李燕 朱君 黃彩彩

【摘要】目的：探討子宮內(nèi)膜異位癥患者中血管內(nèi)皮生長因子（VEGF）、磷脂酰肌醇-3 激酶/蛋白激酶B（PI3K/Akt）表達水平及其與血管生成的關(guān)系，并且探討VEGF與PI3K在調(diào)控血管生成過程中的相互關(guān)系。方法：利用S-P方法對32例EM手術(shù)標本和30例子宮肌瘤中VEGF、Akt及微血管密度（MVD）的表達進行檢測。結(jié)果：EM中正常內(nèi)膜、在位內(nèi)膜和異位內(nèi)膜Akt、VEGF 陽性表達率分別為 200%（6/30）、375%（12/32）、844%（27/32）、600%（18/30）、750%（24/32）、875%（28/32）；EM中正常內(nèi)膜、在位內(nèi)膜和異位內(nèi)膜MVD分別是（1037±524）、（1914 ± 710）、（4824±1054）。Akt、VEGF和血管密度在EM中異位內(nèi)膜較正常內(nèi)膜組高表達，在調(diào)控血管生成過程中，Akt與VEGF呈正相關(guān)。結(jié)論：PI3K/Akt、VEGF 均參與EM的發(fā)生發(fā)展，在EM血管生成中發(fā)揮關(guān)鍵作用，共同參與EM過程。

【關(guān)鍵詞】子宮內(nèi)膜異位癥；磷脂酰肌醇-3激酶/蛋白激酶B；血管內(nèi)皮生長因子

【中圖分類號】R711【文獻標志碼】A

子宮內(nèi)膜異位癥（endometriosis，EM）是育齡女性的婦科疾病之一，在經(jīng)期引起慢性盆腔痛，影響患者的身心健康。血管生成與EM的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)，血管內(nèi)皮生長因子（VEGF）是關(guān)鍵的促血管生成因子。EM是良性的婦科疾病，但其特點，具有類似惡性腫瘤遠處轉(zhuǎn)移和種植生長能力，由此推斷，它的發(fā)病機制可能與惡性腫瘤存在某些共同之處。在惡性腫瘤中，PI3K/AKT信號通路調(diào)控異常，上調(diào)VEGF表達，增加腫瘤血管形成。本研究擬采用EM的在位子宮內(nèi)膜和異位內(nèi)膜以及正常子宮內(nèi)膜，S-P方法檢測VEGF和Akt蛋白表達，了解EM中PI3K/Akt和VEGF是否參與EM的發(fā)生發(fā)展，為EM的防治提供新思路和理論根據(jù)。

1資料和方法

11一般資料

于2013年2月至2014年2月入院的在我院行手術(shù)治療、術(shù)后病理檢查確診為EM的患者中隨機抽取32例，選擇的患者月經(jīng)周期均規(guī)則，無生殖內(nèi)分泌疾病、急慢性盆腔炎、婦科惡性腫瘤及宮內(nèi)節(jié)育器放置術(shù)等，術(shù)前6月沒有進行過激素類藥物治療史，沒有子宮內(nèi)膜病變。收集患者的異位和在位內(nèi)膜作為實驗組；收集無EM患者30例，取其內(nèi)膜組織作為對照組。無EM患者的年齡平均約（3363±23）歲。患有EM的患者年齡平均約（354±27）歲。經(jīng)檢驗，兩組的患者在年齡、體重、月經(jīng)周期和AFS分期的差異無統(tǒng)計學(xué)意義，各組內(nèi)的平均年齡構(gòu)成無統(tǒng)計學(xué)差異。收集的病理切片由病理科專家確診為EM。該實驗經(jīng)本醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會審批通過，標本收集前均與患者簽訂知情同意書。

12方法

121標本采集取患有EM患者的子宮內(nèi)膜組織、異位內(nèi)膜組織以及無EM患者的子宮內(nèi)膜，10%甲醛固定，脫水、浸臘和包埋。每份標本行HE染色后，光鏡下觀察組織學(xué)形態(tài)，入選標本鏡下檢查找到內(nèi)膜腺體和間質(zhì)細胞。

122方法試劑均購自上海北諾生物科技有限公司，兔抗人Akt單克隆抗體（LS-C50301）；兔抗人VEGF 單克隆抗體（PA116948）、鼠抗人 CD34 單克隆抗體（MA137329），操作步驟按試劑盒說明書進行。

123結(jié)果判定VEGF 和Akt的S-P染色主要表現(xiàn)在腺上皮的胞質(zhì)，部分在間質(zhì)細胞，片狀或顆粒狀、深或淺棕黃色的染色被定義為陽性細胞。采取半定量方法計算陽性細胞的平均百分率，具體方法：在每張切片中采集5個高倍鏡視野，并且隨機計數(shù)約100個細胞，統(tǒng)計并計算每個視野下陽性細胞占100各細胞的平均百分比；陽性細胞數(shù) <10%的定義為（-）；在 10%～30% 之間的定義為（+）；在30%～70%的定義為 （++）；在70%以上的定義為 （+++）。CD34 抗體可用作有效地統(tǒng)計微血管密度（MVD）的指標，并用作定量統(tǒng)計，用低倍鏡下挑選出最高的MVD 區(qū)，顯微鏡下計數(shù)5個滿視野的微血管數(shù)量，求平均值，即可認為是該EM的平均微血管數(shù)目[1]。

13統(tǒng)計學(xué)方法

采用SPSS 130統(tǒng)計軟件，計數(shù)資料采用χ2檢驗，多組間比較用單因素方差分析，變量間的相關(guān)分析選用非參數(shù)統(tǒng)計方法，按α=005的水準，P<005則表明，拒絕零假設(shè)，說明差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2結(jié)果

表1說明：（1）VEGF、Akt、MVD在正常內(nèi)膜、EM在位內(nèi)膜及異位內(nèi)膜組織的表達差異有統(tǒng)計學(xué)意義；（2）Akt、VEGF 在異位內(nèi)膜較在位內(nèi)膜組織及正常內(nèi)膜高表達，說明Akt、VEGF可能對EM的發(fā)生、發(fā)展存在影響；（3）MVD在異位內(nèi)膜高表達，說明新生血管對腫瘤的發(fā)生、轉(zhuǎn)歸有關(guān)鍵作用。

表2說明：在促進血管生成的過程中，Akt與VEGF呈明顯正相關(guān)，PI3K/Akt信號通路促進腫瘤血管生成，可能通過促進VEGF的表達來實現(xiàn)。

3討論

子宮內(nèi)膜異位癥是具有生長功能的子宮內(nèi)膜組織碎片出現(xiàn)在子宮腔及子宮肌層以外的其他部位，以痛經(jīng)和不孕為主要臨床癥狀。在育齡女性中的發(fā)生率約為15%，嚴重影響患者的生活質(zhì)量[2] 。不孕和盆腔痛的婦女發(fā)病率可增長至35%～50%。EM表現(xiàn)為子宮內(nèi)膜腺體和間質(zhì)出現(xiàn)在子宮體以外的部位，隨卵巢激素變化，發(fā)生周期性出血。50%的婦女不孕不育與50%～60%患有慢性盆腔痛的育齡女性?；加蠩M。其病變廣泛，周圍纖維組織增生、粘連、散在褐色結(jié)節(jié)，形態(tài)多樣，并向直腸子宮陷凹深部浸潤，隨卵巢激素的周期性變化，有增生和分泌改變，易復(fù)發(fā)，很少癌變[3]。

EM是一種依賴卵巢雌、孕激素的疾病，對Ⅲ、Ⅳ期患者，根據(jù)情況，采用保留生育功能手術(shù)或保留卵巢功能或根治性手術(shù)，術(shù)后采用性激素治療，減輕患者經(jīng)期疼痛，延遲復(fù)發(fā)，增加受孕率，但無法徹底治愈[4]。

EM發(fā)病機制中“經(jīng)血逆流”是主導(dǎo)學(xué)說，但近年證實，90%女性均有經(jīng)血逆流，但其中只有10%女性發(fā)生EM[5]。說明經(jīng)血逆流只是病因，而子宮內(nèi)膜在腹腔內(nèi)種植，血液供應(yīng)的建立和支持是必不可少的。

血管生成與EM的發(fā)生和發(fā)展密切相關(guān)，最重要的促血管生成因子是VEGF[6]。VEGF具有促血管形成的功能[7]，VEGF是高度特異性的血管內(nèi)皮細胞有絲分裂原，在月經(jīng)周期中，參與子宮內(nèi)膜血管的形成。在病理情況下，VEGF與血管過度生成有密切關(guān)系。VEGF的主要生理功能有[8，9]：（1） 促進細胞的有絲分裂，降解細胞外蛋白和基底膜，從而使血管內(nèi)皮細胞遷移并增生；（2）增加血管的通透性，為血管芽延伸生長提供良好基質(zhì)；（3）在細胞漿內(nèi)，快速短暫地增加鈣離子濃度，刺激磷脂酰肌醇的磷酸化，上調(diào)信號通路的表達。

VEGF與受體結(jié)合后具有生物活性，F(xiàn)lk-1/KDR與VEGF結(jié)合后誘導(dǎo)血管生成的能力最強。VEGF的表達常出現(xiàn)在感染性疾病、腫瘤、傷口愈合、排卵，月經(jīng)和胚胎發(fā)育等。有研究表明：在正常內(nèi)膜組織中，VEGF的表達低于EM的異位內(nèi)膜、在位內(nèi)膜及腹腔液中，表明EM與VEGF的過表達有關(guān)。

細胞內(nèi)重信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路之一PI3K/Akt信號通路調(diào)控細胞的增殖、向不同方向分化以及細胞凋亡。Kayisli[10]和Quezada[11]均證實了PI3K/Akt通路參與調(diào)節(jié)細胞增生和子宮內(nèi)膜自身穩(wěn)態(tài)調(diào)節(jié)。

PI3K/Akt信號通路由PI3K家族與其下游分子絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶Akt或蛋白激酶B（PKB）組成。Akt由3部分構(gòu)成：即氨基端的PH結(jié)構(gòu)域、中間的激酶活性區(qū)及羧基端的尾部。PI3K/Akt信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路中起關(guān)鍵作用的是Akt蛋白激酶，Akt的磷酸化有利于Akt達到最大活化效應(yīng)[12]。

PI3K/Akt信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路被上調(diào)激活后，誘發(fā)細胞無限增殖和凋亡抵抗，故該通路與各種腫瘤的發(fā)生發(fā)展有關(guān)[13]。Gordan等[14]研究表明，PI3K/Akt信號通路可通過多種途徑上調(diào)低氧誘導(dǎo)因子-la （HIF-la）的表達。HIF-1a可促進VEGF的表達，而VEGF可通過其本身和活化PI3K/Akt信號通路兩種途徑促進血管形成。PTEN則通過阻滯PI3K/Akt信號通路抑制血管形成[15]。

各項研究證明，在多種腫瘤組織中，出現(xiàn)PI3K/Akt信號通路上調(diào)，誘使細胞惡變、癌細胞存活、抑制其凋亡、加快腫瘤血管的形成、促進腫瘤細胞的增殖、向深層浸潤、腫瘤轉(zhuǎn)移以及增加腫瘤細胞耐藥[16]。

本實驗初步證明：（1）EM異位內(nèi)膜組織中微血管密度（MVD）較在位內(nèi)膜及正常內(nèi)膜組織高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義。說明血管生成確實對EM的發(fā)生、發(fā)展過程有重要的影響；（2）EM異位內(nèi)膜組織中 Akt、VEGF的表達較在位內(nèi)膜及正常內(nèi)膜組織高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義。說明PI3K/Akt、VEGF 對EM的發(fā)病、轉(zhuǎn)歸有重要作用；（3）Akt陽性表達組中，VEGF也高表達；Akt表達陰性組中，VEGF也低表達，差異有統(tǒng)計學(xué)意義。說明在EM的生物學(xué)過程中，Akt與VEGF呈正相關(guān)。PI3K/Akt可能通過VEGF誘導(dǎo)血管內(nèi)皮細胞增長，從而促進EM的發(fā)生、發(fā)展。本研究提示EM血管生成過程中，PI3K/Akt信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路與VEGF 之間呈正相關(guān)。能否通過阻斷PI3K/Akt信號通路來靶向調(diào)控VEGF的表達，從而減少血管生成，降低異位內(nèi)膜轉(zhuǎn)移、復(fù)發(fā)機率，有待進一步研究。

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（收稿日期：2015-08-20）