陳廣燦，洪良利，黃杰雄，謝澳斯，郭 丹，劉淑慧，*（. 汕 頭大學(xué)醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院胃腸外科，廣東　 汕頭　 5504；.汕頭大學(xué)醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院病理科，廣東　 汕頭　 5504；.汕頭大學(xué)醫(yī)學(xué)院病理教研室，廣東　 汕頭　 5504）

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廣東潮汕賁門癌組織中GST-π 和P-gp的表達(dá)及其臨床病理意義

陳廣燦1，洪良利2，黃杰雄2，謝澳斯1，郭 丹3，劉淑慧3，*
（1. 汕 頭大學(xué)醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院胃腸外科，廣東 汕頭 515041；2.汕頭大學(xué)醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院病理科，廣東 汕頭 515041；3.汕頭大學(xué)醫(yī)學(xué)院病理教研室，廣東 汕頭 515041）

【摘要】目的： 探討廣東潮汕賁門癌患者癌組織中谷胱甘肽-巰基-轉(zhuǎn)移酶-π(GST-π)和P-糖蛋白(P-gp)的表達(dá)情況及二者與臨床病理指標(biāo)的關(guān)系。方法：采用免疫組織化學(xué)法檢測87例賁門癌組織GST-π和P-gp的表達(dá)情況。根據(jù)表達(dá)情況，利用Youden index法繪制患者的年齡和腫瘤最長徑ROC曲線，并將患者分成高表達(dá)組和低表達(dá)組比較其與臨床病理指標(biāo)的關(guān)系。結(jié)果：賁門癌組織中GST-π和P-gp表達(dá)陽性率分別為85.05%和93.1%。根據(jù)ROC曲線的結(jié)果確定年齡和腫瘤最長徑分組的界值。賁門癌GST-π表達(dá)與脈管是否浸潤有關(guān)，有脈管浸潤者高表達(dá)率明顯高于無脈管浸潤者(P<0.01)；P-gp的表達(dá)與年齡和組織學(xué)類型相關(guān)，患者年齡增大表達(dá)率增高(P<0.05)，黏液腺癌的高表達(dá)率明顯高于非黏液腺癌(P<0.05)。賁門癌GST-π的表達(dá)與P-gp的表達(dá)呈正相關(guān)(r=0.828，P<0.01)。結(jié)論：GST-π和P-gp在潮汕賁門癌組織中陽性表達(dá)率高，兩者的表達(dá)呈正相關(guān)。GST-π高表達(dá)與脈管浸潤相關(guān)，P-gp高表達(dá)與高齡患者和賁門黏液腺癌相關(guān)。

【關(guān)鍵詞】賁門癌；谷胱甘肽-巰基-轉(zhuǎn)移酶-π；P-糖蛋白；免疫組織化學(xué)

作者信息： 陳廣燦，E-mail：515776718@qq.com。*通信作者，劉淑慧，E-mail：liushuhuistu@126.com

Expression of GST-π and P-gp in gastric cardia cancer and their clinical significance in the Chaoshan high risk area

CHEN Guangcan1，HONG Liangli2，HUANG Jiexiong2，XIE Aosi1，GUO Dan3，LIU Shuhui3，*
(1. Department of Gastrointestinal Surgery, the First Affiliated Hospital of Shantou University Medical College, Shantou 515041; 2. Department of Pathology, the First Affiliated Hospital of Shantou University Medical College, Shantou 515041; 3. Department of Pathology, Shantou University Medical College, Shantou 515041, Guangdong, China)

【ABSTRACT】OBJECTIVE: To study the expression of glutathione-s-transferase-π (GST-π) and P-glycoprotein (P-gp) in gastric cardia the cancer in the Chaoshan high risk area and their relationships with clinical pathological characteristics of gastric cardia cancer. METHODS：Immunohistochemical staining was used to detect the expression of GST-π and P-gp in 87 c ases o f g astric c ardia c ancer. T he c orrelations b etween G ST-π，P-gp e xpression a nd t he c linical c haracteristics o f g astric cardia cancer were analyzed. ROC curves of age and maximum tumor diameter were plotted. RESULTS：The positive expression rate of GST-π and P-gp in gastric cardia cancer were 85.05% and 93.1%，respectively. The cutoff points of grouping f or a ge a nd m aximum t umor d iameter d epended u pon t he r esults o f R OC c urves. T he e xpression o f G ST-π w as r elated to lymph-vascular space invasion. The expression rate of GST-π of patients with lymph-vascular space invasion was significantly higher than that without the invasion(P<0.05). Expression of P-gp was related to the age of patients and the histological type of gastric cardia cancer. Cancer tissues from elder patients and mucinous adenocarcinomas showed significantly higher rate of expression of P-gp (P<0.05). GST-π expression was positively correlated to P-gp expression (P<0.01). CONCLUSION：GST-π and P-gp expression were high in gastric cardia cancer in the Chaoshan area. Their expression was positively correlated. High GST-π expression was associated with lymph-vascular space invasion. High P-gp expression w as a ssociated w ith e lder p atients a nd m ucinous a denocarcinoma t issues.

【KEY WORDS】gastric cardia cancer；glutathione-s-transferase-π；P-glycoprotein；immunohistochemistry

廣東潮汕地區(qū)是中國南方沿海的食管癌、賁門癌高發(fā)區(qū)，與遠(yuǎn)側(cè)胃癌發(fā)病率下降不同，近年賁門癌的發(fā)病率呈上升趨勢，且研究發(fā)現(xiàn)賁門癌的臨床病理特征不同于遠(yuǎn)側(cè)胃癌，應(yīng)作為獨(dú)立疾病研究[1-2]。潮汕高發(fā)區(qū)賁門癌患者就診時(shí)多數(shù)已處于中晚期，主要治療手段是手術(shù)治療再輔以化療和放療，但是賁門癌化療的總體效率不高，其中腫瘤細(xì)胞對抗腫瘤藥物的多藥耐藥性(multi-drug resistance，MDR)是導(dǎo)致腫瘤化療失敗的重要因素[3]。研究認(rèn)為多藥耐藥相關(guān)基因谷胱甘肽-巰基-轉(zhuǎn)移酶-π(glutathione S-transferase-π，GST-π) 和P-糖蛋白(P-glucoprotein，P-gp)是介導(dǎo)多種腫瘤多藥耐藥的重要機(jī)制[4]。潮汕高發(fā)區(qū)賁門癌發(fā)病具有明顯的家族聚集現(xiàn)象，高發(fā)區(qū)人群的個(gè)體特性可能影響賁門癌的化療效果。高發(fā)區(qū)賁門癌多藥耐藥基因表達(dá)情況的相關(guān)研究較少，本研究采用免疫組織化學(xué)方法檢測GST-π和P-gp在賁門癌組織的表達(dá)情況，并分析其臨床病理意義，為探討它們在高發(fā)區(qū)賁門癌化療耐藥中的作用提供依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 臨床資料

選取汕頭大學(xué)醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院2007年9月-2014年10月收治進(jìn)行外科手術(shù)治療未曾進(jìn)行化療的賁門癌病例87例，將選取固定好的腫瘤標(biāo)本行10%中性福爾馬林液固定，常規(guī)脫水、透明、浸蠟、石蠟包埋，制成蠟塊，4 μm連續(xù)組織切片，采用常規(guī)HE染色，組織病理學(xué)確診為賁門癌。建立患者臨床病理資料數(shù)據(jù)庫，其中男性70例，女性17例，年齡在50～79歲，平均年齡63.2歲。

1.2 試劑和方法

1.2.1 試劑 GST-π、P-gP鼠抗人單克隆抗體、免疫組化二步法試劑盒和DAB顯色劑均購自福州邁新試劑公司。

1.2.2 免疫組化染色 采用EnVision二步法對賁門癌組織切片進(jìn)行免疫組化染色。微波修復(fù)，一抗?jié)饪s液按1∶50稀釋成工作液，4 ℃冰箱過夜，滴加辣根過氧化物酶標(biāo)記的二抗(Ig-HRP)，室溫孵育30 min，DAB顯色。用福州邁新試劑公司提供的陽性對照片作陽性對照；用PBS代替一抗作陰性對照。

1.3 結(jié)果判定

顯微鏡下觀察，GST-π陽性表達(dá)定位于細(xì)胞漿和細(xì)胞核，P-gp陽性表達(dá)定位于細(xì)胞膜和細(xì)胞漿，陽性產(chǎn)物均為黃色或棕黃色顆粒。每張切片在200倍顯微鏡下隨機(jī)選取10個(gè)視野，按陽性細(xì)胞所占比例及染色強(qiáng)度進(jìn)行分級(jí)：陽性細(xì)胞數(shù)<10%、細(xì)胞無染色，為陰性(-)；陽性細(xì)胞數(shù)≥10%~25%、細(xì)胞染色淡黃色，為弱陽性(+)；陽性細(xì)胞數(shù)≥25%~75%、細(xì)胞染色黃色，為陽性(++)；陽性細(xì)胞數(shù)≥75%、細(xì)胞染色為棕黃色或褐色，為強(qiáng)陽性(+++)。在統(tǒng)計(jì)學(xué)分析時(shí)，將染色結(jié)果分成兩組進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，分別是低表達(dá)組(-和+)以及高表達(dá)組(++和+++)。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 16.0統(tǒng)計(jì)軟件對所得數(shù)據(jù)進(jìn)行分析。GST-π和P-gp表達(dá)與臨床病理資料之間的關(guān)系分析采用χ2檢驗(yàn)。GST-π和P-gp表達(dá)的相關(guān)性采用Spearman等級(jí)相關(guān)分析。繪制患者的年齡和腫瘤最長徑ROC曲線(receiver operating characteristic curve)以確定按年齡和腫瘤最長徑進(jìn)行分組的界值。以α=0.05為檢驗(yàn)水準(zhǔn)。

2 結(jié) 果

2.1 年齡與腫瘤最長徑ROC曲線繪制

利用尤登指數(shù)(Youden index)法根據(jù)患者GST-π和P-gp的表達(dá)情況，分別繪制患者的年齡和腫瘤最長徑ROC曲線。GST-π的ROC曲線結(jié)果顯示當(dāng)患者年齡>66歲、腫瘤最長徑>3 cm時(shí)，尤登指數(shù)分別是0.14和0.16為最大值；P-gp的ROC曲線結(jié)果顯示當(dāng)患者年齡>63歲、腫瘤最長徑>4.5 cm時(shí)，尤登指數(shù)分別是0.22和0.14為最大值。利用這4個(gè)切點(diǎn)值分組進(jìn)行年齡和腫瘤最長徑的卡方檢驗(yàn)。

2.2 GST-π和P-gp在賁門癌組織中的表達(dá)及與臨床病理指標(biāo)的相關(guān)性分析

GST-π和P-gp在賁門癌組織中分級(jí)+以上的標(biāo)本分別為85.05%和93.1%，分級(jí)++以上的(高表達(dá))分別為52.87%(46/87)和62.01%(54/87)。圖1示賁門癌組織GST-π細(xì)胞漿核染色情況，圖2示賁門癌組織P-gp細(xì)胞漿膜染色情況。賁門癌GST-π表達(dá)與脈管是否浸潤有關(guān)，有脈管浸潤者GST-π的高表達(dá)率明顯高于無脈管浸潤者(P=0.002)，而與其他臨床病理指標(biāo)無顯著相關(guān)關(guān)系(P>0.05)。P-gp的表達(dá)與年齡和組織學(xué)類型相關(guān)，隨著患者年齡增大高表達(dá)率增加(P=0.049)，黏液腺癌的高表達(dá)率明顯高于非黏液腺癌(P=0.025)，而與其他臨床病理指標(biāo)無顯著相關(guān) ( P>0.05)，相關(guān)分析結(jié)果見表1~3。

2.3 賁門癌GST-π和P-gp表達(dá)的相關(guān)性分析

賁門癌組織中GST-π和P-gp均高表達(dá)的病例有32例，GST-π和P-gp均低表達(dá)的病例有19例，GST-π高表達(dá)P-gp低表達(dá)的病例有14例，GST-π低表達(dá)P-gp高表達(dá)的病例有22例。Spearman等級(jí)相關(guān)分析示GST-π 和P-gp表達(dá)具有相關(guān)性(r=0.828，P=0.000)。

A：陰性表達(dá)(-)；B：弱陽性表達(dá)(+)；C：陽性表達(dá)(++)；D：強(qiáng)陽性表達(dá)(+++).圖1 賁門癌組織中GST-π的表達(dá)(×400)

A：陰性表達(dá)(-)；B：弱陽性表達(dá)(+)；C：陽性表達(dá)(++)；D：強(qiáng)陽性表達(dá)(+++).圖2 賁門癌組織中P-gp的表達(dá)(×400)

表1 年齡和腫瘤最長徑與GST-π表達(dá)的關(guān)系

表2 年齡和腫瘤最長徑與P-gp表達(dá)的關(guān)系

表3 GST-π和P-gp的表達(dá)與臨床病理指標(biāo)的關(guān)系

3 討 論

賁門癌患者就診時(shí)多數(shù)伴有浸潤、轉(zhuǎn)移等臨床特征，因此在手術(shù)治療的同時(shí)，進(jìn)行有全身治療作用的化學(xué)治療也非常重要。但有相當(dāng)一部分患者對化療藥物不敏感，研究認(rèn)為90%的化療失敗和腫瘤的多藥耐藥有關(guān)[5]。腫瘤的多藥耐藥是指腫瘤細(xì)胞可耐受結(jié)構(gòu)、功能和殺傷機(jī)制不同的多種藥物的致死劑量[3]。研究發(fā)現(xiàn) GST-π、P-gp在多種惡性腫瘤的耐藥性上起重要作用。

GST-π是一種多功能的二聚體蛋白，與機(jī)體的解毒作用相關(guān)，通過促進(jìn)藥物與谷胱甘肽結(jié)合，增加藥物的水溶性使其易于從細(xì)胞內(nèi)排出，從而降低抗腫瘤藥物對腫瘤細(xì)胞的殺傷作用，導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞耐藥[6-7]。GST-π陽性表達(dá)的腫瘤，其耐藥的主要藥物有順鉑、阿霉素、氟尿嘧啶、絲裂霉素等[3]。瘤細(xì)胞GST-π的含量可作為耐藥性產(chǎn)生的一個(gè)檢測指標(biāo)。P-gp是最先被發(fā)現(xiàn)的與腫瘤多藥耐藥相關(guān)的三磷酸腺苷結(jié)合跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白超家族成員[6]。P-gp是一種能量依賴性的跨膜藥物輸出泵，既可與抗腫瘤藥物結(jié)合又可以與ATP結(jié)合，依賴ATP提供的能量將藥物從胞內(nèi)泵出胞外，降低化療藥物在細(xì)胞內(nèi)的濃度，導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞出現(xiàn)耐藥[8]。 研究表明，P-gp陽性表達(dá)的腫瘤耐藥的主要藥物是長春花堿、長春新堿、蒽環(huán)類藥物和紫杉類藥物[7]。

研究表明腫瘤組織中P-gp與GST-π表達(dá)越高，患者化療效果越差。關(guān)于P-gp和GST-π表達(dá)與賁門癌化療效果關(guān)系的研究較少。為了研究P-gp和GST-π與賁門癌患者化療效果的關(guān)系，并最終用于指導(dǎo)賁門癌患者的化療方案的制訂，有必要充分研究它們與賁門癌臨床病理特征的關(guān)系，但是目前相關(guān)研究較少，且尚未有關(guān)于潮汕高發(fā)區(qū)賁門癌的研究報(bào)道。本研究結(jié)果顯示賁門癌組織中GST-π和P-gp表達(dá)陽性率分別為85.05%和93.1%。較以往在賁門癌、胃癌組織中檢測到的結(jié)果稍高[6，9-10]。Ye等[11-12]研究認(rèn)為賁門癌GST-π的陽性表達(dá)率要高于其他部位的胃癌。本結(jié)果提示未經(jīng)化學(xué)治療的賁門癌組織中已存在GST-π和P-gp的高表達(dá)，與大多數(shù)癌組織的研究結(jié)果一致，但是癌組織高表達(dá)GST-π和P-gp的機(jī)制尚不清楚。本研究發(fā)現(xiàn)，GST-π的表達(dá)與脈管是否浸潤有關(guān)，P-gp的表達(dá)與賁門癌患者的年齡和病理類型有關(guān)，與賁門癌其他病理學(xué)特征未發(fā)現(xiàn)相關(guān)性(P>0.05)。關(guān)于GST-π和P-gp與腫瘤臨床病理特征的關(guān)系還存在爭議。史宏?duì)N等[13]認(rèn)為賁門癌分化程度越低、臨床分期越晚則GST-π表達(dá)愈強(qiáng)，伴淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者P-gp陽性表達(dá)率明顯高于無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者，認(rèn)為P-gp表達(dá)不但反映出賁門癌的多藥耐藥狀況，還可作為一種預(yù)測腫瘤生物學(xué)行為和評(píng)價(jià)腫瘤患者預(yù)后的指標(biāo)。戴建華等[14]則認(rèn)為GST-π、P-gp的陽性表達(dá)與賁門癌的臨床病理特征無關(guān)。我們的結(jié)果提示GST-π和P-gp高表達(dá)的賁門癌組織更具有侵襲性、分化更差。本研究中相關(guān)分析結(jié)果顯示，賁門癌中GST-π和P-gp的表達(dá)呈正相關(guān)，兩者的表達(dá)具有較強(qiáng)的一致性，提示二者在賁門癌細(xì)胞的表達(dá)可能存在共同的調(diào)節(jié)機(jī)制，這一結(jié)果與其他報(bào)道基本一致[7-8，15]。研究認(rèn)為腫瘤組織異常表達(dá)癌基因和抑癌基因如c-erbB-2，neu，P53，ras，INT2，HSTF1，bcl-2，c-fos和c-jun等可能參與促進(jìn)P-gp和GST-π基因擴(kuò)增，導(dǎo)致腫瘤組織同時(shí)高表達(dá)GST-π和P-gp[16]。

綜上所述，GST-π和 P-gp在潮汕高發(fā)區(qū)賁門癌組織中呈高表達(dá)，且兩者的表達(dá)具有相關(guān)性，GST-π高表達(dá)脈管浸潤率高，P-gp高表達(dá)患者年齡較大，且P-gp在黏液腺癌表達(dá)更明顯。今后可進(jìn)一步研究GST-π 和P-gp表達(dá)與賁門癌患者耐藥的關(guān)系。

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基金項(xiàng)目：廣東省自然科學(xué)基金資助(2014A030310139)

收稿日期：2015-09-01；

修訂日期：2015-12-21

中圖分類號(hào)：R730.2

文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

文章編號(hào)：1004-616X(2016)01-0036-05

doi:1 0.3969/j.issn.1004-616x.2016.01.008