制時(shí)會在植物細(xì)胞內(nèi)產(chǎn)生較大分子量的dsRNA［9-11］，并且易從大多數(shù)植物材料中分離出來，其包含著病毒基因組的所有信息，并且可有效地解決因病毒含量低、植物抑制物和病毒顆粒不穩(wěn)定等所帶來的種種問題［7］，是用于病毒基因組克隆和測序研究的最佳選擇。此外，dsRNA的提取會因植物的不同而提取條件有所不同。本試驗(yàn)采用的dsRNA提取方法是將牛顏冰等［6］和Tzanetakis等［7］的方法稍作修改，地膚上分離得到一個BBWV分離物，并將其命名為Isolate-DF，采用多重PCR技術(shù)獲得該分離物RNA2上的部分核苷酸序列，全長為1183bp。將該分離物與已報(bào)道的15個不同來源的BBWV-2分離物進(jìn)行同源性和系統(tǒng)進(jìn)化分析，結(jié)果表明：在核酸水平上，Isolate-DF與其它分離物的同源性為79.9%～88.0%，與中國福建分離物BC同源性最高，達(dá)到88.0%；與日本分離物L(fēng)同源性最低，僅為79.9%；與另外13個分離物的同源性均低于85.0%；表明該分離物為蠶豆萎蔫病毒屬成員。通過分子鑒定，首次發(fā)現(xiàn)BBWV-2在我國藥用植物地膚上發(fā)生，該結(jié)果將為預(yù)防和控制地膚病毒病提供一定的參考依據(jù)。

圖4 基于Isolate-DF和已報(bào)道的15個BBWV-2分離物構(gòu)建的同源樹

由于Isolate-DF與已報(bào)道的BBWV-2的同源性最高僅為88.0%，在系統(tǒng)關(guān)系樹中只形成一個獨(dú)立的分支，以及其能獨(dú)特地侵染并在地膚上進(jìn)行繁殖，而且造成嚴(yán)重的病害，因此我們推測其可能為蠶豆萎蔫病毒屬中的一個突變種或者為該屬的一個新株系。

［1］徐公芳.地膚的特征、特性與利用價(jià)值［J］.草業(yè)科學(xué)，2006，23（10）：106-106

［2］路洪順，王曼.地膚的利用價(jià)值和栽培技術(shù)［J］.中國林副特產(chǎn)，2001（4）：39-39.

［3］林紫玉，張健偉，蓋無雙，等.地膚的利用價(jià)值及開發(fā)前景［J］.山東林業(yè)科技，2007，1（1）：97-98.

［4］謝宗萬.全國中草藥匯編［M］.北京：人民衛(wèi)生出版社，1975.

［5］鄭藝梅，卿中全，劉漢珍，等.地膚營養(yǎng)成分研究［J］.飼料研究，1999，1（9）：20-21.

［6］牛顏冰，姚敏，王德富，等.臭椿病毒病病原鑒定［J］.植物病理學(xué)報(bào)，2011，41（4）：437-440.

［7］Tzanetakis I E，Martin R R.A new method for extraction of double-stranded RNA from plants［J］.Virol Methods，2008，149（1）：167-170.

［8］Koga R，Horiuchi H，F(xiàn)ukuhara T.Double-stranded RNA replicons associated with chloroplasts of a green alga，Bryopsis cinicola［J］.Plant Molecular Biology，2003，51（6）：991-999.

［9］Krajacic M，Ivancic-Jelecki J，F(xiàn)orcic D，et al.Purification of plant viral and satellite double-stranded RNAs on DEAE monoliths［J］.J Chromatogr A，2007，1144（1）：111-119.

［10］Tzanetakis I E，Keller K E，Martin RR.The use of reverse transcriptase for efficient first-and second-strand cDNA synthesis from single-and double-stranded RNA templates［J］.Virol Methods，2005，124（1-2）：73-77.

［11］Balijja A，Kvarnheden A，Turchetti T.A non-phenol-chloroform extraction of double-stranded RNA from plant and fungal tissues［J］.Virol Methods，2008，152（1-2）：32-37.

（編輯：張世霞）

Pathogenic analysis of kochia scoparia virus disease

Gong Qiang1，Zhang Chunming2，Niu Yanbing3
（1.Shanxi College of Traditional Chinese Medicine，Taiyuan Shanxi 030024；2.Xingxian Comprehensive Testing Center of Shanxi Province，Xingxian Shanxi 033600；3.Shanxi Agricultural University，Taigu Shanxi 030801）

Objective：Analyze the pathogeny on the Kochia scoparia virus disease.Method：The Kochia scoparia virus was identified，the virus double-stranded RNA（dsRNA）was extracted，and the single cDNA was synthesized using the multiplex PCR amplification method，and the target sequence was analyzed.Result：The Mosaic symptoms of K.scoparia were caused by the infection of Broad bean wilt virus 2（Broad bean wilt virus 2，BBWV2）.Sequence homology analysis revealed that the partial virus sequence from Isolate-DF of K.scopria showed 79.9%～88.0%homology with other 15 reported BBWV sequences.Conclusion：The results of nucleotides homology analyzing firstly confirmed that the Mosaic virus disease of medicinal plant K.scopria was caused by BBWV2 in china.

Kochia scopria；Biological detection；the multiplex PCR amplification；Broad bean wilt virus 2

R285

A

1671-0258（2016）04-0025-03

弓強(qiáng)，碩士，助教，E-mail：gongqiang012@163.com

牛顏冰，教授，博士，E-mail：niuyanbingbest@163.com