宋淑英　張澤輝　王莊

摘要：豬瘟病毒為豬瘟的病原，該病流行范圍廣、致死率高且難以清除，給生豬養(yǎng)殖業(yè)造成巨大威脅。因此對病毒的基因結(jié)構(gòu)、致病機(jī)理以及疫苗防控等方面的研究一直都是熱點(diǎn)。對豬瘟病毒功能基因的研究進(jìn)展進(jìn)行了介紹。對其整體基因結(jié)構(gòu)進(jìn)行了概述，對其功能區(qū)域，特別是對病毒RNA 3UTR與5UTR區(qū)域的結(jié)構(gòu)，及各區(qū)域在病毒復(fù)制、表達(dá)過程中的功能進(jìn)行了詳細(xì)介紹。同時(shí)對病毒RNA ORF所含基因，以及其表達(dá)產(chǎn)物在病毒致病性中的作用進(jìn)行了簡要說明。為進(jìn)一步探明病毒的致病機(jī)理，以及防控疫苗的研制提供理論幫助。

關(guān)鍵詞：豬瘟病毒；功能基因；非翻譯區(qū)；病毒復(fù)制

中圖分類號(hào)：S852.65+1 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：B 文章編號(hào)：1007-273X（2016）01-0010-03

豬瘟是由豬瘟病毒（Classical swine fever virus，CSFV）引起的一種接觸性、熱性、急性且致死率較高的傳染性疾病[1]。病豬通常因全身血管壁變性，造成廣泛出血、臟器壞死、梗塞而導(dǎo)致死亡[2]。隱性感染和慢性感染的豬會(huì)長期排毒，成為潛在感染源，對豬群健康造成嚴(yán)重危害。據(jù)統(tǒng)計(jì)，我國每年因豬瘟造成的經(jīng)濟(jì)損失已超過100億元[3]。豬瘟嚴(yán)重阻礙養(yǎng)殖業(yè)的健康發(fā)展，并對食品安全造成威脅。因此，對該病進(jìn)行全面、綜合防控，具有必要的現(xiàn)實(shí)意義。本文對CSFV及功能相關(guān)基因、蛋白的研究進(jìn)展進(jìn)行介紹，為全面了解CSFV、全方位防控豬瘟提供理論支持。

1 CSFV

CSFV屬黃病毒科，瘟病毒屬，病毒粒子為二十面體、對稱、圓形結(jié)構(gòu)。為正鏈、單股RNA病毒[3]。粒子直徑約為40 nm～50 nm，核衣殼直徑約29 nm，衣殼內(nèi)部包裹基因組RNA，長度約12.3 kb[4]，病毒囊膜表面被6 nm～8 nm的糖蛋白纖維穗樣突起所包裹[5]。

20世紀(jì)90年代，根據(jù)遺傳進(jìn)化分析，CSFV被分為2個(gè)基因群，包含5個(gè)基因亞群，分別為subgroup1.1、1.2、2.1、2.2及2.3。當(dāng)時(shí)影響我國的主要為基因1群，該群主要包括亞洲、南美洲分離株，及部分古典歐洲、美洲分離株和日本分離株。在九十年代末，學(xué)術(shù)界多根據(jù)CSFV的E2基因、NS5B基因以及5′-UTR對病毒進(jìn)行分類[6]。目前已將CSFV分為3個(gè)基因群，共10個(gè)基因亞群，其中基因2群毒株在世界范圍內(nèi)廣泛流行。在我國，CSFV主要由基因2群及1群，共4個(gè)基因亞群組成，分別為2.1、2.2、2.3及1.1亞群。主導(dǎo)毒株已由基因1群變?yōu)榛?群[7]，說明我國CSFV的傳播途徑更為復(fù)雜。

2 CSFV基因

CSFV基因由3′-端非翻譯區(qū)（3′-untranslated region， 3′UTR）、5′-端非翻譯區(qū)（5′-untranslated region， 5′-UTR）和一個(gè)較大的開放閱讀框（ORF）三部分構(gòu)成。在病毒RNA的3′-端缺少多聚腺苷酸結(jié)構(gòu)（polyA），5′-端缺少甲基化的“帽子”結(jié)構(gòu)[8]。

2.1 5′-UTR

CSFV 5′-UTR長約370 nt，不同基因群長度各異，但同群內(nèi)高度保守。在5′-UTR中存在核糖體結(jié)合位點(diǎn)，該位點(diǎn)能夠與核糖體18S rRNA的3′-端保守序列結(jié)合，從而起始病毒翻譯過程[4]。核糖體結(jié)合位點(diǎn)結(jié)構(gòu)的完整性對CSFV復(fù)制起決定性作用。5′-UTR中的莖-環(huán)序列能夠形成穩(wěn)定的發(fā)夾結(jié)構(gòu)，該結(jié)構(gòu)是構(gòu)成核糖體結(jié)合位點(diǎn)的重要組成部分。最近研究表明，在5′-UTR中存在連續(xù)的21 nt序列或GTATACGAG序列，該序列的突變或缺失，能夠?qū)е虏《緩?fù)制效率的顯著降低甚至完全無法起始復(fù)制過程[9]。在CSFV不同基因群的5′-UTR起始密碼子上游，存在一段長度為27 nt的高度保守序列，該序列可以與核糖體結(jié)合并在無“帽子”結(jié)構(gòu)的情況下起始病毒的翻譯過程。研究同時(shí)發(fā)現(xiàn)，該序列與Met tRNA與起始密碼子定位過程有關(guān)。由于5′-UTR區(qū)域的高度保守性，因此常被用于CSFV分型[3]。

5′-UTR的二級(jí)結(jié)構(gòu)可分為四個(gè)功能區(qū)，A、B、C和D區(qū)。其中B區(qū)為可變區(qū)，保守性最低；C區(qū)為保守區(qū)，與莖-環(huán)結(jié)構(gòu)、發(fā)夾結(jié)構(gòu)有關(guān)；D區(qū)的一級(jí)結(jié)構(gòu)為可變區(qū)，但二級(jí)結(jié)構(gòu)相對保守[10]。當(dāng)5′-UTR核糖體結(jié)合位點(diǎn)與核糖體40S亞基形成穩(wěn)定二元復(fù)合物后，起始密碼子才能夠準(zhǔn)確定位核糖體P位點(diǎn)，CSFV翻譯才能夠正常進(jìn)行。在此過程中，核糖體結(jié)合位點(diǎn)的結(jié)構(gòu)與功能至關(guān)重要。分析發(fā)現(xiàn)，核糖體結(jié)合區(qū)域位于起始密碼子的兩側(cè)363 nt～391 nt之間，結(jié)合位點(diǎn)的5′-邊界臨近病毒基因組第65位堿基[11]。核糖體結(jié)合位點(diǎn)可分為3個(gè)區(qū)域，其中II區(qū)及其下游區(qū)域與結(jié)合功能密切相關(guān)。當(dāng)缺失部分II區(qū)及其上游序列時(shí)，結(jié)合位點(diǎn)仍有活性，但活性降低20%左右；當(dāng)缺失部分II區(qū)及全部下游序列時(shí)，結(jié)合位點(diǎn)則完全喪失結(jié)合活性。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，核糖體結(jié)合位點(diǎn)的II區(qū)主要與病毒的復(fù)制能力有關(guān)，對翻譯過程影響不大；而III區(qū)則主要與病毒的翻譯過程有關(guān)，對病毒的復(fù)制能力幾乎沒有影響[12]。

除結(jié)合位點(diǎn)自身結(jié)構(gòu)外，結(jié)合位點(diǎn)下游序列的結(jié)構(gòu)對翻譯起始及翻譯效率也有很大影響。研究發(fā)現(xiàn)，當(dāng)結(jié)合位點(diǎn)下游起始密碼子AUG后緊接17或更多病毒自身密碼子時(shí)，結(jié)合位點(diǎn)的翻譯起始能力最強(qiáng)；當(dāng)病毒自身密碼子減少至12個(gè)時(shí)，位點(diǎn)起始能力降低至66%；當(dāng)僅保留3個(gè)自身密碼子時(shí)，位點(diǎn)起始能力則僅有15%。同時(shí)RNA結(jié)構(gòu)分析表明，起始密碼子后的序列保持單鏈狀態(tài)時(shí)，起始位點(diǎn)起始翻譯的效率最高[12-15]。

2.2 3′-UTR

CSFV的3′-UTR位于病毒基因組較大的ORF終止密碼子（UGA）之后，有223 nt～239 nt組成，無ploy（A）尾結(jié)構(gòu)，但含有一段富含AT的區(qū)域。在3′-UTR中包含兩個(gè)較為穩(wěn)定的莖-環(huán)結(jié)構(gòu)序列（stem-loop motif，SL），分別為SL I和SL II。序列分析發(fā)現(xiàn)，在SL I與SL II 之間存在一段長的單鏈間插序列（single stranded intervening sequence， SS）[16]。研究發(fā)現(xiàn)，SL I和SS序列在病毒RNA復(fù)制過程中發(fā)揮重要作用，當(dāng)分別或同時(shí)在SL I及SS序列中發(fā)生突變或缺失時(shí)，病毒RNA的復(fù)制能力都會(huì)減弱，甚至無法進(jìn)行復(fù)制[17]。已有研究表明，CSFV的3′-UTR端SL序列以順式作用原件的形式參與RNA復(fù)制過程。同時(shí)，3′-UTR與成熟病毒粒子的包裝過程有關(guān)，但具體機(jī)制尚不明確[18]。

3′-UTR的結(jié)構(gòu)完整性與病毒基因組RNA合成的起始以及合成的效率有關(guān)。研究發(fā)現(xiàn)，在CSFV的3′-UTR中有一段21 nt的核苷酸序列是病毒復(fù)制所必須的。缺少該段序列，病毒將無法進(jìn)行復(fù)制[19]。但即使3′-UTR僅含有該段序列，而其他部分全部缺失時(shí)，病毒RNA仍能起始合成，但合成效率顯著降低[20]。在21 nt核苷酸序列中，位于216位的T堿基是病毒RNA起始合成的關(guān)鍵位點(diǎn)，該位點(diǎn)的突變將導(dǎo)致病毒無法起始RNA合成；219位和228位的堿基發(fā)生突變會(huì)導(dǎo)致起始能力顯著降低；212位堿基對起始能力無明顯影響，但對RNA的合成效率影響較大。研究表明，CSFV的3′-UTR與病毒的RNA復(fù)制酶結(jié)合，起始病毒基因組RNA的復(fù)制過程。在其3′-末端存在CCCGG序列與復(fù)制酶結(jié)合有關(guān)，該序列的缺失或突變，會(huì)導(dǎo)致結(jié)合能力大幅降低[21-23]。

2.3 ORF

CSFV的ORF首先翻譯出一個(gè)多聚蛋白（polyprotein，PPro）。PPro由3 898個(gè)氨基酸構(gòu)成，并在病毒自身合成的蛋白酶及宿主細(xì)胞的信號(hào)肽酶作用下，被分解、加工為12種蛋白質(zhì)。依據(jù)其編碼基因的順序，蛋白分別為Npro、C、Erns（E0）、E1、E2、P7、NS2、NS3、NS4A、NS4B、NS5A及NS5B。其中4種為結(jié)構(gòu)蛋白，分別為C、Erns、E1及E2，其余為非結(jié)構(gòu)蛋白[24]。

研究發(fā)現(xiàn)，在ORF中與CSFV毒力相關(guān)基因?yàn)镹pro、Erns、E1及E2。CSFV強(qiáng)毒株基因組中任一毒力相關(guān)基因發(fā)生突變，或被弱毒株的相應(yīng)基因替換后，強(qiáng)毒株的致病力將明顯下降。Erns表達(dá)的蛋白具有淋巴細(xì)胞毒性[16]，其他3個(gè)基因表達(dá)的蛋白單獨(dú)并不表現(xiàn)出任何毒性，推測其在維系病毒的整體致病性方面發(fā)揮作用。最近研究發(fā)現(xiàn)，Npro基因表達(dá)的蛋白能夠與病毒基因組復(fù)制過程中形成的雙鏈RNA中間體（dsRNA）結(jié)合，抑制其功能，并對IFN-α/β啟動(dòng)子具有抑制作用[25]。這種抑制作用，能夠使感染細(xì)胞抵抗由dsRNA分子引起的細(xì)胞凋亡，從而導(dǎo)致非強(qiáng)毒株的持續(xù)性感染。

3 展望

CSFV給生豬養(yǎng)殖業(yè)帶來巨大威脅，免疫接種仍是最有效的防控措施之一。目前，OIE推薦的豬瘟標(biāo)記疫苗中，大部分是根據(jù)其結(jié)構(gòu)蛋白E2糖蛋白而研制的。但隨著對CSFV基因組研究的推進(jìn)，使研發(fā)針對其他蛋白或基因的新型疫苗成為可能。如針對E2囊膜糖蛋白亞單位的標(biāo)記疫苗，以及通過基因重組技術(shù)獲得能夠表達(dá)Npro、Erns、E1及E2蛋白的重組痘苗病毒等[23，25]，都為豬瘟的防控提供了新的思路。而隨著對CSFV基因功能、作用研究的不斷深入，對其致病機(jī)理也將有更加準(zhǔn)確的闡述，也將為豬瘟的全方位防控提供幫助。

參考文獻(xiàn)：

[1] 張小苗，張 恒，張玉艾，等.表達(dá)豬瘟病毒E0-E2基因重組腺病毒疫苗在兔體上的免疫原性分析[J].動(dòng)物醫(yī)學(xué)進(jìn)展，2015，36（9）：8-12.

[2] MUNOZ-GONZALEZ S， PEREZ-SIMO M， MUNOZ M， et al. Efficacy of a live attenuated vaccine in classical swine fever virus postnatally persistently infected pigs[J]. Vet Res， 2015，9（46）：78-82.

[3] 陶玉順，黃 濤，袁東波，等. 目前我國豬瘟的流行現(xiàn)狀及防控措施[J]. 畜牧與獸醫(yī)，2008，40（8）：90-95.

[4] 李文良，毛 立，楊蕾蕾，等. 豬瘟糖基化E2蛋白和E0蛋白的協(xié)同免疫保護(hù)作用[J]. 江蘇農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào)，2015，31（2）：357-361.

[5] SAWFORD K， GEONG M， BULU P M， et al. An investigation of classical swine fever virus seroprevalence and risk factors in pigs in East Nusa Tenggara， eastern Indonesia[J]. Prev Vet Med， 2015，119（3-4）：190-202.

[6] POSTEL A， MONENNIG V， BECHER P. Classical swine fever in Europe： the current situation[J]. Berl Munch Tieraiztl Wochenschr， 2013，126（11-12）：468-475.

[7] TAMURA T， NAGASHIMA N， RUGGLI N， et al. Npro of classical fever virus contributes to pathogenicity in pigs by preventing thpe I interferon induction at local replication sites[J]. Vet Res， 2014，17：45-47.

[8] TARRADAS J， DE LA TORRE M E， ROSELL R， et al. The impact of CSFV on the immune response to control infection[J]. Virus Res， 2014，24（185）：82-91.

[9] 張 鑫，劉 寧，時(shí)洪艷，等. 豬瘟病毒衣殼蛋白核仁定位信號(hào)鑒定[J]. 中國預(yù)防獸醫(yī)學(xué)報(bào)，2015，37（2）：93-97.

[10] LUO Y， LI S， SUN Y， et al. Classical swine fever in China： a minireview[J]. Vet Microbiol， 2014，172（1-2）：1-6.

[11] HUA RH， HUO H， LI Y N， et al. Generation and efficacy evaluation of recombinant classical swine fever virus E2 glycoprotein expressed in stable transgenic mammalian cell line[J]. PLoS One， 2014，9（9）：e106891.

[12] CHEN Y， XIAO J， XIAO J， et al. Classical swine fever virus NS5A regulates viral RNA replication through binding to NS5B and 3UTR[J]. Virology， 2012，432（2）：376-388.

[13] 田 宏，劉湘濤，張彥明，等. 豬瘟病毒及其致病機(jī)制研究[J]. 動(dòng)物醫(yī)學(xué)進(jìn)展，2007，28（增）：27-30.

[14] HE L， ZHANG Y， FANG Y， et al. Classical swine fever virus induces oxidative stress in swine umbilical vein endothelial cells[J]. BMC Vet Res， 2014，2（10）：279-288.

[15] LI W， ZHANG Y， KAO C C. The classic swine fever virus （CSFV） core protein can enhance de novo-initiated RNA synthesis by the CSFV polymerase NS5B[J]. Virus Genes， 2014，49（1）：106-115.

[16] LI L， WU R， ZHENG F， et al. The N-terminus of classical swine fever virus （CSFV） nonstructural protein 2 modulates viral genome RNA replication[J]. Virus Res， 2015，29（2）：90-99.

[17] JUNG M， SHIN Y J， KIM J. et al. Induction of immune responses in mice and pigs by oral administration of classical swine fever virus E2 protein expressed in rice calli[J]. Arch Virol， 2014，159（12）：3219-3230.

[18] 郭東光，朱艷平，孫國鵬，等. 豬瘟病毒E0蛋白的原核表達(dá)及鑒定[J]. 動(dòng)物醫(yī)學(xué)進(jìn)展， 2014，35（5）：31-35.

[19] SANCHEZ O， BARRERA M， FARNOS O， et al. Effectiveness of the E2-classical swine fever virus recombinant vaccine produced and formulated within whey from genetically transformed goats[J]. Clin Vaccine Immunol， 2014，21（12）：1628-1634.

[20] LI S， FENG S， WANG J H， et al. eEF1A interacts with the NS5A protein and inhibits the growth of classical swine fever virus[J]. Viruses， 2015，7（8）：4563-4581.

[21] HUANG Y L， DENG M C， WANG F， et al. The challenges of classical swine fever control： modified live and E2 subunit vaccines[J]. Virus Res， 2014，22（179）：1-11.

[22] Ji W， Niu DD， Si HL， et al. Vaccination influences the evolution of classical swine fever virus[J]. Infect Genet Evol， 2014，25：69-77.

[23] ZHANG H， LI X， PENG G， et al. Glycoprotein E2 of classical swine fever virus expressed by baculovirus induces the protective immune responses in rabbits[J]. Vaccine， 2014，32（49）：6607-6613.

[24] GLADUE DP， BAKER-BRANSETTER R， HOLINKA L G， et al. Interaction of CSFV E2 protein with swine host factors as detected by yeast two-hybrid system[J]. PLoS One， 2014，9（1）：e85324.

[25] WU C W， CHIEN M S， HUANG C. Characterization of the swine U6 promoter for short hairpin RNA expression and its application to inhibition of virus replication[J]. J Biotechnol， 2013，168（1）：78-84.