吳燕如 趙婉彬 于俊巖

肝癌是一種常見(jiàn)的惡性腫瘤，在全球癌癥中發(fā)病率居第6 位，死亡率居第3 位[1]。肝細(xì)胞癌（Hepatocellular carcinoma，HCC）作為肝癌的主要組織學(xué)類(lèi)型，占肝癌診斷和死亡的絕大多數(shù)[2]。近年來(lái)HCC 的診斷和治療雖取得了許多進(jìn)展，但患者的生存率仍然很低[3]。因此，尋找HCC 的生物標(biāo)志物幫助指導(dǎo)個(gè)體化預(yù)后和治療至關(guān)重要。

銅死亡（Cuprotosis）是2022 年3 月由Tsvetkov等[4]提出的一種新型細(xì)胞死亡方式，由銅離子與三羧酸循環(huán)脂化組分的直接結(jié)合所介導(dǎo)。這一結(jié)合導(dǎo)致脂?；鞍拙奂丸F硫簇蛋白丟失，進(jìn)而導(dǎo)致蛋白質(zhì)毒性應(yīng)激，最終誘導(dǎo)細(xì)胞死亡，為腫瘤治療提供了新思路。

長(zhǎng)鏈非編碼RNA（long non-coding RNA，lncRNA）是一種長(zhǎng)度>200 個(gè)核苷酸且一般不具備蛋白編碼能力的 RNA 分子。lncRNA 在表觀遺傳修飾、轉(zhuǎn)錄及轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)節(jié)基因表達(dá)[5]。研究顯示，lncRNA在HCC 的發(fā)生發(fā)展中起著至關(guān)重要的作用[6]。但銅死亡相關(guān)lncRNA 在HCC 中的作用尚不清楚。本研究基于癌癥基因組圖譜（The Cancer Genome Atlas，TCGA）數(shù)據(jù)庫(kù)，通過(guò)Cox 回歸和LASSO 分析構(gòu)建銅死亡相關(guān)lncRNA 預(yù)后風(fēng)險(xiǎn)模型并對(duì)其預(yù)測(cè)效能進(jìn)行評(píng)估。

1 材料與方法

1.1 數(shù)據(jù)下載與處理從TCGA 數(shù)據(jù)庫(kù)（https：//portal.gdc.cancer.gov/）下載HCC 轉(zhuǎn)錄組、基因突變和相應(yīng)的臨床信息數(shù)據(jù)并整理，根據(jù)人類(lèi)基因注釋文件提取lncRNA。

1.2 銅死亡相關(guān)lncRNA 的篩選通過(guò)文獻(xiàn)檢索獲得19 個(gè)銅死亡相關(guān)基因[4，7～9]，采用Pearson 相關(guān)性分析篩選銅死亡相關(guān)lncRNA（Pearson 相關(guān)系數(shù)>0.4，P<0.001）。

1.3 構(gòu)建預(yù)后風(fēng)險(xiǎn)模型及評(píng)估采用 R 軟件“caret”包將樣本按1:1 分為訓(xùn)練集和驗(yàn)證集。在訓(xùn)練集中采用Cox 回歸分析和LASSO 回歸構(gòu)建預(yù)后風(fēng)險(xiǎn)模型。風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分公式如下：

β 表示回歸系數(shù)，Exp 表示lncRNA 表達(dá)水平，n 為參與模型構(gòu)建的lncRNA 數(shù)量。根據(jù)風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分的中位值，將訓(xùn)練集和驗(yàn)證集患者分為高、低風(fēng)險(xiǎn)組，采用R 軟件“survival”包繪制Kaplan-Meier 生存曲線(xiàn)，“survival ROC”包繪制受試者工作特征曲線(xiàn)（Receiver operating characteristic curve，ROC），計(jì)算曲線(xiàn)下面積（Area under curve，AUC）。使用R 軟件“scatterplot3d”包繪制主成分分析（Principal component analysis，PCA）圖評(píng)估高、低風(fēng)險(xiǎn)組之間的潛在差異。

1.4 構(gòu)建列線(xiàn)圖將臨床病理特征與風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分納入單因素和多因素Cox 回歸分析，評(píng)估影響HCC 患者預(yù)后的獨(dú)立因素。使用R 軟件構(gòu)建列線(xiàn)圖，預(yù)測(cè)和分析HCC 患者1、3、5 年生存率。校正曲線(xiàn)用于檢驗(yàn)列線(xiàn)圖的準(zhǔn)確性。

1.5 功能富集分析采用 R 軟件“ limma”包，以|log2FC|>1，F(xiàn)DR<0.05 為標(biāo)準(zhǔn)，篩選高、低風(fēng)險(xiǎn)組差異表達(dá)基因并繪制熱圖。使用“clusterProfiler”包進(jìn)行基因本體論（Gene ontology，GO）富集分析和京都基因與基因組百科全書(shū)（Kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG）通路分析。基于單樣本基因集富集分析（single sample gene set enrichment analysis，ssGSEA）對(duì)免疫細(xì)胞的浸潤(rùn)及功能進(jìn)行評(píng)估。

1.6 計(jì)算腫瘤突變負(fù)荷（Tumor mutational burden，TMB）評(píng)分使用R 軟件“maftools”包對(duì)基因突變數(shù)據(jù)進(jìn)行分析繪制瀑布圖?！?limma”、“ggpubr”包用于繪制高、低風(fēng)險(xiǎn)組小提琴圖。根據(jù)中位截?cái)嘀祵CC 患者分為高、低TMB 組，使用“survival”包繪制生存曲線(xiàn)。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析采用R 軟件4.2.1 進(jìn)行Pearson 相關(guān)性分析、Cox 回歸、LASSO 回歸、Kaplan-Meier曲線(xiàn)分析。計(jì)數(shù)資料采用χ2檢驗(yàn)，計(jì)量資料采用Wilcoxon 秩和檢驗(yàn)。P<0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 銅死亡相關(guān)lncRNA 的鑒定從374 例HCC 組織樣本和50 例正常肝臟組織樣本RNA 測(cè)序數(shù)據(jù)中提取出16 773 個(gè)lncRNA，通過(guò)共表達(dá)分析獲取381 個(gè)銅死亡相關(guān)lncRNA，見(jiàn)圖1。

圖1 銅死亡相關(guān)基因與銅死亡相關(guān)lncRNA ?；鶊D

2.2 構(gòu)建銅死亡相關(guān)lncRNA 預(yù)后風(fēng)險(xiǎn)模型及評(píng)估將370 例有完整信息的樣本分為訓(xùn)練集（185 例）和驗(yàn)證集（185 例），χ2檢驗(yàn)結(jié)果顯示兩組間一般資料比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05），見(jiàn)表1。在訓(xùn)練集中行單因素Cox 回歸分析獲得41 個(gè)顯著影響預(yù)后的銅死亡相關(guān)lncRNA（圖2A），納入LASSO 回歸篩選出16 個(gè)lncRNA（圖2B），多 因素Cox 回歸分析進(jìn)一步確定7 個(gè)基因構(gòu)建風(fēng)險(xiǎn)模型，其中AC105020.1、CHASERR 是HCC 患者預(yù)后保護(hù)因素，F(xiàn)OXD2-AS1、MIR4435-2HG、NRAV、RNF216P1、SNHG3 是預(yù)后危險(xiǎn)因素。根據(jù)風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分中位值將訓(xùn)練集和驗(yàn)證集患者分為高、低風(fēng)險(xiǎn)組，生存相關(guān)圖形（圖3）顯示高風(fēng)險(xiǎn)組HCC 患者的預(yù)后較低風(fēng)險(xiǎn)組差（P<0.05）。ROC 曲線(xiàn)結(jié)果顯示訓(xùn)練集（圖4A）1、3、5 年的AUC 值分別為0.819、0.822、0.814，驗(yàn)證集（圖4B）AUC 值為0.737、0.651、0.659。整個(gè)測(cè)試集中風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分的AUC 值最高，提示風(fēng)險(xiǎn)模型較臨床病理特征可更好地預(yù)測(cè)HCC 患者預(yù)后（圖4C）。PCA 圖顯示所有基因（圖4D）、銅死亡相關(guān)基因（圖4E）、銅死亡相關(guān)lncRNA 的表達(dá)（圖4F）均未能區(qū)分出高、低風(fēng)險(xiǎn)組的差異。HCC患者根據(jù)參與模型構(gòu)建的7 個(gè)銅死亡相關(guān)lncRNA的表達(dá)情況被分為兩個(gè)不同的集群（圖4G）。

表1 訓(xùn)練集和驗(yàn)證集HCC 患者的臨床特征[n（%）]

圖2 7 個(gè)銅死亡相關(guān)lncRNA 的篩選

圖3 訓(xùn)練集和驗(yàn)證集高、低風(fēng)險(xiǎn)組生存相關(guān)圖形

圖4 ROC 曲線(xiàn)及PCA 圖

2.3 篩選HCC 患者預(yù)后獨(dú)立危險(xiǎn)因素單因素和多因素Cox 回歸分析（圖5A、圖5B）結(jié)果顯示，風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分和病理分期為影響HCC 患者預(yù)后的獨(dú)立危險(xiǎn)因素（P<0.05）。結(jié)合臨床病理特征和風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分建立列線(xiàn)圖（圖5C）預(yù)測(cè)HCC 患者1、3、5 年的生存率。校正曲線(xiàn)（圖5D）證實(shí)了預(yù)后模型的預(yù)測(cè)能力。

圖5 風(fēng)險(xiǎn)模型驗(yàn)證

2.4 GO 富集分析、KEGG 信號(hào)通路分析及免疫功能分析對(duì)高、低風(fēng)險(xiǎn)組基因表達(dá)進(jìn)行分析，篩選出482 個(gè)差異表達(dá)基因。GO 富集分析結(jié)果顯示，差異表達(dá)基因主要涉及細(xì)胞器裂變、核分裂、有絲分裂等生物學(xué)過(guò)程，主要富集的細(xì)胞成分包括染色體、紡錘體、凝聚染色體，分子功能主要富集在微管結(jié)合、血紅素結(jié)合、四吡咯結(jié)合（圖6A）。KEGG 信號(hào)通路分析結(jié)果顯示差異表達(dá)基因主要參與細(xì)胞周期、細(xì)胞衰老、卵母細(xì)胞減數(shù)分裂等通路（圖6B）。免疫功能分析（圖6C）結(jié)果顯示，樹(shù)突狀細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、肥大細(xì)胞、調(diào)節(jié)性T 細(xì)胞、Ⅱ型干擾素和MHC Ⅰ類(lèi)在高、低風(fēng)險(xiǎn)組中差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，表明銅死亡可能與腫瘤免疫有關(guān)。

圖6 功能富集分析

2.5 評(píng)估高、低風(fēng)險(xiǎn)組TMB 整理HCC 患者基因突變數(shù)據(jù)，計(jì)算TMB 評(píng)分。圖7A 所示高風(fēng)險(xiǎn)組突變負(fù)荷比低風(fēng)險(xiǎn)組高。瀑布圖（圖7B、圖7C）結(jié)果顯示高、低風(fēng)險(xiǎn)組突變率分別為85.95%、76.14%，突變頻率最高的基因分別為T(mén)P53、CTNNB1。高、低TMB 組生存曲線(xiàn)結(jié)果顯示高TMB 組患者生存率低（圖7D）。聯(lián)合生存分析結(jié)果顯示TMB 和風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分對(duì)HCC 患者生存期有顯著影響（圖7E）。

圖7 TMB 分析

3 討論

銅死亡是新發(fā)現(xiàn)的一種程序性細(xì)胞死亡方式，參與腫瘤的發(fā)生和進(jìn)展。lncRNA 可在癌癥發(fā)展過(guò)程中調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖、凋亡、侵襲、轉(zhuǎn)移及代謝，參與重塑腫瘤微環(huán)境[10]。目前很少有研究探索銅死亡相關(guān)lncRNA 在HCC 中的作用。

本研究中，首先我們通過(guò)共表達(dá)分析得到與銅死亡相關(guān)的lncRNA，并進(jìn)行單因素和多因素 Cox回歸分析及LASSO 回歸分析，建立了銅死亡相關(guān)lncRNA 預(yù)后風(fēng)險(xiǎn)模型。然后，通過(guò)生存分析、ROC曲線(xiàn)、PCA 圖評(píng)估了該模型的準(zhǔn)確性，結(jié)果顯示高風(fēng)險(xiǎn)組患者具有更差的預(yù)后，該模型可以有效預(yù)測(cè)HCC 患者1、3、5 年生存率，AUC 值均大于0.65。PCA 圖直觀地顯示了高、低風(fēng)險(xiǎn)組之間的差異。隨后，采用單因素和多因素Cox 回歸分析進(jìn)一步探討了臨床病理特征和風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分對(duì)HCC 預(yù)后的影響，結(jié)果顯示風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分、病理分期是HCC 的獨(dú)立預(yù)后因素。另外，利用列線(xiàn)圖構(gòu)建個(gè)體化預(yù)后預(yù)測(cè)模型，校準(zhǔn)曲線(xiàn)顯示實(shí)際和預(yù)測(cè)的生存期高度一致?；谏鲜鼋Y(jié)果，我們認(rèn)為本研究中構(gòu)建的預(yù)后風(fēng)險(xiǎn)模型是HCC 患者有效的預(yù)后指標(biāo)。此外，為了探索差異表達(dá)基因的潛在作用機(jī)制，我們進(jìn)行了功能富集分析。GO 和KEGG 分析表明，這些差異基因主要富集在細(xì)胞周期、細(xì)胞衰老中。免疫功能分析結(jié)果顯示，在高、低風(fēng)險(xiǎn)組中樹(shù)突狀細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、肥大細(xì)胞、調(diào)節(jié)性T 細(xì)胞、Ⅱ型干擾素和MHC Ⅰ類(lèi)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，表明銅死亡可能與腫瘤免疫有關(guān)。最后，通過(guò)對(duì)基因突變數(shù)據(jù)進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn)高風(fēng)險(xiǎn)組TMB 高于低風(fēng)險(xiǎn)組，提示免疫治療可能對(duì)HCC 高風(fēng)險(xiǎn)組患者更有益。

納入模型的7 個(gè)lncRNA 中大部分已被證實(shí)與HCC 的進(jìn)展相關(guān)。文獻(xiàn)報(bào)道，F(xiàn)OXD2-AS1 通過(guò)調(diào)控miR-206/MAP3K1 軸、miR-185/AKT 軸從而促進(jìn)HCC 的進(jìn)展[11，12]。MIR4435-2HG 可以上調(diào)B3GNT5、miRNA-487a 的表達(dá)進(jìn)而誘導(dǎo)肝癌的發(fā)生[13，14]。NRAV 通過(guò)靶向miR-199a-3p 調(diào)控CISD2 進(jìn)而激活Wnt/β-catenin 信號(hào)通路，從而導(dǎo)致肝癌細(xì)胞增殖和侵襲[15]。SNHG3 過(guò)表達(dá)可以促進(jìn)HCC 的增殖、遷移和上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化，通過(guò)miR-326/SMAD3/ZEB1軸促進(jìn)肝細(xì)胞腫瘤的進(jìn)展[16]。我們的研究結(jié)果顯示，F(xiàn)OXD2-AS1、MIR4435-2HG、NRAV、SNHG3在高風(fēng)險(xiǎn)組中高表達(dá)，與HCC 患者生存狀態(tài)差有關(guān)，這與以往研究結(jié)果一致。另有文獻(xiàn)報(bào)道，CHASERR 的缺失使CHD2 mRNA 和蛋白質(zhì)水平大幅增加，進(jìn)而通過(guò)抑制高表達(dá)基因下游的啟動(dòng)子導(dǎo)致轉(zhuǎn)錄干擾，影響小鼠存活時(shí)間[17]。本研究中CHASERR 作為低風(fēng)險(xiǎn)基因，有利于HCC 患者預(yù)后，其作用機(jī)制有待進(jìn)一步研究。

綜上，本研究構(gòu)建了一個(gè)包含7 個(gè)銅死亡相關(guān)lncRNA 的預(yù)后模型，具有良好的預(yù)測(cè)效能，Cox 回歸分析結(jié)果顯示，風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分與病理分期是HCC 患者預(yù)后的獨(dú)立危險(xiǎn)因素，為HCC 患者個(gè)體化治療提供參考。本研究有一定的局限性，該風(fēng)險(xiǎn)模型是基于公開(kāi)數(shù)據(jù)庫(kù)創(chuàng)建的，且在同一個(gè)數(shù)據(jù)庫(kù)中進(jìn)行驗(yàn)證，缺乏新的臨床樣本和數(shù)據(jù)，需在臨床試驗(yàn)中進(jìn)一步驗(yàn)證。