周煒鑫，郭天虹 綜述，黃遠(yuǎn)帥 審校

(西南醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院輸血科,四川瀘州 646000)

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·綜 述· doi:10.3969/j.issn.1671-8348.2016.28.042

γ射線和紫外線應(yīng)用于血液制劑中病原體和白細(xì)胞的滅活

周煒鑫，郭天虹 綜述，黃遠(yuǎn)帥△審校

(西南醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院輸血科,四川瀘州 646000)

γ射線；紫外線；白細(xì)胞；血傳病原體；滅活

據(jù)2015年世界衛(wèi)生組織(World Health Organization,WHO)報(bào)道，全球每年采集的獻(xiàn)血量約為1.08億單位。通常，從獻(xiàn)血員的全血中可以分離出紅細(xì)胞、血小板和血漿等成分。紅細(xì)胞可以用于大量失血的患者，挽救其生命；血小板可以用于各種原因引起的血小板減少的患者；血漿里的凝血因子和血漿衍生蛋白質(zhì)可以用作血友病和先天免疫缺陷患者的替代治療；血漿里提取出來(lái)的免疫球蛋白通過(guò)靜脈或者肌肉注射，適用于免疫缺陷綜合征患者、藥物或者免疫抑制引起的免疫功能失調(diào)、免疫紊亂導(dǎo)致的血液疾病及炎性反應(yīng)，此外，還可以提供被動(dòng)免疫及有效調(diào)節(jié)免疫缺陷患者的免疫應(yīng)答，是現(xiàn)在廣泛使用的生物制劑。由此可見(jiàn)，現(xiàn)代醫(yī)學(xué)中，血液制劑的輸注與患者息息相關(guān)，是不可或缺的支持療法。本文就輸血安全以及γ射線和紫外線在提高血液制劑安全性上的應(yīng)用進(jìn)行綜述。

1 輸注血液制劑可能會(huì)引起的不良后果

伴隨著輸血而來(lái)的弊端在于輸血除了會(huì)引起發(fā)熱、過(guò)敏等不良輸血反應(yīng)，還可能會(huì)引起疾病的傳播。有報(bào)道稱，患者在使用了血漿衍生物-纖維蛋白粘合劑后感染了人類微小病毒B19[1]。而且血液本身的一些成分也會(huì)引起一些不良后果，例如當(dāng)受血者輸注了含有殘留的獻(xiàn)血員白細(xì)胞的血液制劑后，會(huì)引起免疫相關(guān)的嚴(yán)重后果，包括非溶血性的發(fā)熱反應(yīng)、人類白細(xì)胞抗原(HLA)同種異體免疫反應(yīng)、輸血相關(guān)的移植物抗宿主疾病(transfusion-associated graft-versus-host disease,TA-GVHD)等[2]。血小板相關(guān)的細(xì)胞因子和白細(xì)胞相關(guān)的炎性因子IL-6、IL-8和TNF等則會(huì)引起非溶血性發(fā)熱反應(yīng)和過(guò)敏反應(yīng)。而血小板相關(guān)的細(xì)胞因子是主要原因，因?yàn)樵谟冒准?xì)胞濾過(guò)器去除白細(xì)胞后，可以減少非溶血性發(fā)熱反應(yīng)的發(fā)生但并不能消除，而過(guò)敏反應(yīng)卻無(wú)變化[3]。因此，血液制劑的安全一直受到醫(yī)務(wù)人員和患者的高度重視。

隨著監(jiān)管力量的日益增強(qiáng)以及不斷出現(xiàn)的先進(jìn)的篩選技術(shù)，大大降低了輸血引起的疾病傳播，比如病原體減少技術(shù)(pathogen reduction technology，PRT)可以減少輸血引起的疾病傳播，提高血液安全性，同時(shí)保證血液制劑結(jié)構(gòu)和功能的完整性[4]。然而，盡管病毒檢測(cè)技術(shù)的不斷提高，仍然不能避免輸血引起的窗口期疾病傳播，故輸血仍然存在風(fēng)險(xiǎn)。對(duì)于會(huì)引起不良后果的白細(xì)胞，有研究表明，25 Gy的γ輻照足以阻止T淋巴細(xì)胞的增殖，可以預(yù)防免疫功能低下的患者發(fā)生TA-GVHD[5]；白細(xì)胞濾過(guò)減少器處理的血液制劑要求每個(gè)輸注單位殘余的白細(xì)胞數(shù)低于5×106(美國(guó))和 1×106(歐盟)，這2種方法處理血液制劑都可以減少但不能消除以上白細(xì)胞引起的相關(guān)不良免疫反應(yīng)。故為了能進(jìn)一步提高血液制劑的安全性，需要更多更有效的方法應(yīng)用于去除血液制劑中的包括病原體、白細(xì)胞等給受血者帶來(lái)不良反應(yīng)的物質(zhì)。

2 需要保障血液制劑的安全性

能夠提高血液制劑安全性的理想方法應(yīng)該具備以下特點(diǎn)[6]：(1)可以滅活所有有包膜和無(wú)包膜的病毒；(2)對(duì)產(chǎn)品的生物活性無(wú)不良反應(yīng)，最小程度地減少生物制劑的成分丟失；(3)在適宜的條件下穩(wěn)定可靠，適用于大批量血漿制劑的流水線滅活；(4)不能添加一些后續(xù)步驟中必須去除的物質(zhì)；(5)應(yīng)當(dāng)經(jīng)濟(jì)安全，可以廣泛應(yīng)用；(6)滅活步驟最好能夠在血液制劑保存的最終容器里進(jìn)行；(7)該方法對(duì)產(chǎn)品沒(méi)有毒理學(xué)作用。目前，常用于滅活病原體和白細(xì)胞的方法有γ射線輻照、紫外線照射、白細(xì)胞濾過(guò)器過(guò)濾、碘液滅菌等，在滅活病原體或者白細(xì)胞上各有優(yōu)缺點(diǎn)。碘酒可用于滅活幾乎所有類型的病原微生物，包括細(xì)菌、病毒、寄生蟲(chóng)等，是一種運(yùn)用至今的消毒滅菌方法，可滅活血清、血漿或者血漿蛋白中有包膜和無(wú)包膜的病毒。但目前應(yīng)用最廣泛的是γ射線和紫外線照射。

2.1 γ射線輻照對(duì)病原體和血液成分的影響 γ射線是一種電磁波，是原子核能級(jí)躍遷蛻變時(shí)釋放出的射線，因此很小的劑量能通過(guò)相互作用擁有強(qiáng)大的穿透力。γ射線可以通過(guò)二次反應(yīng)產(chǎn)生自由基和活性氧來(lái)最大限度地滅活病原體。近半個(gè)世紀(jì)以前，就有學(xué)者報(bào)道γ射線能通過(guò)電離作用消除病原體核酸的活性和傳染性[7]；肖潔等[8]研究報(bào)道20～40 Gy的137Csγ射線能夠有效滅活單采血小板里的銅綠假單胞菌、肺炎克雷伯菌和表皮葡萄球菌而不影響血小板的質(zhì)量；Miekka 等[6]報(bào)道稱，45 Gy的γ射線的劑量幾乎可以滅活所有包括無(wú)包膜病毒在內(nèi)的血源性傳播病毒。γ射線滅活病毒主要與劑量，病毒核酸大小及病毒的種類相關(guān)[9]。通常γ射線滅活細(xì)菌需要的劑量是20～25 Gy，而滅活病毒的劑量更大。盡管病毒的核酸大小遠(yuǎn)遠(yuǎn)小于細(xì)菌，但滅活病原體所需的γ射線的劑量與病原體的核酸體積大小成反比。因此，γ射線輻照常用于醫(yī)療設(shè)備、藥品、食品、培養(yǎng)專用血清等的消毒滅菌。與此同時(shí)，γ射線還能夠降低白細(xì)胞的活性，γ射線輻照處理血液制劑滅活白細(xì)胞來(lái)預(yù)防TA-GVHD已經(jīng)有40年[10]。

然而商業(yè)性的治療型生物制劑并未把γ射線輻照作為滅活病毒的常用方法，因?yàn)?5～50 Gy的劑量在滅活病毒的同時(shí)也可能會(huì)破壞生物制劑的活性，比如血漿相關(guān)蛋白等。有研究表明γ射線破壞蛋白質(zhì)有2個(gè)機(jī)制：(1)可以直接作用于目標(biāo)蛋白的共價(jià)鍵，通過(guò)光子聚集的能量來(lái)破壞這個(gè)蛋白分子；(2)間接與水分子作用產(chǎn)生自由基和活性氧來(lái)破壞99.9%的蛋白質(zhì)[11]。間接作用包括：在有氧條件下，γ射線作用于水溶液會(huì)產(chǎn)生水合電子、氫原子、過(guò)氧化氫及最具殺傷力的羥基自由基等，均可導(dǎo)致蛋白質(zhì)發(fā)生物理和化學(xué)方面的改變，比如蛋白質(zhì)側(cè)鏈氧化、蛋白鏈分離和破碎、交聯(lián)、解鏈、形成新的反應(yīng)基團(tuán)，包括疏水性氨基、酰基殘基氧化形成的羥基和過(guò)氧化氫衍生物，蛋白質(zhì)羧基化產(chǎn)物，二聚酪氨酸等許多新的基團(tuán)。這一系列反應(yīng)破壞了蛋白質(zhì)的完整性，導(dǎo)致蛋白質(zhì)喪失了生物活性[12]。

盡管理論上如此，但在實(shí)踐過(guò)程中有學(xué)者發(fā)現(xiàn)，在某些條件下，殺病毒劑量的γ射線并沒(méi)有對(duì)相關(guān)蛋白產(chǎn)生明顯的影響。在Tran 等[13]的研究中，對(duì)于用殺病毒劑量(45 Gy)的γ射線輻照靜脈注射的免疫球蛋白(intravenous immunoglobulins，IVIG)后，發(fā)現(xiàn)其Fab和Fc段的結(jié)構(gòu)域保持輻照前的完整性，故推薦使用γ射線來(lái)處理IVIG提高其安全性。Smeltzer 等[14]用不同劑量γ射線對(duì)IgG進(jìn)行照射，通過(guò)SDS-PAGE、HPLC、ELISA等方法來(lái)檢測(cè)IgG的抗原結(jié)合能力和Fc段結(jié)合能力，以此來(lái)探究γ射線對(duì)IgG結(jié)構(gòu)和功能的影響。結(jié)果顯示，在-80 ℃時(shí)，殺病毒劑量50 Gy 射線的照射下，免疫球蛋白多肽鏈的完整性和二級(jí)結(jié)構(gòu)不被破壞，三級(jí)結(jié)構(gòu)構(gòu)象發(fā)生了變化但不足以影響免疫球蛋白功能活性，并且對(duì)最重要的結(jié)構(gòu)區(qū)域的構(gòu)象完整性無(wú)影響，因?yàn)閷?duì)比輻照和未輻照的IVIG的熵值大小接近，故證明在輻照下蛋白質(zhì)并未發(fā)生明顯的內(nèi)部反應(yīng)。所以，盡管γ射線對(duì)蛋白質(zhì)分子的熱穩(wěn)定性產(chǎn)生了輕微的影響，但是并沒(méi)有改變IgG的本質(zhì)。進(jìn)一步研究還發(fā)現(xiàn)，γ射線對(duì)IgG完整性的影響小于pH的變化對(duì)IgG完整性的影響。Grieb 等[15]研究發(fā)現(xiàn)，porcine parvo-virus(PPV)是最耐受γ輻照的無(wú)包膜病毒，用45 Gy的劑量輻照混入PPV病毒的單克隆抗體，當(dāng)抗壞血酸鈉和自由基清除劑加入后或者將單克隆抗體凍干后輻照，都可以使PPV數(shù)量減少1×105個(gè)，并且保護(hù)單克隆抗體的功能活性和主要結(jié)構(gòu)的完整性。當(dāng)劑量增加至50 Gy時(shí)，可以滅活1×1010個(gè)的PPV，而單克隆抗體跟抗原結(jié)合的活性可以得到超出97%的恢復(fù)。因此，他們認(rèn)為，在殺病毒劑量的γ輻照過(guò)程中，加入抗氧化劑或者自由基清除劑，或者在冰凍固體狀態(tài)下輻照可以很好地保護(hù)生物制劑有效成分的活性。

除了對(duì)血漿蛋白的影響，γ射線對(duì)紅細(xì)胞和凝血因子等也有一定的影響。γ射線會(huì)改變紅細(xì)胞的形態(tài)、電解質(zhì)濃度等。Xu 等[16]研究了不同劑量的γ射線對(duì)紅細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)的影響，以及輻照后紅細(xì)胞儲(chǔ)存不同時(shí)間下的電解質(zhì)和pH的變化。結(jié)果顯示隨著劑量的增加，出現(xiàn)異常形態(tài)紅細(xì)胞(棘形紅細(xì)胞，退化紅細(xì)胞等)的比例逐漸增加；輻照對(duì)Na+、K+、Cl-水平有影響，且對(duì)K+的影響最大，因?yàn)檩椪湛赡軙?huì)改變細(xì)胞的滲透壓和膜通透性，隨著劑量增大，電解質(zhì)水平改變更加明顯。而pH的下降與γ射線劑量和紅細(xì)胞儲(chǔ)存時(shí)間相關(guān)。Sarkar 等[17]研究了γ射線與凝血因子之間的聯(lián)系，他們用30 Gy劑量的γ射線輻照新鮮冰凍血漿后，通過(guò)檢測(cè)PT、APTT、TT、vWFAg、FⅡ、FV、FⅧ、FIX、FX、FXI、FⅫ、C蛋白、S蛋白、D-二聚體等的變化，探討γ射線對(duì)新鮮冰凍血漿凝血和抗凝功能的影響。結(jié)果顯示，30 Gy的γ射線輻照后，縮短了PT、APTT、TT，激活了FIX、FX、FXI、FXII。但是這些變化都很微小，無(wú)重要的臨床意義。而對(duì)抗凝系統(tǒng)(C蛋白、S蛋白活性)和纖溶系統(tǒng)也無(wú)影響。該研究結(jié)果與Weisbach 等[18]的研究相符。由此可見(jiàn)，γ射線可以用于血漿及其血漿衍生蛋白制品和紅細(xì)胞制劑的病原體和殘留白細(xì)胞的滅活。

2.2 紫外線照射對(duì)病原體和血液成分的影響 近年來(lái)，有學(xué)者提倡用紫外線來(lái)替代γ射線。因?yàn)榕c光化學(xué)、光動(dòng)力學(xué)滅菌法相比較，紫外線具有明顯的優(yōu)勢(shì)，它本身具有活性，不需要加入可能會(huì)封閉蛋白質(zhì)以致產(chǎn)生有害免疫反應(yīng)[19]的光敏化合物，因此，也不需要去除光敏化合物及它的代謝產(chǎn)物。一般來(lái)講，最常使用的是短波(UVB，200～280 nm)和中波紫外線(UVB,200～280 nm)。UVC和UVB滅活病原體的原理在于，可以作用于病毒的核苷酸使之形成環(huán)丁烷嘧啶和嘧啶二聚體，從而阻止病毒核酸的復(fù)制延長(zhǎng)，達(dá)到滅活病毒的作用[20]。Mohr 等[21]研究結(jié)果表明，通過(guò)比較1 J/cm2UVC和2 J/cm2的UVB照射對(duì)血漿功能的影響，得出UVC更加適合血漿的滅菌；DNA病毒比RNA病毒、單鏈核酸病毒比雙鏈核酸病毒對(duì)紫外線敏感。用1 J/cm2UVC照射含病毒[水皰性口炎病毒(VSV)、單純皰疹病毒(SHV-1)、腦心肌炎病毒(EMCV)、豬細(xì)小病毒(PPV)和艾滋病病毒(HIV)等]的血漿后，除HIV以外，所有病毒都被滅活了，同時(shí)凝血因子和血漿蛋白的損失不超過(guò)10%～20%。Fast 等[10]報(bào)道稱，核黃素(維生素B2)聯(lián)合紫外線輻照可以通過(guò)不可逆地改變核酸，來(lái)滅活大部分的病原體及抑制由白細(xì)胞引起的一系列諸如移植物抗宿主反應(yīng)，同種異體免疫等有害的免疫反應(yīng)。此外，核黃素(維生素B2)聯(lián)合紫外線輻照還可以減少有包膜和無(wú)包膜的病毒，以及與臨床相關(guān)的污染菌[4]。重要的是，這種方法處理新鮮冰凍血漿后對(duì)蛋白質(zhì)和凝血因子Ⅷ的活性無(wú)影響[22]。因此，紫外線照射可以用于血液制劑的病原體滅活。

2.3 γ射線輻照和紫外線照射對(duì)白細(xì)胞功能的影響 此外，γ射線和紫外線都可以作用于白細(xì)胞，減低它的活性，有學(xué)者對(duì)比研究了這兩種方法對(duì)白細(xì)胞的不同影響。Fast 等[10]研究了全血用核黃素(維生素B2)聯(lián)合紫外線和單獨(dú)用γ射線分別處理后，通過(guò)體內(nèi)和體外實(shí)驗(yàn)來(lái)對(duì)比2種方法對(duì)白細(xì)胞活性和功能的影響。體外實(shí)驗(yàn)表明，核黃素(維生素B2)聯(lián)合紫外線照射可以抑制同種免疫反應(yīng)及讓白細(xì)胞失去抗原提呈的能力；相反，γ射線輻照不具有此作用。2種方法都可以阻止淋巴細(xì)胞的增殖。γ射線輻照后分泌的細(xì)胞因子濃度(TNF-α、IL-10、IL-6、IL-1β、IL-8)與未作處理組比較并未發(fā)現(xiàn)明顯差異，而核黃素(維生素B2)聯(lián)合紫外線處理后，可以影響細(xì)胞因子的合成從而使大部分的細(xì)胞因子(除TNF-α、IL-8外)分泌減少。體內(nèi)實(shí)驗(yàn)包括從核黃素(維生素B2)聯(lián)合紫外線、γ射線(25 Gy)處理的血液和不作處理的血液中分離出白細(xì)胞注射到小鼠體內(nèi)，觀察他們發(fā)生GVHD的發(fā)展情況，結(jié)果這2種方法處理過(guò)的白細(xì)胞輸注后都未引起小鼠的GVHD。因此，他們推薦用核黃素(維生素B2)聯(lián)合紫外線照射來(lái)替代γ射線輻照處理血液來(lái)提高成本效益。Reddy等[23]作了一個(gè)體內(nèi)體外實(shí)驗(yàn)，結(jié)果表明，核黃素(維生素B2)紫外線照射與γ輻照(25 Gy)相比，對(duì)于滅活白細(xì)胞預(yù)防GVHD的能力是相同的，但更加有效地減少細(xì)胞因子生成和同種免疫反應(yīng)，該結(jié)果與Fast 等[10]的實(shí)驗(yàn)結(jié)果相符。最近，Pohler 等[2]的研究也證實(shí)了γ射線輻照和紫外線這兩種方法對(duì)于預(yù)防GVHD具有同樣的效果，而在抑制T細(xì)胞增殖、細(xì)胞因子分泌和抗原提呈能力方面，紫外線優(yōu)于γ射線輻照。因此紫外線照射作為替代γ射線輻照的一種方法，應(yīng)用于滅活血液制劑中殘留的白細(xì)胞來(lái)預(yù)防GVHD。

3 展 望

由此可見(jiàn)，γ射線和紫外線滅活病原體和白細(xì)胞的機(jī)制和影響都有不同之處。γ射線殺病原體有直接和間接作用，直接作用是射線與核酸的相互作用，導(dǎo)致核酸鏈的交聯(lián)和斷裂。間接作用是與細(xì)胞內(nèi)外的環(huán)境，如與水發(fā)生作用產(chǎn)生自由基、羥自由基和氫原子等[24]。紫外線(254 nm)可以直接作用于核酸，導(dǎo)致嘧啶二聚體的產(chǎn)生，從而阻止核酸轉(zhuǎn)錄的延長(zhǎng)。當(dāng)加入核黃素后，在紫外光照射下，可以特異性地在核酸的鳥(niǎo)嘌呤堿基處對(duì)DNA造成損傷，從而使核酸骨架鏈斷裂，滅活病原體[25]。γ射線和紫外線都可以滅活白細(xì)胞預(yù)防GVHD，但在抑制T細(xì)胞增殖、細(xì)胞因子分泌和抗原提呈能力方面，紫外線優(yōu)于γ射線輻照。不足之處在于，兩種方法處理血液制劑可能會(huì)破壞生物制劑的有效成分。γ射線與水分子作用產(chǎn)生自由基和活性氧破壞蛋白質(zhì)，紫外線通過(guò)氧化芳香族氨基酸，打開(kāi)肽鏈之間的二硫鍵來(lái)破壞蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)。但對(duì)于γ射線，加入抗氧化劑或自由基清除劑，或者在冰凍固體狀態(tài)下輻照可以很好地保護(hù)生物制劑的有效成分活性?？傊?，臨床工作中，應(yīng)當(dāng)根據(jù)不同目的來(lái)選取不同的方法，同時(shí)不斷創(chuàng)新改進(jìn)現(xiàn)有方法，盡可能地保證血液制劑的質(zhì)量。

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四川省衛(wèi)生廳科研基金資助項(xiàng)目(120336)；西南醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院自然科學(xué)基金項(xiàng)目(15048)。 作者簡(jiǎn)介:周煒鑫(1990-)， 在讀碩士，主要從事自體輸血、輸血安全研究。△

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1671-8348(2016)28-4005-03

2016-07-15

2016-08-11)