邵　 帥，魏志權(quán)，張　 偉，佟　 鵬，王春燕，齊雪松，茍 巧*（中國疾病預(yù)防控制中心輻射防護(hù)與核安全醫(yī)學(xué)所，輻射防護(hù)與核應(yīng)急重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100088）

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GPX1過表達(dá)對(duì)肺癌BERP35T1細(xì)胞DNA氧化損傷和惡性表型的影響

邵 帥，魏志權(quán)，張 偉，佟 鵬，王春燕，齊雪松，茍 巧*
（中國疾病預(yù)防控制中心輻射防護(hù)與核安全醫(yī)學(xué)所，輻射防護(hù)與核應(yīng)急重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100088）

【摘要】目的： 探討谷胱甘肽過氧化物酶1(GPX1)過表達(dá)對(duì)α粒子輻射致肺癌BERP35T1細(xì)胞DNA氧化損傷和惡性表型的影響。方法：構(gòu)建pEGFP-GPX1真核表達(dá)載體，經(jīng)PCR、雙酶切和測(cè)序鑒定后，采用脂質(zhì)體法將重組質(zhì)粒及其對(duì)照空載體分別轉(zhuǎn)染至BERP35T1細(xì)胞中，篩選出具有G418抗性的細(xì)胞株，經(jīng)Western blot法測(cè)定GPX1蛋白在細(xì)胞株中的表達(dá)情況；通過免疫細(xì)胞化學(xué)法、四甲基噻唑藍(lán)(MTT)法、劃痕愈合試驗(yàn)和錨著獨(dú)立生長試驗(yàn)分別檢測(cè)GPX1過表達(dá)對(duì)BERP35T1細(xì)胞內(nèi)DNA氧化損傷產(chǎn)物8-羥化脫氧鳥苷(8-OHdG)水平，細(xì)胞增殖、遷移以及錨著獨(dú)立生長能力的影響。結(jié)果：pEGFP-GPX1經(jīng)PCR、雙酶切鑒定和DNA測(cè)序證實(shí)，GPX1片段的序列完全正確；并獲得GPX1穩(wěn)定表達(dá)BERP35T1細(xì)胞株BERP35T1-GPX1-6，其GPX1蛋白水平是對(duì)照空載體轉(zhuǎn)染細(xì)胞的4.01倍(P<0.05)；與BERP35T1細(xì)胞和對(duì)照空載體轉(zhuǎn)染細(xì)胞相比，BERP35T1-GPX1-6細(xì)胞內(nèi)8-OHdG水平降低，細(xì)胞的增殖、遷移和錨著獨(dú)立生長能力均減弱(P<0.05)。結(jié)論：過表達(dá)GPX1可能通過清除細(xì)胞內(nèi)活性氧降低DNA氧化損傷水平，從而抑制BERP35T1細(xì)胞增殖、遷移和錨著獨(dú)立生長能力等惡性表型。

【關(guān)鍵詞】谷胱甘肽過氧化物酶1；α粒子；肺癌；氧化損傷

作者信息： 邵 帥，Tel：010-62389938，E-mail：shaoshuai_0829@126.com。*通信作者，茍 巧，Tel：010-62389616，E-mail：xiaogou824@ 163.com

Effects of glutathione peroxidase 1 overexpression on DNA oxidative damage and phenotype of malignant BERP35T1 cells

SHAO Shuai，WEI Zhiquan，ZHANG Wei，TONG Peng，WANG Chunyan，QI Xuesong，GOU Qiao*
(Key Laboratory of Radiological Protection and Nuclear Emergency, National Institute for Radiological Protection, China CDC, Beijing 100088, China)

【ABSTRACT】OBJECTIVE: To study the effects of glutathione peroxidase 1(GPX1) overexpression on DNA oxidative damage level and phenotype of malignant BERP35T1 cells exposed upon α-particles. METHODS：The eukaryotic expression vector pEGFP-GPX1 was constructed. After PCR，enzyme digestion analysis and sequencing， pEGFP-GPX1 and control vector were transfected into BERP35T1 cells with lipofectamine 2000 and G418 screening was used to obtain resistant cell lines. The expression of GPX1 was measured by Western blot. MTT，scratching healing test and anchorage independence growth test were used to analyze the effects of GPX1 overexpression on growth rate，migration and colony forming efficiency of BERP35T1 cells. RESULTS：pEGFP-GPX1 was confirmed by PCR，enzyme digestion analysis and sequencing. The sequence of the target gene GPX1 was entirely correct. The protein expression level of GPX1 in pEGFP-GPX1 transfected group BERP35T1-GPX1-6 was 4.01 times higher than in BERP35T1-pEGFP cells(P<0.05). Compared with BERP35T1 and BERP35T1-pEGFP，the level of growth rate，migration and colony forming efficiency in BERP35T1-GPX1-6 decreased significantly(P<0.05). CONCLUSION：GPX1 overexpression may inhibit the proliferation and metastasis of malignant BERP35T1 cells exposed to α-particles through reducing the level of DNA oxidative damage.

【KEY WORDS】glutathione p eroxidase 1 ；α-particle；lung cancer；oxidative stress

肺癌是世界上最常見的惡性腫瘤之一，氡及其短壽命子體的輻射照射是非吸煙者罹患肺癌的主要原因[1]。氡的主要危害是衰變時(shí)不斷發(fā)射出的高能α粒子(5.49~7.69 MeV)，吸入后這些α粒子會(huì)滯留在人體的呼吸道表面，對(duì)支氣管和肺細(xì)胞產(chǎn)生照射，從而誘發(fā)肺癌[1-3]。前期研究表明，在α粒子輻射誘發(fā)永生化人支氣管上皮細(xì)胞BEP2D惡性轉(zhuǎn)化中，過氧化物分解酶谷胱甘肽過氧化物酶1(glutathione peroxidase 1，GPX1)蛋白表達(dá)量和活性降低，活性氧簇(reactive o xygen s pecies，ROS)、脂質(zhì)過氧化和DNA氧化損傷水平增高[4-7]。因此，推測(cè)在人支氣管上皮細(xì)胞輻射致癌模型BERP35T1(以238PuO沉積源α粒子1.5 Gy劑量照射BEP2D細(xì)胞，連

2續(xù)傳35代后接種裸鼠，從成瘤細(xì)胞中克隆出來，具有明確的惡性表型)中使GPX1過量表達(dá)，可能通過清除ROS降低DNA 氧化損傷，從而抑制細(xì)胞的惡性表型。本研究構(gòu)建了攜帶人GPX1 cDNA的真核表達(dá)載體pEGFP-GPX1，并使其在BERP35T1細(xì)胞中過表達(dá)，初步探討GPX1過表達(dá)對(duì)BERP35T1細(xì)胞內(nèi)DNA氧化損傷水平和細(xì)胞增殖、遷移以及錨著獨(dú)立生長能力等惡性表型的影響。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞系和菌株

BEP2D(經(jīng)HPV-18永生化的人支氣管上皮細(xì)胞)和BERP35T1細(xì)胞由軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院二所四室周平坤和胡迎春老師惠贈(zèng)。用無血清培養(yǎng)液(美國LONZA公司)于37 ℃，CO2體積分?jǐn)?shù)為5%條件下培養(yǎng)。每3 d換1次培養(yǎng)基，每周傳代1次。感受態(tài)E. coli DH5α工程菌(北京天根生化科技有限公司)。

1.2 主要試劑和儀器

磷酸鹽緩沖液(PBS，北京鼎國昌盛生物技術(shù)有限責(zé)任公司)；pEGFP-N1載體[綠色熒光蛋白(green fluorescent protein，GFP)表達(dá)載體，中國質(zhì)粒載體菌株細(xì)胞株基因保藏中心]；卡那霉素(北京天根生化科技公司)；pEGM-T Easy載體連接試劑盒、逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(美國Promega公司)；限制性內(nèi)切酶BglⅡ和KpnⅠ(日本TaKaRa公司)；氨芐青霉素(北京天根生化科技公司)；質(zhì)粒小量提取試劑盒(德國Qiagen公司)；脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑(LipofectamineTM2000)、總RNA提取液Trizol、引物合成測(cè)序(美國Invitrogen公司)；遺傳霉素重硫酸鹽(G418，德國Merck公司)；PCR產(chǎn)物回收試劑盒(美國Bio Teke公司)；瓊脂糖(美國Promega公司)；二甲基亞砜(DMSO)、噻唑藍(lán)(MTT，美國Sigma公司)；辣根過氧化物酶(HRP)標(biāo)記山羊抗兔和山羊抗小鼠抗體(北京中杉金橋公司)；兔抗人GPX1抗體(美國Cell Signaling公司)；小鼠抗人β-actin抗體(美國Abcam公司)；小鼠抗8-羥化脫氧鳥苷(8-oxo-deoxyguanosine，8-OHdG)單克隆抗體(美國Cell Signaling公司)；即用型SABC免疫組化染色試劑盒、DAB顯色液(武漢博士德生物工程公司)；Kodak膠片(美國柯達(dá)公司)。

PCR擴(kuò)增儀(德國Eppendorf公司)；電泳儀(北京六一儀器廠)；全波長酶標(biāo)儀(美國Thermo公司)；光學(xué)顯微鏡、熒光顯微鏡(日本Nikon公司)；Image J公共圖像處理軟件(美國國立衛(wèi)生研究院)；Image Pro-Plus 6.0專業(yè)圖像軟件(美國Media Cybernetics公司)。

1.3 引物設(shè)計(jì)

根據(jù)GenBank中GPX1 mRNA全序列信息(登錄號(hào)NM_000581.2)設(shè)計(jì)特異性引物，見表1。

表1 用于擴(kuò)增及構(gòu)建pEGFP-GPX1載體的引物序列

1.4 GPX1基因的擴(kuò)增及pEGFP-GPX1載體的構(gòu)建

從BEP2D細(xì)胞提取總RNA，用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒合成cDNA，采用逆轉(zhuǎn)錄PCR擴(kuò)增GPX1基因。PCR反應(yīng)條件：94 ℃預(yù)變性5 min后，94 ℃、30 s，63 ℃、30 s，72 ℃、90 s，共35個(gè)循環(huán)，最后72 ℃延伸10 min。其產(chǎn)物用pEGM-T Easy載體連接試劑盒連接過夜，轉(zhuǎn)化高感受態(tài)DH5α工程菌。于含有氨芐青霉素的瓊脂培養(yǎng)板中于37 ℃培養(yǎng)12 h后挑取陽性克隆擴(kuò)增，按質(zhì)粒小量提取試劑盒提取重組質(zhì)粒DNA，PCR鑒定并進(jìn)行測(cè)序分析。測(cè)序結(jié)果與GenBank 內(nèi)GPX1序列比較無差異。再進(jìn)行pEGFP-GPX1載體的構(gòu)建：以克隆有GPX1編碼區(qū)全長pEGFP-T Easy質(zhì)粒為模板，分別用帶有Bgl II、Kpn I酶切位點(diǎn)的引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增(退火溫度71.6 ℃，其余PCR反應(yīng)條件同前)。酶切回收目的片段并克隆入pEGFP-N1載體，經(jīng)PCR、酶切和測(cè)序鑒定成功后用于后續(xù)試驗(yàn)研究。

1.5 質(zhì)粒提取及轉(zhuǎn)染

1.5.1 質(zhì)粒提取 用質(zhì)粒提取試劑盒從含有pEGFPGPX1質(zhì)粒的菌液中提取高純度質(zhì)粒。操作嚴(yán)格按照試劑盒說明書進(jìn)行，獲得的質(zhì)粒-20 ℃ 保存。

1.5.2 穩(wěn)定轉(zhuǎn)染及穩(wěn)定表達(dá)GPX1的細(xì)胞株的建立 將指數(shù)生長期的BERP35T1細(xì)胞以5×105個(gè)接種至35 mm培養(yǎng)皿中。用LipofectamineTM2000分別將pEGFPGPX1質(zhì)粒及pEGFP-N1空載體轉(zhuǎn)染至BERP35T1細(xì)胞。6 h后更換含有60 mg/L G418的培養(yǎng)液。16 d后挑選生長狀態(tài)良好的細(xì)胞克隆，以含有30 mg/L G418的培養(yǎng)液分別進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)。

1.5.3 熒光顯微鏡檢測(cè)綠色熒光蛋白表達(dá) 經(jīng)G418篩選，pEGFP-N1和pEGFP-GPX1組分別獲得1個(gè)(命名為BERP35T1-pEGFP)和6個(gè)(按獲得順序分別命名為BERP35T1-GPX1-1~6)抗G418的細(xì)胞克隆。擴(kuò)大培養(yǎng)后用PBS洗滌2次，置于熒光顯微鏡下觀察綠色熒光蛋白的表達(dá)，并選取綠色熒光蛋白顯著表達(dá)的BERP35T1-GPX1細(xì)胞株進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.6 Western blot檢測(cè)GPX1蛋白表達(dá)

將BERP35T1、BERP35T1-pEGFP、BERP35T1-GPX1-6細(xì)胞擴(kuò)大培養(yǎng)后，提取總蛋白，取20 μg上樣進(jìn)行聚丙烯酰胺凝膠(SDS-PAGE)電泳及轉(zhuǎn)膜。一抗采用兔抗人GPX1單克隆抗體(1∶1 000稀釋)常溫孵育2 h，二抗采用HRP標(biāo)記山羊抗兔抗體(1∶2 000稀釋)常溫孵育1 h。用小鼠抗人β-actin抗體進(jìn)行雜交作內(nèi)參照。經(jīng)化學(xué)發(fā)光顯影后，使用Image J軟件進(jìn)行條帶灰度分析。實(shí)驗(yàn)重復(fù)兩次。

1.7 免疫細(xì)胞化學(xué)法檢測(cè)GPX1過表達(dá)對(duì)BERP35T1細(xì)胞內(nèi)8-OHdG水平的影響

制備BERP35T1、BERP35T1-pEGFP、BERP35T1-GPX1-6細(xì)胞爬片。4%多聚甲醛固定爬片后，PBS洗2次，置于0.3% Triton X-100中室溫孵育30 min以透膜，按照即用型SABC免疫組化染色試劑盒說明書操作。其中，小鼠抗8-OHdG單克隆抗體(一抗)按1∶200稀釋。經(jīng)DAB顯色，蘇木素復(fù)染，光鏡下觀察、拍照(每組細(xì)胞于任意視野拍7張)。細(xì)胞呈棕黃色為陽性標(biāo)記，用Image Pro-Plus 6.0軟件分析每張照片陽性細(xì)胞的平均吸光度值。

1.8 MTT檢測(cè)GPX1過表達(dá)對(duì)BERP35T1細(xì)胞增殖的影響

將對(duì)數(shù)生長期的BERP35T1、BERP35T1-pEGFP 以及BERP35T1-GPX1-6細(xì)胞接種于96孔板中，每孔1×104個(gè)，每種細(xì)胞設(shè)6個(gè)復(fù)孔。用含有10%(m/V)的5 g/L MTT的無血清培養(yǎng)基100 μL于37 ℃孵育細(xì)胞4 h后，棄培養(yǎng)基。每孔加入150 μL DMSO，室溫下振蕩孵育10 min，用酶標(biāo)儀測(cè)定各孔吸光度D(490)值，按下式計(jì)算細(xì)胞存活率。

細(xì)胞存活率(%)=檢測(cè)組D(490)值/對(duì)照BERP35T1-pEGFP 組D(490)值×100%

1.9 細(xì)胞劃痕愈合實(shí)驗(yàn)檢測(cè)GPX1過表達(dá)對(duì)BERP35T1細(xì)胞遷移能力的影響

收集對(duì)數(shù)期BERP35T1、BERP35T1-pEGFP和BERP35T1-GPX1-6細(xì)胞，以每孔5×105個(gè)接種于6孔板，每種細(xì)胞設(shè)3個(gè)復(fù)孔。融合度達(dá)90%時(shí)，用200 μL無菌吸頭在孔底劃痕，用PBS洗凈被刮下的細(xì)胞。培養(yǎng)48 h后，于普通光學(xué)顯微鏡低倍鏡下(×100) 觀察細(xì)胞劃痕愈合情況并隨機(jī)選取6個(gè)不重疊視野拍照，采用美國Image Pro-Plus 6.0軟件測(cè)量劃痕兩側(cè)細(xì)胞間距離(μm)的變化。用遷移距離反映遷移速度，即細(xì)胞遷移距離=遷移前劃痕寬度-遷移后劃痕寬度，距離越大，遷移速度越快。

1.10 錨著獨(dú)立性生長實(shí)驗(yàn)檢測(cè)GPX1過表達(dá)對(duì)BERP35T1 細(xì)胞錨著獨(dú)立生長能力的影響

在直徑6 cm的培養(yǎng)皿中鋪制濃度為0.7%的底層瓊脂，將分別含有2×104個(gè)BERP35T1、BERP35T1-pEGFP、BERP35T1-GPX1-6細(xì)胞的瓊脂(濃度為0.35%)鋪于底層瓊脂上。待上層瓊脂凝固后，表面加無血清培養(yǎng)基，于37 ℃、CO2體積分?jǐn)?shù)為5%條件見下培養(yǎng)，3 d換液一次，連續(xù)培養(yǎng)4周。細(xì)胞數(shù)超過50個(gè)計(jì)為1個(gè)克隆，按下式計(jì)算克隆形成率。

克隆形成率=克隆數(shù)/接種細(xì)胞數(shù)×1 0 00‰

1.11 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)均為計(jì)量資料，以x-±s表示。用SPSS 17.0軟件進(jìn)行分析。多組間均數(shù)的比較采用單因素方差分析，均數(shù)間兩兩比較采用Bonferroni法。檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05。

2 結(jié) 果

2.1 重組質(zhì)粒的PCR、酶切和測(cè)序鑒定

使用設(shè)計(jì)的GPX1基因編碼區(qū)引物，以重組質(zhì)粒pEGFP-GPX1為模板，擴(kuò)增出長約620 bp的片段，見圖1A。將重組質(zhì)粒pEGFP-GPX1用限制性內(nèi)切酶Bgl II和Kpn I雙酶切，瓊脂糖電泳結(jié)果顯示出兩條大小不等的帶，一條大于2 000 bp為載體片段，一條約620 bp為連入的GPX1片段，見圖1B。使用設(shè)計(jì)的GPX1基因編碼區(qū)引物以重組質(zhì)粒pEGFP-GPX1為模板進(jìn)行雙向PCR，序列分析結(jié)果顯示，擴(kuò)增出的片段已與pEGFP-N1連接，該片段確定為GPX1基因編碼區(qū)。

A：PCR鑒定電泳圖，泳道1~4為以pEGFP-GPX1質(zhì)粒為模板PCR擴(kuò)增出的GPX1片段；B：雙酶切鑒定電泳圖，泳道1~4為BglⅡ和KpnⅠ雙酶切pEGFP-GPX1質(zhì)粒產(chǎn)物；泳道M：DL2000 DNA分子量標(biāo)準(zhǔn).圖1 重組質(zhì)粒pEGFP-GPX1的PCR鑒定和雙酶切鑒定電泳圖

2.2 GFP融合的GPX1在細(xì)胞中的表達(dá)

BERP35T1細(xì)胞經(jīng)轉(zhuǎn)染后，由G418篩選，空白對(duì)照BERP35T1細(xì)胞內(nèi)因無G418抗性載體而全部死亡，而pEGFP-N1和pEGFP-GPX1組分別獲得1個(gè)和6個(gè)抗G418的克隆。擴(kuò)大培養(yǎng)后熒光顯微鏡下觀察，BERP35T1-pEGFP細(xì)胞內(nèi)見明顯綠色熒光；6株BERP35T1-pEGFP細(xì)胞內(nèi)僅BERP35T1-GPX1-6細(xì)胞內(nèi)可見明顯綠色熒光，說明GPX1基因在這株細(xì)胞內(nèi)表達(dá)，見圖2。故后續(xù)實(shí)驗(yàn)均選用BERP35T1-GPX1-6細(xì)胞為研究對(duì)象。

A：BERP35T1；B：BERP35T1-pEGFP；C：BERP35T1-GPX1-6.圖2 GPF在細(xì)胞內(nèi)的表達(dá)情況(×200)

2.3 細(xì)胞中GPX1蛋白的表達(dá)

Western b lot檢測(cè)結(jié)果表明，BERP35T1、BERP35T1-pEGFP和BERP35T1-GPX1-6細(xì)胞內(nèi)GPX1蛋白相對(duì)表達(dá)水平分別為(0.97±0.11)、(1.00±0.00)和(4.01± 0.99)。BERP35T1和BERP35T1-pEGFP細(xì)胞比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；BERP35T1-GPX1-6細(xì)胞內(nèi)GPX1 蛋白表達(dá)水平是BERP35T1-pEGFP細(xì)胞的4.01倍(P< 0.01)，見圖3。說明GPX1蛋白在BERP35T1-GPX1-6細(xì)胞內(nèi)過表達(dá)。

1：BERP35T1；2：BERP35T1-pEGFP；3：BERP35T1-GPX1-6.圖3 細(xì)胞內(nèi)GPX1蛋白表達(dá)情況

2.4 GPX1過表達(dá)對(duì)BERP35T1細(xì)胞內(nèi)8-OHdG水平的影響

對(duì)細(xì)胞中的DNA氧化損傷產(chǎn)物8-OHdG進(jìn)行免疫細(xì)胞化學(xué)染色后(見圖4)，用圖像分析軟件對(duì)細(xì)胞染色強(qiáng)度進(jìn)行定量分析顯示：BERP35T1-pEGFP與BERP35T1細(xì)胞內(nèi)8-OHdG的水平無明顯差異(分別為1.60×10-2和1.65×10-2，P>0.05)，與BERP35T1-pEGFP和BERP35T1細(xì)胞相比，BERP35T1-GPX1-6細(xì)胞內(nèi)8-OHdG水平(9.75×1 0-3)顯著降低，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均<0.01)。

2.5 GPX1過表達(dá)對(duì)BERP35T1細(xì)胞增殖的影響

MTT法檢測(cè)結(jié)果顯示：BERP35T1-pEGFP與BERP35T1細(xì)胞的存活率差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(分別為96.84%±3.16%和93.61%±5.38%，P>0.05)。與BERP35T1細(xì)胞和BERP35T1-pEGFP細(xì)胞相比，BERP35T1-GPX1-6 細(xì)胞的存活率(80.86%±3.14%)顯著降低，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P< 0.01)。

A：BERP35T1；B：BERP35T1-pEGFP；C：BERP35T1-GPX1-6.圖4 BERP35T1、BERP35T1-pEGFP和BERP35T1-GPX1-6細(xì)胞內(nèi)8-OHdG的表達(dá)(×200)

2.6 GPX1過表達(dá)對(duì)BERP35T1細(xì)胞遷移能力的影響

劃痕愈合試驗(yàn)結(jié)果顯示：劃痕后48 h，BERP35T1-pEGFP細(xì)胞遷移距離(115.02±30.73) μm與 BERP35T1細(xì)胞(150.68±9.98) μm 比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；與BERP35T1和BERP35T1-pEGFP細(xì)胞相比，BERP35T1-GPX1-6細(xì)胞的遷移距離(78.58± 9.57) μ m明顯減小(P<0.01)，見圖5。

圖5 細(xì)胞遷移能力(×100)

2.7 GPX1過表達(dá)對(duì)BERP35T1細(xì)胞錨著獨(dú)立生長能力的影響

細(xì)胞在瓊脂中的集落形成率是細(xì)胞惡性程度高低的重要標(biāo)志。錨著獨(dú)立生長試驗(yàn)結(jié)果顯示：BERP35T1 和BERP35T1-pEGFP形成的50個(gè)細(xì)胞以上的克隆較多，BERP35T1-GPX1-6形成50個(gè)細(xì)胞以上的克隆很少，多為4~5個(gè)細(xì)胞形成的細(xì)胞團(tuán)。BERP35T1與BERP35T1-pEGFP細(xì)胞相比，克隆形成率差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(分別為2.50‰ ±0.02‰和2.10‰±0.02‰，P> 0.05)；與BERP35T1和BERP35T1-pEGFP細(xì)胞相比，BERP35T1-GPX1-6細(xì)胞的克隆形成率(0.50‰±0.03‰)顯著降低，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見圖6。

3 討 論

GPX1是機(jī)體內(nèi)廣泛存在的一種重要的過氧化物分解酶，可使有毒的過氧化物還原成無毒的羥基化合物，從而保護(hù)細(xì)胞和遺傳物質(zhì)，使其免受過氧化物的干擾及損害。在GPX1基因敲除的小鼠體內(nèi)，ROS及DNA氧化損傷水平均顯著增加[8]。GPX1表達(dá)水平降低與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展關(guān)系密切。與正常結(jié)腸組織比較，GPX1在結(jié)腸癌組織中的表達(dá)量降低2倍[9]。本實(shí)驗(yàn)室前期研究也發(fā)現(xiàn)，與BEP2D細(xì)胞相比，人支氣管上皮細(xì)胞輻射致癌模型BERP35T1細(xì)胞內(nèi)抗氧化蛋白GPX1表達(dá)下調(diào)[6]。α粒子電離輻射可導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)ROS水平急劇升高，使細(xì)胞處于高氧化應(yīng)激狀態(tài)。如果細(xì)胞內(nèi)抗氧化系統(tǒng)的代償功能無法適應(yīng)這種應(yīng)激狀態(tài)，細(xì)胞內(nèi)則會(huì)積聚大量的ROS，引起脂質(zhì)和DNA等大分子的氧化損傷，誘發(fā)細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化。因此，抗氧化酶GPX1 表達(dá)下調(diào)，引起細(xì)胞抗氧化功能減弱可能是α粒子誘發(fā)BEP2D細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化的重要機(jī)制之一[5-7，10]。反之，提高細(xì)胞內(nèi)GPX1蛋白的表達(dá)量則可能抑制α粒子誘發(fā)的BEP2D細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化、逆轉(zhuǎn)或部分逆轉(zhuǎn)已經(jīng)惡性轉(zhuǎn)化的BEP2D細(xì)胞的惡性表型。本研究首先成功構(gòu)建了攜帶人GPX1 cDNA的真核表達(dá)載體pEGFPGPX1，并使其在BERP35T1細(xì)胞中過表達(dá)。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，與BERP35T1細(xì)胞和BERP35T1-pEGFP細(xì)胞相比，過量表達(dá)GPX1蛋白的BERP35T1-GPX1-6細(xì)胞的增殖活力、遷移能力以及錨著獨(dú)立生長能力均顯著減低(P<0.05)。這表明GPX1過量表達(dá)可以抑制BERP35T1細(xì)胞的惡性表型，遏制α粒子電離輻射所致肺癌細(xì)胞的生長和轉(zhuǎn)移。

A：BERP35T1；B：BERP35T1-pEGFP；C：BERP35T1-GPX1-6.圖6 接種4周后軟瓊脂中形成的細(xì)胞克隆(×100)

DNA氧化損傷在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展過程中起著重要作用。DNA雙螺旋外側(cè)的鳥嘌呤極易被ROS氧化為8-OHdG，DNA鏈上的8-OHdG可以與胞嘧啶以外的其他堿基配對(duì)形成點(diǎn)突變[11]。因此，8-OHdG既是一種敏感的DNA氧化損傷標(biāo)志物，也是一種潛在的致癌標(biāo)志物。ROS誘導(dǎo)的持續(xù)性DNA氧化損傷能逐漸形成具有新特征的細(xì)胞亞群。最后，細(xì)胞凋亡減少，基因組不穩(wěn)定性及異型性增加，進(jìn)展為突變細(xì)胞，導(dǎo)致腫瘤發(fā)生[12]。本實(shí)驗(yàn)室前期研究發(fā)現(xiàn)，在α粒子輻射誘發(fā)BEP2D細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化過程中，細(xì)胞內(nèi)ROS和8-OHdG水平增高[6-7]。周平坤等[13]發(fā)現(xiàn)，與BEP2D細(xì)胞相比，BERP35T1細(xì)胞中染色體極不穩(wěn)定，表現(xiàn)為染色體斷裂水平增高，13號(hào)染色體和Y染色體丟失、2號(hào)染色體和12號(hào)染色體的長臂增加等。這些研究結(jié)果提示，α粒子輻射誘發(fā)BEP2D細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化過程中，GPX1表達(dá)下調(diào)引起細(xì)胞內(nèi)ROS積聚，誘發(fā)DNA氧化損傷，由此引起基因突變和基因組不穩(wěn)定性等，從而促進(jìn)細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化。本研究使GPX1蛋白在α粒子輻射致肺癌細(xì)胞模型BERP35T1中過表達(dá)后，采用免疫細(xì)胞化學(xué)方法對(duì)細(xì)胞內(nèi)8-OHdG水平進(jìn)行檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)與BERP35T1和BERP35T1-pEGFP細(xì)胞相比，BERP35T1-GPX1-6細(xì)胞內(nèi)8-OHdG水平降低了40%(P<0.01)。這表明細(xì)胞內(nèi)過量表達(dá)的抗氧化酶GPX1可能通過抑制ROS對(duì)DNA的氧化損傷，促進(jìn)基因組穩(wěn)定性，抑制BERP35T1細(xì)胞的惡性表型。

綜上所述，在α粒子輻射致肺癌細(xì)胞模型BERP35T1細(xì)胞中過量表達(dá)GPX1，可通過將細(xì)胞內(nèi)有毒的過氧化物還原成無毒的羥基化合物，緩解細(xì)胞內(nèi)DNA氧化損傷，促進(jìn)基因組穩(wěn)定性，抑制癌細(xì)胞的惡性表型，發(fā)揮腫瘤抑制作用。但為了證實(shí)該結(jié)論，還需開展動(dòng)物水平及相關(guān)信號(hào)通路等多方面的實(shí)驗(yàn)研究。

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基金項(xiàng)目：國家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(81000862)

收稿日期：2015-05-04；

修訂日期：2015-10-28

中圖分類號(hào)：R994.6

文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

文章編號(hào)：1004-616X(2016)01-0008-07

doi:1 0.3969/j.issn.1004-616x.2016.01.002