陳建國，張露，李雪，李金霞，譚望橋，程池，*（.中國食品發(fā)酵工業(yè)研究院，中國工業(yè)微生物菌種保藏管理中心，北京0005；.海南諾尼生物工程開發(fā)有限公司，海南?？?705）

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HPLC法測定諾尼果汁中兩種環(huán)烯醚萜類成分的含量

陳建國1，張露1，李雪1，李金霞1，譚望橋2，程池1，*
（1.中國食品發(fā)酵工業(yè)研究院，中國工業(yè)微生物菌種保藏管理中心，北京100015；2.海南諾尼生物工程開發(fā)有限公司，海南?？?70125）

摘要：建立了一種高效液相色譜法同時測定諾尼果汁中車葉草苷酸和去乙酰車葉草苷酸含量的方法。采用Shimpack VP-ODS-C18（250mm×4.6mm，5μm）色譜柱，乙腈-磷酸水溶液為流動相，流速為0.5min/mL，檢測波長為237 nm。在此條件下，車葉草苷酸和去乙酰車葉草苷酸分離良好，濃度分別在5 μg/mL~50 μg/mL和25 μg/mL~250 μg/mL范圍內線性關系良好，平均加樣回收率為99.02 %和102.15 %，RSD值為1.58 %和2.40 %。西沙諾尼果汁車葉草苷酸和去乙酰車葉草苷酸平均含量為0.204 mg/mL和1.640mg/mL。

關鍵詞：高效液相色譜；西沙諾尼；諾尼果汁；環(huán)烯醚萜；車葉草苷酸；去乙酰車葉草苷酸

諾尼（Noni），學名海巴戟天（Morinda citrifolia Linn.），原產于一些太平洋島嶼、東南亞和澳大利亞等地，現引種于我國海南省。諾尼有廣泛的營養(yǎng)和藥用價值，富含大量活性成分如多糖、酚類、黃酮類、環(huán)烯醚萜類和甾體類等，具有抗腫瘤、抗氧化、增強免疫力、降血脂和保護心血管等功能，對多種疾病有預防和治療作用[1-4]。

已有文獻報道諾尼果含有兩種主要的環(huán)烯醚萜類活性物質：車葉草苷酸和去乙酰車葉草苷酸，具有抗腫瘤、抗病毒、抗氧化、抗畸變等活性[5-10]。本文首次建立了同時測定諾尼果汁中車葉草苷酸和去乙酰車葉草苷酸含量的方法，能為諾尼果汁生產工藝和產品質量的控制提供依據。

1材料與方法

1.1儀器

Thermo UltiMate 3000型高效液相色譜儀（VWD-3000紫外檢測器，Chromeleon 7色譜工作站）：Thermo Fisher公司；minispin離心機：eppendorf公司。

1.2試劑與材料

對照品車葉草苷酸（批號：130711）：購自成都普菲德生物技術有限公司（質量分數不小于99.0 %）；去乙酰車葉草苷酸（批號：13042009）：購自北京盛世康普化工技術研究院（質量分數不小于99.0 %）；乙腈、磷酸均為色譜純。西沙諾尼果汁：由海南諾尼生物工程開發(fā)有限公司生產，產品批號為20120911、20130618、20131206和20140122。

1.3方法

1.3.1色譜條件

檢測器：Thermo VWD-3000；檢測波長：237 nm；色譜柱：Shim-pack VP-ODS（250 mm×4.6 mm，5 μm）；柱溫：35℃；流動相：A液0.1 %磷酸溶液；B液乙腈；梯度洗脫：0 min~10 min，4 % B；10 min~22 min，15 %B；22 min~40 min，4 %B；流速：0.5 mL/min。在上述色譜條件下，取對照品溶液和供試品溶液分別進樣，記錄色譜圖。理論塔板數按去乙酰車葉草苷酸計算不低于10 000，按車葉草苷酸計算不低于10 000。

1.3.2對照品溶液制備

稱取車葉草苷酸對照品5 mg，去乙酰車葉草苷酸對照品25 mg，置于10 mL容量瓶中，加水稀釋至刻度，搖勻，即得混合對照品儲備液（質量濃度分別為0.5 mg/mL和2.5 mg/mL）。

1.3.3樣品溶液的制備

取20 mL西沙諾尼果汁10 000 r/min離心5 min，吸取上清液10 mL于100 mL容量瓶中，加水稀釋至刻度，搖勻，過0.22 μm膜。

2結果與分析

2.1色譜分離條件的選擇

車葉草苷酸和去乙酰車葉草苷酸水溶液均在237 nm附近有最大吸收[11]，且在此波長處，干擾組分對測定無影響，因此本實驗選擇237 nm為測定波長。綜合考慮測定組分的分離度、峰對稱性及柱效等因素，最終選定乙腈-磷酸水溶液作為流動相，對目標物質進行梯度分離。最終選定采用流動相：A液0.1 %磷酸溶液；B液乙腈；梯度洗脫：0 min~10 min，4 % B；10 min~ 22 min，15 %B；22 min~40 min，4 %B進行測定。如圖1所示，被測組分與干擾成分之間能達到完全分離，柱效高，組分保留時間合適。

圖1對照品（A）和西沙諾尼果汁（B）色譜圖Fig.1 Chromatograms of standard solution and sample solution

2.2線性關系考察

吸取混合對照品儲備液0.1、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mL于10 mL容量瓶中，加水稀釋至刻度，搖勻。分別吸取上述對照品溶液10 μL注入液相色譜儀中，以峰面積（y）對質量濃度（x）進行線性回歸：

車葉草苷酸：y=4.405x+0.139，R2=0.999 7，線性范圍為5 μg/mL~50 μg/mL。

去乙酰車葉草苷酸：y=5.030x+0.578，R2=0.999 8，線性范圍為25 μg/mL~250 μg/mL。

2.3精密度試驗

取西沙諾尼果汁（批號20131206）一份，在上述色譜條件下連續(xù)進樣6次，記錄車葉草苷酸和去乙酰車葉草苷酸質量濃度，如表1所示。

表1精密度測定結果Table 1 Results of precision test

其RSD值分別為0.44 %和0.31 %。

2.4重現性試驗

取同一批西沙諾尼果汁（批號20131206）6份，按上述色譜條件進樣分析，測定車葉草苷酸和去乙酰車葉草苷酸質量濃度，如表2所示，其RSD值分別為1.28 %和0.79 %。

表2重現性測定結果Table 2 Results of repeatability test

2.5穩(wěn)定性試驗

取西沙諾尼果汁（批號20131206）室溫放置，分別在0、2、4、6、8 h進樣，記錄車葉草苷酸和去乙酰車葉草苷酸質量濃度，其RSD值分別為1.57 %和0.78 %，表明供試品溶液在8 h內穩(wěn)定（表3）。

表3穩(wěn)定性測定結果Table 3 Results of stability test

2.6回收率試驗

吸取同一批號西沙諾尼果汁（批號20131206）6份，每份1 mL，分別加入車葉草苷酸和去乙酰車葉草苷酸混合對照品儲備液0.5 mL，進樣分析，以外標法計算車葉草苷酸和去乙酰車葉草苷酸加樣回收率。車葉草苷酸和去乙酰車葉草苷酸平均回收率及RSD值分別為99.02 %和1.58 %、102.15 %和2.40 %（表4）。

2.7樣品測定

取不同批次西沙諾尼果汁，在上述色譜條件下進樣分析，按外標法計算車葉草苷酸和去乙酰車葉草苷酸質量濃度，結果如表5所示。

表4回收率測定結果Table 4 Results of recovery test

表5西沙諾尼果汁車葉草苷酸和去乙酰車葉草苷酸測定結果Table 5 Contents of asperulosidic acid and deacetylasperulosidic acid in Xisha noni juice

2.8不同產地諾尼果汁車葉草苷酸和去乙酰車葉草苷酸含量比較

對不同產地諾麗果汁中車葉草苷酸和去乙酰車葉草苷酸含量進行了測定，從表6中可以看出，我國西沙諾尼果汁去乙酰車葉草苷酸含量最高，而車葉草苷酸含量與泰國相當，但明顯高于大溪地、庫克和大西洋等產地。

表6不同產地諾尼果汁車葉草苷酸和去乙酰車葉草苷酸含量Table 6 Contents of asperulosidic acid and deacetylasperulosidic acid in Tahiti noni juice

3　結論

本文綜合考慮車葉草苷酸和去乙酰車葉草苷酸的分離度、峰對稱性及柱效等因素，最終采用Shim-pack VP-ODS（250 mm×4.6 mm，5 μm）色譜柱，乙腈-磷酸水溶液為流動相，對目標物質進行梯度分離，流速為0.5 mL/min，VWD-3000紫外檢測器，檢測波長為237 nm。被測組分與干擾成分之間能達到完全分離，柱效高，組分保留時間合適，且本法快速、簡便、準確，可用于同時測定諾尼果汁車葉草苷酸和去乙酰車葉草苷酸含量。

應用本文建立的HPLC方法，對四批次西沙諾尼果汁進行了測定，西沙諾尼果汁去乙酰車葉草苷酸的含量較高，平均值為1.640 mg/mL，車葉草苷酸含量相對較低，平均值為0.204 mg/mL。車葉草苷酸和去乙酰車葉草苷酸是植物代謝產生的環(huán)烯醚萜類活性物質，這類物質在酸性介質和高溫條件下不穩(wěn)定，置于塑料容器中也易發(fā)生變化，但對光并不敏感[13]。不同批次西沙諾尼果汁車葉草苷酸和去乙酰車葉草苷酸含量有所差異，可能與諾尼果成熟度、采集期、發(fā)酵工藝、滅菌方式和儲藏方法等因素有關。

車葉草苷酸和去乙酰車葉草苷酸是2種環(huán)烯醚萜類活性成分，具有抗腫瘤、抗病毒、抗氧化、抗畸變等活性。本研究首次建立了同時測定諾尼果汁中這兩種活性物質含量的HPLC方法，發(fā)現西沙諾尼果汁含有豐富的車葉草苷酸和去乙酰車葉草苷酸，明顯高于大溪地、泰國、庫克和大西洋等產地。這兩種物質可作為標志性成分，應用到諾尼果汁生產工藝和產品質量控制等環(huán)節(jié)。

參考文獻：

[1] Wang MY, Nowicki D, Anderson G, et al. Liver protective effects of Morinda citrifolia (Noni)[J].Plant Foods Hum Nutr, 2008, 63(2): 59-63

[2] Palu AK, Kim AH, West BJ, et al. The effects of Morinda citrifolia L. (noni) on the immune system : its molecular mechanism of action[J]. J Ethnopharmacol, 2008, 115(3): 502-506

[3] BrownAC.Anticancer activity of Morinda citrifolia (Noni)fruit:a review[J]. Phytother Res, 2012, 26(10):1427-1440

[4] Li J, Stickel SL, Bouton-Verville H, et al. Fermented Noni exudate (fNE): a mediator between immune system and anti-tumor activity [J].Oncol Rep, 2008 ,20(6):1505-1509

[5] Dussossoy E, Brat P, Bony E, et al. Characterization, anti-oxidative and anti-inflammatory effects of Costa Rican noni juice (Morinda citrifolia L.)[J]. J Ethnopharmacol, 2011, 133(1): 108-115

[6]董天驕,崔元璐,田俊生,等.天然環(huán)烯醚萜類化合物研究進展[J].中草藥, 2011,42(1): 185-194

[7] Dong-Hyun Kim,Hyo-Jung Lee, Young-Jun Oh, et al. Iridoid Glycosides Isolated from Oldenlandia diffusa Inhibit LDL-Oxidation[J]. Arch Pharm Res, 2005, 2(10): 1156-1160

[8] Toshihiro Akihisa, Ken-ichi Seino, Etsuyo Kaneko, et al. Melanogenesis inhibitory activities of iridoid-, hemiterpene-, and fatty acid-glycosides from the fruits of Morinda citrifolia(Noni)[J]. Journal of Oleo Science, 2010, 59(1): 49-57

[9] Sui-Kiong Ling,Akiko Komorita,Takashi Tanaka,et al.Sulfur-Containing Bis-iridoid Glucosides and Iridoid Glucosides from Saprosma scortechinii[J]. J Nat Prod, 2002, 65(5): 656-660

[10]趙桂琴,尹志峰,劉玉翠,等.素馨花環(huán)烯醚萜苷類化學成分研究[J].藥學學報,2011,46(10): 1221-1224

[11] Deng S, West BJ, Palu 'K, et al. Determination and comparative analysis of major iridoids in different parts and cultivation sources of Morinda citrifolia[J]. Phytochem Anal, 2011,22(1):26-30

[12] Potterat O, Felten RV, Dalsgaard PW, et al. Identification of TLC markers and quantification by HPLC-MS of various constituents in noni fruit powder and commercial noni-derived products[J]. J Agric Food Chem, 2007, 55(18): 7489-7494

[13]李存滿,徐青,薛興亞,等.白花蛇舌草中環(huán)烯醚萜苷類化合物的穩(wěn)定性研究[J].世界科學技術—中醫(yī)藥現代化, 2007,9(4): 51-56

Simultaneous Determination of Two Types of Iridoid Compounds in Noni Juice by HPLC

CHEN Jian-guo1，ZHANG Lu1，LI Xue1，LI Jin-xia1，TAN Wang-qiao2，CHENG Chi1，*
（1. China National Research Institute of Food and Fermentation Industries，China Center of Industrial Culture Collection，Beijing 100015，China；2. Hainan Noni Biological Engineering Development Co. Ltd.，Haikou 570125，Hainan，China）

Abstract：An analytical method of asperulosidic acid and deacetylasperulosidic acid in Noni Juice was established by HPLC. The separation was performed on a Shim-pack VP-ODS C18 column（250 mm×4.6 mm，5 μm）with Acetonitrile-phosphoric acid aqueous as mobile phase at flow rate of 0.5 mL/min and detection wave length at 237 nm. Asperulosidic acid and deacetylasperulosidic acid were successfully separated.The calibration curve of asperulosidic acid and deacetylasperulosidic acid were linear in the concentration range of 5 μg/mL-50 μg/mL and 25 μg/mL-250 μg/mL，respectively. The average recoveries of asperulosidic acid and deacetylasperulosidic acid were 99.02 % and 102.15 %，respectively. The RSD of asperulosidic acid and deacetylasperulosidic acid were 1.58 % and 2.40 %，respectively. The mean content of asperulosidic acid and deacetylasperulosidic acid in Xisha Noni juice were 0.204 mg/mL and 1.640 mg/mL.

Key words：HPLC；Xisha Noni；Noni juice；iridoid compounds；asperulosidic acid；deacetylasperulosidic acid

收稿日期：2014-09-23

DOI：10.3969/j.issn.1005-6521.2016.02.035

*通信作者：程池，教授級高工。

作者簡介：陳建國（1980—），男（漢），工程師，博士，從事保健原材的功效物質及其作用機制研究。

基金項目：中國食品發(fā)酵工業(yè)研究院科技發(fā)展基金（博士基金）項目（KJ14-BS-02）