郭　亮, 曹日暉, 范文璽, 甘紫云, 馬　芹

(1. 石河子大學(xué)化學(xué)化工學(xué)院, 石河子 832003;2. 新疆華世丹藥物研究有限責(zé)任公司, 烏魯木齊 830011;3. 中山大學(xué)化學(xué)與化學(xué)工程學(xué)院, 廣州 510275)

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雙-β-咔啉衍生物的設(shè)計、合成及抗腫瘤活性

郭亮1,2, 曹日暉3, 范文璽2, 甘紫云2, 馬芹2

(1. 石河子大學(xué)化學(xué)化工學(xué)院, 石河子 832003;2. 新疆華世丹藥物研究有限責(zé)任公司, 烏魯木齊 830011;3. 中山大學(xué)化學(xué)與化學(xué)工程學(xué)院, 廣州 510275)

摘要以去氫駱駝蓬堿為原料, 經(jīng)過脫甲基、 烷基化等步驟, 合成了一系列雙-β-咔啉衍生物. 目標化合物均經(jīng)核磁共振譜(NMR)和質(zhì)譜(MS)進行結(jié)構(gòu)確證. 以順鉑為陽性對照藥, 采用四甲基偶氮唑鹽(MTT)法考察了目標化合物體外抗腫瘤(Bel-7402, 786-0, BGC-823, A375, 769-P和MCF7等6株細胞)活性. 結(jié)果表明, 化合物4g和4o與陽性對照藥相比具有良好的抗腫瘤活性, 其半抑制濃度(IC50)值均小于10 μmol/L. 初步構(gòu)效關(guān)系研究表明, 當橋鏈亞甲基數(shù)目為8～10,β-咔啉環(huán)上9-丁基或9-異丁基取代時, 化合物的抗腫瘤活性較強.

關(guān)鍵詞去氫駱駝蓬堿;β-咔啉; 抗腫瘤活性; 構(gòu)效關(guān)系

雙體分子抗腫瘤藥物是通過橋鏈將2個抗腫瘤單體分子結(jié)合起來, 使藥物分子與受體的親和性及親和力顯著提高, 從而提高藥物的抗腫瘤活性[1]. 近年來, 隨著多價態(tài)結(jié)合理論在藥物研發(fā)設(shè)計中的廣泛應(yīng)用, 國內(nèi)外對雙體分子藥物的研究逐漸增多. 結(jié)合藥物分子根據(jù)受體與藥物之間的配位關(guān)系, 目前已設(shè)計合成了二聚、 寡聚及多聚抑制劑[2]. 駱駝蓬(PeganumharmalaL.)為一種蒺藜科多年生草本植物, 是蒙古族和維吾爾族的習(xí)用藥材, 已被列入衛(wèi)生部維吾爾藥藥品標準[3]. 去氫駱駝蓬堿(Harmine)是駱駝蓬的主要化學(xué)成分, 該生物堿具有抗腫瘤[4～6]、 抗阿爾茨海默病[7]、 抗病毒[8～10]、 抗炎[11～13]、 抗菌[14]及殺蟲[15]等多方面的藥理作用, 但因其具有神經(jīng)毒性而未能開發(fā)成藥物.

我們[6,16～18]曾合成了一系列去氫駱駝蓬堿衍生物, 初步獲得了該類化合物抗腫瘤的構(gòu)效關(guān)系, 發(fā)現(xiàn)7-甲氧基取代為該類化合物的神經(jīng)毒性位點; 并根據(jù)雙體分子多價態(tài)結(jié)合理論設(shè)計、 合成了一系列兩分子1-甲基-β-咔啉通過連接基連在一起的化合物, 通過生物活性測試發(fā)現(xiàn)當橋鏈亞甲基數(shù)目為4時(B-9-3, 結(jié)構(gòu)見圖1), 該類化合物對人肺癌、 乳房癌和結(jié)腸癌細胞表現(xiàn)出高抑制活性, 而且該化合物可以抑制人臍靜脈內(nèi)皮細胞株中微管的形成[19,20]. Sandler等[21]從深水海綿(Plakortisnigra)中分離出β-咔啉二聚體(Plakortamines C, 結(jié)構(gòu)見圖1), 其對HCT-116人體結(jié)腸癌細胞株表現(xiàn)出抑制活性. 朱華結(jié)等[22]對該類化合物的立體結(jié)構(gòu)進行了研究.

基于前期工作[6,16～18], 本文以去氫駱駝蓬堿為中心結(jié)構(gòu), 首先對神經(jīng)毒性位點進行結(jié)構(gòu)修飾, 再進行二聚體化合物的合成, 共得到了19個具有新穎結(jié)構(gòu)的7-雙-β-咔啉衍生物, 采用四甲基偶氮唑鹽(MTT)法考察了其在細胞水平的抗腫瘤活性.

1實驗部分

1.1試劑與儀器

碘甲烷、 碘乙烷、 碘代正丁烷、 碘代正己烷、 碘代正辛烷、 碘代異丁烷、 1-溴-3-苯基丙烷、N,N-二甲基甲酰胺(DMF)和氫化鈉(NaH)均為市售分析純或化學(xué)純試劑; 1,3-二溴丙烷、 1,4-二溴丁烷和1,5-二溴戊烷等二溴烷烴均購自百靈威試劑公司; 去氫駱駝蓬堿(含量>98%), 由本課題組提取獲得.

Varian Saturan 2000型質(zhì)譜儀(美國瓦里安技術(shù)中國有限公司); Varian inova-400型核磁共振儀(CDCl3或CD2Cl2為溶劑, TMS為內(nèi)標, 美國瓦里安技術(shù)中國有限公司); Model 680型酶標儀(美國伯樂生命醫(yī)學(xué)產(chǎn)品有限公司); WRS-3型熔點測定儀(上海儀電物理光學(xué)儀器有限公司); 薄層色譜用硅膠G(臺州市路橋四甲生化塑料品廠); 柱色譜用硅膠(200～300目, 青島海洋化工有限公司).

1.2目標化合物的合成

目標化合物的合成路線見Scheme 1.

1.2.1中間體2a～2g和3a～3g的合成中間體2a～2g參考文獻[6]方法合成, 中間體3a～3g參考文獻[23]方法合成. 產(chǎn)物2a～2g和3a～3g均為白色固體, 其中化合物2d, 2e, 3a, 3d和3e為新化合物, 各中間體的表征結(jié)果分別列于表1和表2.

1.2.2雙-β-咔啉化合物(4a～4s)的合成將1,9-二甲基-7-羥基-β-咔啉(6 mmol, 1.27 g)、 DMF

(30 mL)、 NaH(8 mmol, 0.32 g)和二鹵代烷烴(3 mmol, 360 μL)混合, 常溫下攪拌反應(yīng)4 h后, 再升溫至80 ℃反應(yīng)8～24 h, 用薄層色譜(TLC)監(jiān)測反應(yīng)進程[展開劑:V(丙酮)∶V(石油醚)=1∶1]. 反應(yīng)完畢, 將反應(yīng)混合物倒入100 mL水中, 常溫下攪拌2 h后, 用乙酸乙酯萃取, 合并萃取液, 再依次用水和飽和鹽水洗滌, 用無水硫酸鈉干燥, 減壓濃縮至干, 用硅膠柱層析[V(丙酮)∶V(石油醚)=1∶1], 得到目標化合物4a～4s. 目標化合物的理化性質(zhì)數(shù)據(jù)列于表3, 核磁共振波譜數(shù)據(jù)列于表4.

Continued

Continued

a. CDCl3(4a—4o), CD2Cl2(4p—4s);b. CDCl3(4a—4o), CD2Cl2(4p—4s).

1.3體外抗腫瘤活性測試

以HepG2, HT-29, Blu-87, 22RV1, 786-0和MCF-7細胞為對象, 采用MTT法[24]測試了目標化合物4a～4s對癌細胞的抑制活性. 分別將生長狀態(tài)良好, 處于對數(shù)生長期的細胞株以1×104個/mL的濃度接種于96孔板中, 置于37 ℃的CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h, 更換新鮮培養(yǎng)液, 加入滅菌處理的待測化合物, 繼續(xù)培養(yǎng)48 h后, 棄去培養(yǎng)液, 每孔加20 μL含5 mg/mL MTT的RPMI1640培養(yǎng)液, 繼續(xù)培養(yǎng)4 h, 除去上層清液后, 每孔加入100 μL DMSO, 振蕩約10 min溶解沉淀, 采用酶標儀檢測OD值(波長為490 nm), 采用作圖法計算每個樣品的IC50值.

2結(jié)果與討論

2.1化合物的合成

根據(jù)前文[6,16～18]的構(gòu)效關(guān)系分析,β-咔啉環(huán)9-位取代有助于提高該類化合物的抗腫瘤活性, 因此在DMF溶液中, 存在NaH的條件下與相應(yīng)的烷基化試劑完成N9-烷基化反應(yīng). 進一步對7-位進行脫甲基反應(yīng), 主要去除化合物神經(jīng)毒性, 然后與相應(yīng)的二鹵代烷烴反應(yīng)獲得目標化合物. 該反應(yīng)過程中采用了2種堿性體系(DMF/NaH和DMF/K2CO3), 從反應(yīng)時間、 收率及后處理的難易等方面對2種體系進行了考察, 發(fā)現(xiàn)在DMF/NaH體系中反應(yīng)速率明顯比DMF/K2CO3體系的快, 而且DMF/K2CO3體系因反應(yīng)比較慢導(dǎo)致原料反應(yīng)不完全, 后處理較復(fù)雜, 產(chǎn)率較低. 當β-咔啉環(huán)9-位無取代基時,N9-H原子顯酸性, 在DMF/NaH體系中, 因NaH堿性較強, 會脫去N上的H, 導(dǎo)致N9-烷基化反應(yīng); 而DMF/K2CO3體系由于堿性弱, 只能脫去β-咔啉環(huán)羥基的H, 而不能脫去N上的H, 導(dǎo)致O7-烷基化, 從而以較高產(chǎn)率獲得目標產(chǎn)物.

2.2體外抗腫瘤活性及初步構(gòu)效關(guān)系分析

以順鉑(DDP)作為陽性對照, 采用MTT法測試了目標化合物的體外抗腫瘤活性. 為提高目標化合物的水溶性, 制備成鹽酸鹽供實驗用. 目標化合物的活性數(shù)據(jù)列于表5. 由表5可見, 化合物4c,4k和4r幾乎對所有細胞株的IC50值均>100 μmol/L, 未表現(xiàn)出抗腫瘤活性; 而化合物4g, 4l, 4o和4s比其它化合物的活性好, 說明橋鏈亞甲基的數(shù)目越多對活性影響越大, 化合物的活性越好. 對比各系列化合物活性數(shù)據(jù)發(fā)現(xiàn),β-咔啉環(huán)9-位取代基對該類化合物的抗腫瘤活性也有影響; 由于前期已獲知9-芳基取代時, 7-脫甲基并不能獲得目標產(chǎn)物[16], 所以該系列化合物選擇9-取代基時, 只選擇了烷基及芳烷基取代. 活性測試結(jié)果表明, 9-正丁基取代衍生物(4e～4g)和9-異丁基取代衍生物(4m～4o)的體外抗腫瘤活性整體優(yōu)于其它系列. 其中以化合物4g和4o體外抗腫瘤作用尤其好, 其IC50值對所有細胞系均小于10 μmol/L, 活性數(shù)據(jù)優(yōu)于陽性對照藥順鉑. 通過對比細胞系之間的實驗結(jié)果, 發(fā)現(xiàn)該類型化合物對HT-29和Blu-87較其它細胞系稍敏感, 整體顯示出較強的抗腫瘤活性.

Continued

* Data represent the mean values of three independent determinations; NT: not tested.

3結(jié)論

以去氫駱駝蓬堿為原料, 設(shè)計合成了19個新的7-雙-β-咔啉類衍生物. 目標化合物的體外抗腫瘤測試結(jié)果表明, 當橋鏈亞甲基的數(shù)目為8～10,β-咔啉環(huán)9-位丁基或異丁基取代時, 活性較好; 部分7-雙-β-咔啉衍生物僅對1或2種腫瘤細胞系具有良好的抗腫瘤活性, 推測此類化合物可能具有較高的選擇性.

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(Ed.: P, H, Y, K)

? Supported by the Xinjiang Production and Construction Corps Leadership in Scientific Innovation Program, China(No.2015BC001).

Design, Synthesis andinvitroAntitumor Activities of Novel Bivalentβ-Carbolines?

GUO Liang1,2, CAO Rihui3*, FAN Wenxi2, GAN Ziyun2, MA Qin2

(1.SchoolofChemistryandChemicalEngineering,ShiheziUniversity,Shihezi832003,China;2.XinjiangHuashidanPharmaceuticalResearchCo.Ltd.,Urumqi830011,China;3.SchoolofChemistryandChemicalEngineering,SunYat-senUniversity,Guangzhou510275,China)

KeywordsHarmine;β-Carboline; Antitumor activity; Structure-activity relationship

AbstractA series of novel bivalentβ-carbolines with a spacer of three to ten methylene units between the 7-oxygen was synthesized and characterized by nuclear magnetic resonance(NMR) and mass spectrometry(MS). The antitumor activities against Bel-7402, 786-0, BGC-823, A375, 769-P and MCF7 cell linesinvitrowere investigated by MTT method. The results demonstrated that compounds 4c, 4k and 4r were almost inactive against all tumor cell lines, compounds 4g and 4o displayed significant cytotoxic activities with IC50value of lower than 10 μmol/L against all tumor cell lines. Most compounds displayed good and selective cytotoxic activities against HT-29 and Blu-87 cell lines. Primary structure-activity relationships(SARs) analysis indicated that the length of the spacer affected cytotoxic activitiesinvitro, and 8—10 methylene units were more favorable. Moreover,n-butyl ori-butyl substituents in position-9 ofβ-carboline facilitated the antitumor potencies.

收稿日期:2016-02-19. 網(wǎng)絡(luò)出版日期: 2016-05-18.

基金項目:新疆生產(chǎn)建設(shè)兵團中青年科技創(chuàng)新領(lǐng)軍人才計劃項目(批準號: 2015BC001)資助.

中圖分類號O626

文獻標志碼A

聯(lián)系人簡介: 曹日暉, 男, 博士, 副教授, 主要從事抗腫瘤新藥構(gòu)效關(guān)系研究. E-mail: caorihui@sysn.edu.cn