蔣小強(qiáng)，邱紅輝，林長(zhǎng)平，何萍，符乃方，蔣盛軍*

(1.海南省東方市畜牧獸醫(yī)局，海南東方572600;2.中國(guó)熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院熱帶作物品種資源研究所，海南儋州571737)

利用中草藥紅茶菌微生態(tài)制劑輔助建立非免疫無(wú)疫區(qū)的試點(diǎn)試驗(yàn)研究

蔣小強(qiáng)1，邱紅輝1，林長(zhǎng)平1，何萍1，符乃方2，蔣盛軍2*

(1.海南省東方市畜牧獸醫(yī)局，海南東方572600;2.中國(guó)熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院熱帶作物品種資源研究所，海南儋州571737)

口蹄疫是國(guó)際上畜牧獸醫(yī)學(xué)界非常關(guān)注的一個(gè)動(dòng)物疫病。當(dāng)前口蹄疫的防控主要采用兩種手段，一種是疫苗注射；一種，是撲殺。在發(fā)達(dá)國(guó)家，口蹄疫的防控主要依靠是撲殺手段來(lái)建立非免疫無(wú)疫區(qū)。在發(fā)展中國(guó)家，主要依靠疫苗注射來(lái)防控口蹄疫。為了推進(jìn)我國(guó)的動(dòng)物疫病防控工作，我國(guó)計(jì)劃在一些物理隔離條件比較好、疫病防控較好的地區(qū)如海南島、遼東半島、膠東半島開(kāi)展口蹄疫非免疫無(wú)疫區(qū)的建設(shè)。2012年，國(guó)務(wù)院制定和頒布了國(guó)家中長(zhǎng)期動(dòng)物疫病防治規(guī)劃（2012-2020年），對(duì)于海南島、膠東半島等地計(jì)劃實(shí)現(xiàn)口蹄疫非免疫無(wú)疫區(qū)。在一些發(fā)達(dá)國(guó)家和地區(qū)，如日本、韓國(guó)、中國(guó)臺(tái)灣地區(qū)、英國(guó)、法國(guó)等歐洲國(guó)家，都在建立的口蹄疫非免疫無(wú)疫區(qū)發(fā)生口蹄疫，由于所有家畜都沒(méi)有注射口蹄疫，所有一旦發(fā)病損失慘重。

根據(jù)中草藥益生菌制劑理論，利用中草藥制劑形成的短效口蹄疫疫病防控效果，結(jié)合益生菌菌群持續(xù)產(chǎn)酸形成的長(zhǎng)效口蹄疫防控效果，兩者的有機(jī)結(jié)合產(chǎn)生的中草藥益生菌制劑使用可以起到相對(duì)長(zhǎng)效的口蹄疫防控效果，周期性間隔噴霧中草藥益生菌制劑，就也可以起到長(zhǎng)期高效防控口蹄疫的作用效果。

我國(guó)利用紅茶菌為益生菌制劑菌群，利用甘草、菊花、羅漢果、啤酒花等中草藥提取液為中草藥制劑，利用紅茶菌發(fā)酵上述中草藥提取液，制備獲得中草藥紅茶菌制劑。利用細(xì)胞、乳鼠以及豬為動(dòng)物模型，我們開(kāi)展了中草藥紅茶菌防控口蹄疫的體外和體內(nèi)的抗病毒試驗(yàn)，結(jié)果表明：中草藥紅茶菌在體外和體內(nèi)對(duì)口蹄疫病毒都有一定的殺滅和抑制作用，并且在大田試驗(yàn)中預(yù)防口蹄疫取得成功【1,2，3】。為了驗(yàn)證噴霧中草藥紅茶菌是否可以有效預(yù)防口蹄疫的感染，我們?cè)谀车亻_(kāi)展了中草藥紅茶菌預(yù)防口蹄疫的大田試驗(yàn)，預(yù)期為中草藥紅茶菌防控口蹄疫提供新的試驗(yàn)證據(jù)。

1 試驗(yàn)點(diǎn)的選取和動(dòng)物分組

由于是大田試驗(yàn)，為了保證具有口蹄疫病毒的感染源，我們選取一個(gè)以前發(fā)生過(guò)幾次口蹄疫疫情的豬場(chǎng)開(kāi)展試驗(yàn)，這樣盡可能確保豬場(chǎng)的豬群攜帶有口蹄疫病毒。為確保試驗(yàn)結(jié)果的客觀真實(shí)性，選取春季、冬季重復(fù)進(jìn)行兩次試驗(yàn)。至少選取體重、年齡相近（一月齡）的75頭未注射過(guò)口蹄疫疫苗的小豬作為樣本,采血進(jìn)行ELISA口蹄疫檢測(cè)，則將其隨機(jī)分為空白組、試驗(yàn)組和疫苗注射組，每組25頭豬。分別對(duì)每頭豬標(biāo)號(hào)，將其飼養(yǎng)于環(huán)境相似、距離盡量遠(yuǎn)的圈舍，分組后正常飼養(yǎng)兩周,使豬群適應(yīng)新的群體后再開(kāi)展試驗(yàn)。

2 給藥處理階段

三組豬群的飼養(yǎng)管理方式應(yīng)保持一致。對(duì)照組小豬在試驗(yàn)過(guò)程中不做任何處理；對(duì)處理組的豬口鼻噴濃度為20%的中草藥紅茶菌制劑100mL/頭，每周噴藥1次，連續(xù)噴藥4周；疫苗注射組小豬在試驗(yàn)開(kāi)始時(shí)注射口蹄疫疫苗。在試驗(yàn)期間觀察并記錄豬群的健康狀況。

3 試驗(yàn)檢測(cè)階段

在給藥處理前及試驗(yàn)結(jié)束后，每頭豬分別稱重并采血7-8mL,置于冰盒中帶回試驗(yàn)室分離血清。用口蹄疫病毒非結(jié)構(gòu)蛋白3ABC抗體檢測(cè)ELISA試劑盒（中國(guó)農(nóng)科院蘭州畜牧獸醫(yī)研究所研制）檢測(cè)試驗(yàn)豬是否存在口蹄疫感染情況?？谔阋卟《痉墙Y(jié)構(gòu)蛋白3ABC抗體檢測(cè)ELISA試劑盒用于檢測(cè)動(dòng)物血清中口蹄疫病毒非結(jié)構(gòu)蛋白抗體，適用于動(dòng)物群體感染狀況監(jiān)測(cè)和評(píng)估、發(fā)現(xiàn)早期隱性感染和進(jìn)出境檢疫，不受血清型的限制。

4 試驗(yàn)數(shù)據(jù)分析階段

通過(guò)SPSS統(tǒng)計(jì)分析軟件,分析各組之間的統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，以P＜0.05表示有顯著性統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

5 結(jié)果與討論

項(xiàng)目試驗(yàn)按計(jì)劃分兩次在某豬場(chǎng)展開(kāi)，每次75頭豬，分為試驗(yàn)組、疫苗組、空白組，每組25頭。用口蹄疫病毒非結(jié)構(gòu)蛋白3ABC抗體檢測(cè)ELISA試劑盒對(duì)150頭豬的血清標(biāo)本的分析后，判定統(tǒng)計(jì)結(jié)果見(jiàn)表。

由表中可知一期試驗(yàn)、二期試驗(yàn)都有陽(yáng)性樣本存在，推測(cè)原因是該豬場(chǎng)由于前幾年發(fā)生過(guò)口蹄疫疫情，環(huán)境中仍然有口蹄疫病毒存在，口蹄疫病毒未徹底凈化，導(dǎo)致試驗(yàn)期發(fā)生感染情況。一期樣本中感染率為24%，二期樣本感染率為5.3%，經(jīng)過(guò)卡方檢驗(yàn)得知，二期試驗(yàn)發(fā)病率極顯著低于一期試驗(yàn)（P=0.001），推測(cè)原因是豬場(chǎng)在一期試驗(yàn)檢測(cè)出陽(yáng)性樣本后，加強(qiáng)了日常消毒管理，并采用漏縫地板養(yǎng)殖，降低了感染率。

表1 豬試驗(yàn)前后血清檢測(cè)以及分析結(jié)果

表2 不同試驗(yàn)期判定結(jié)果分析

表3 三組預(yù)防口蹄疫效果分析

試驗(yàn)組、疫苗組、空白組預(yù)防口蹄疫成功的豬分別有42、45、41頭，失敗的分別有3、4、9頭。經(jīng)過(guò)卡方檢驗(yàn)試驗(yàn)組和疫苗組的預(yù)防效果差異不顯著（P=0.782）。試驗(yàn)組和空白組的預(yù)防效果雖未達(dá)到統(tǒng)計(jì)學(xué)意義上的顯著水平（P=0. 097＞0.05），但從數(shù)據(jù)上可以看出紅茶菌制劑確實(shí)對(duì)口蹄疫有一定的預(yù)防作用，兩組間差異已接近顯著水平。疫苗組和空白組的預(yù)防效果差異也不顯著（P=0.147）。由于口蹄疫疫苗對(duì)口蹄疫的預(yù)防作用是確信已知的，之所以出現(xiàn)統(tǒng)計(jì)學(xué)上的不顯著狀況，推測(cè)原因是試驗(yàn)樣本量偏小，造成統(tǒng)計(jì)分析的結(jié)果發(fā)生了偏差。

6 試驗(yàn)組和疫苗組治療口蹄疫效果分析

組別成效合計(jì)治療成功治療失敗試驗(yàn)組505疫苗組101

一期試驗(yàn)中，由試驗(yàn)前陽(yáng)性的轉(zhuǎn)為試驗(yàn)后陰性的，即口蹄疫痊愈的豬，試驗(yàn)組有5頭，疫苗組有1頭，兩組中患病的豬在試驗(yàn)結(jié)束后都已痊愈。

7 小結(jié)

中草藥紅茶菌具有多種抗口蹄疫的作用機(jī)制，對(duì)豬口鼻噴霧中草藥紅茶菌，可以形成預(yù)防口蹄疫的三道防線：第一道防線，噴霧的中草藥紅茶菌可以分散到整個(gè)豬圈，殺滅和抑制豬圈以及周圍環(huán)境的口蹄疫的存活和繁殖。這個(gè)殺滅和抑制機(jī)制，中草藥提取液可以起到一定的短時(shí)作用，更重要的時(shí)紅茶菌中的醋酸菌和酵母等復(fù)合益生菌可以持續(xù)產(chǎn)生大量有機(jī)酸拮抗口蹄疫病毒。口蹄疫病毒是一個(gè)對(duì)酸非常敏感的病毒。其次，對(duì)豬口鼻噴霧中草藥紅茶菌可以同時(shí)進(jìn)入消化道和呼吸道，尤其是呼吸道。呼吸道是口蹄疫感染豬的主要途徑。因此，中草藥紅茶菌可以殺滅或抑制進(jìn)入消化道和呼吸道的口蹄疫病毒，形成預(yù)防口蹄疫感染的第二道防線。第三道防線，對(duì)豬口鼻噴霧的時(shí)候，豬會(huì)從口腔吸入大量中草藥紅茶菌，中草藥紅茶菌的有效抗病毒成分會(huì)進(jìn)入血液，在體內(nèi)起到殺滅和抑制口蹄疫病毒作用，從而形成預(yù)防口蹄疫的第三道防線。外界漂移進(jìn)入的口蹄疫感染源，要進(jìn)入利用中草藥紅茶菌防控的豬場(chǎng)，必須通過(guò)這三道防線，這種感染幾率是非常小的。所以，利用噴霧中草藥紅茶菌可以有效預(yù)防豬、牛等家畜的口蹄疫。本試驗(yàn)的結(jié)果也再次證明這一點(diǎn)。由于數(shù)量相對(duì)不夠大，進(jìn)一步擴(kuò)大豬群的試驗(yàn)規(guī)模，將會(huì)取得更有信服的數(shù)據(jù)。

[1]NaifangFu,Juncai Wu,Lv Lv,Jijun He,Shengjun Jiang. Anti-foot-and-mouth disease virus effects ofChinese herbal kombucha in vivo.Brazilian Journal of Microbiology.2015;46(4):1245-55.

[2]符乃方，吳俊才，符啟俊，呂律，何繼軍，李開(kāi)綿，葉劍秋，蔣盛軍，蔣小強(qiáng)，邱紅輝，高李澤，何萍，謝崢嶸，陳吉雄.中草藥紅茶菌的制備及其體外抗口蹄疫病毒活性.安徽農(nóng)業(yè)科學(xué),，42(17):5500－5502,2014

[3]符乃方，吳俊才，符啟俊，呂律，何繼軍，李開(kāi)綿，葉劍秋，蔣盛軍，蔣小強(qiáng)，邱紅輝，高李澤，何萍，謝崢嶸，陳吉雄.中草藥紅茶菌的制備及其體內(nèi)抗口蹄疫病毒活性.安徽農(nóng)業(yè)科學(xué),，42(18):5892－5894，5908,2014

S853.71

B

1003-8655（2016）06-0004-02

*通訊作者，蔣盛軍，博士，副研究員，18708938111@139.com