趙 麗，蘇何玲，劉 妍，徐東平

1.桂林醫(yī)學(xué)院，廣西 桂林 541004； 2. 解放軍三〇二醫(yī)院臨床研究管理中心

乙型肝炎病毒多聚酶/反轉(zhuǎn)錄酶區(qū)耐藥突變研究進(jìn)展

趙 麗1，蘇何玲1，劉 妍2，徐東平2

1.桂林醫(yī)學(xué)院，廣西 桂林 541004； 2. 解放軍三〇二醫(yī)院臨床研究管理中心

目前臨床最常用的抗乙型肝炎病毒(HBV)藥物是核苷(酸)類似物(NAs)，但長期使用可導(dǎo)致HBV發(fā)生基因突變引起耐藥，導(dǎo)致治療失敗。HBV多聚酶/反轉(zhuǎn)錄酶(RT)區(qū)是NAs藥物治療作用的靶點，公認(rèn)的耐藥突變也都發(fā)生在RT區(qū)內(nèi)。不同NAs藥物的耐藥形式往往不同，但也存在交叉耐藥和多重耐藥突變形式。深入觀察抗病毒治療過程中耐藥突變及演變規(guī)律，分析各種突變形式的表型特點及其與臨床表現(xiàn)的關(guān)系，用靈敏方法對患者病毒RT區(qū)耐藥相關(guān)突變進(jìn)行動態(tài)監(jiān)測，早期發(fā)現(xiàn)HBV耐藥，合理進(jìn)行挽救治療，對慢性乙型肝炎治療具有重要意義。

乙型肝炎病毒; 耐藥；突變；抗病毒治療

慢性乙型肝炎病毒(HBV)感染仍然是一個嚴(yán)重的全球性的公共衛(wèi)生問題。目前治療HBV的藥物有兩大類：α-干擾素和核苷(酸)類似物(NAs)。NAs分為核苷類似物和核苷酸類似物，前者包括拉米夫定(LAM)、替比夫定(LDT)和恩替卡韋(ETV)，后者包括阿德福韋酯(ADV)和富馬酸替諾福韋酯(TDF)等，NAs由于抑制病毒復(fù)制作用較快、服用方便、副作用低而廣泛用于臨床治療，但需長期服用可產(chǎn)生病毒耐藥[1]。本文主要就目前NAs治療過程中出現(xiàn)的耐藥研究進(jìn)展，結(jié)合課題組研究結(jié)果，作一概述。

1 核苷(酸)類似物耐藥機(jī)制

HBV是一種小分子,部分雙鏈環(huán)狀的DNA病毒，屬于嗜肝DNA病毒屬。在HBV復(fù)制過程中，由于其高復(fù)制率及RT校對功能的缺乏，具有高變異特性。雖然NAs抑制HBV復(fù)制的效果較強(qiáng)，但對HBV復(fù)制的原始模板共價閉合環(huán)狀DNA(cccDNA)無直接作用，需長期使用，可引起病毒發(fā)生突變，其中對藥物壓力適應(yīng)性強(qiáng)的變異病毒可獲得選擇性擴(kuò)增，產(chǎn)生耐藥突變，導(dǎo)致臨床抗HBV治療失敗[2-3]。目前抗HBV藥物NAs作用靶點均在病毒的多聚酶/逆轉(zhuǎn)錄酶(RT)區(qū)，已知的耐藥相關(guān)突變也均位于RT區(qū)。NAs耐藥分為原發(fā)耐藥突變和繼發(fā)耐藥突變(又稱為復(fù)制力補(bǔ)償突變)兩種。前者直接引起病毒對藥物敏感性的下降，后者的主要作用是恢復(fù)因原發(fā)耐藥突變引起的自然復(fù)制力下降。HBV發(fā)生耐藥突變后，可先后引起病毒學(xué)突破和生化學(xué)突破，在診斷病毒耐藥突變過程中，根據(jù)檢測方法的不同，將HBV耐藥分為基因型耐藥和表型耐藥，基因型耐藥指的是在抗病毒治療過程中檢測到公認(rèn)的與NAs相關(guān)的HBV耐藥基因突變；而表型耐藥是指在體外分別將帶有野生和耐藥相關(guān)變異的HBV基因組重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染支持HBV復(fù)制的細(xì)胞中(如HepG2)證實，并加入梯度藥物，比較藥物的敏感性，出現(xiàn)與基因耐藥相關(guān)的抗病毒藥物敏感性降低，以半數(shù)有效濃度( EC50) 表示[4]。除此之外，NAs耐藥突變的產(chǎn)生與患者的藥物代謝差異及免疫狀態(tài)等方面也存在一定關(guān)聯(lián)。

2 LAM相關(guān)耐藥突變

LAM屬于胞嘧啶類核苷類似物，作為第1個獲得美國FDA批準(zhǔn)的口服抗病毒藥物，它的出現(xiàn)給廣大的HBV感染者帶來了福音。但作為第1代NAs類抗HBV藥物，LAM的耐藥基因屏障最低，病毒的相關(guān)耐藥發(fā)生率最高。聯(lián)合使用其他核苷(酸)類似物，如LAM+ADV可顯著降低其耐藥發(fā)生的風(fēng)險[5]。目前發(fā)現(xiàn)LAM原發(fā)耐藥公認(rèn)的位點是YMDD即聚合酶區(qū)rtM204V/I，前者通常伴隨L180M繼發(fā)耐藥突變，而后者常單獨出現(xiàn)或伴隨rtL80I繼發(fā)耐藥突變，rtM204V和rtM204I突變HBV對LAM敏感性的下降通常超過500倍。除此之外，有報道過其他形式的LAM相關(guān)突變，我們課題組[6]對發(fā)生rtL229突變的慢性乙型肝炎患者的樣本HBV進(jìn)行測序，發(fā)現(xiàn)一些患者出現(xiàn)rtM204I+rtL229突變株共存，通過構(gòu)建體外rtL229有關(guān)表達(dá)載體，經(jīng)LAM處理，發(fā)現(xiàn)rtL229F突變伴隨rtM204I出現(xiàn)在LAM的治療過程，對LAM敏感性影響不大，但rtL229F可以恢復(fù)rtM204I突變株的復(fù)制能力，證實rtL229F是LAM耐藥相關(guān)的繼發(fā)突變。我們還發(fā)現(xiàn)rtM204Q突變是一種新型的LAM耐藥突變模式，在對大樣本患者篩查中發(fā)現(xiàn)，有7例LAM耐藥患者出現(xiàn)rtM204Q單獨突變，或聯(lián)合經(jīng)典的LAM耐藥突變，表型分析結(jié)果顯示rtM204Q的LAM EC50與野生株增加了78倍，是一種新的LAM原發(fā)耐藥突變模式，由于rtM204Q突變對ADV具有敏感性，因此在臨床上除了可以采用TDF挽救治療方案外，也可以采用ADV或ADV+LAM挽救治療方案[7]。

在長期的用藥研究中，針對慢性乙型肝炎患者發(fā)生LAM耐藥的補(bǔ)救治療方案的選擇十分重要。2012年的一項研究顯示，LAM耐藥患者采取的4種補(bǔ)救治療方案中，經(jīng)ADV+ETV補(bǔ)救治療后耐藥率最低，但在我國臨床上最常使用的卻是ADV單一療法[8]。同時由于YMDD突變株在慢性感染治療過程中易引起耐藥性，因此在患者發(fā)生病毒學(xué)和生化突變前檢測出該病毒株突變模式有助于臨床及時調(diào)整和提高治療效果。LAM耐藥型與野生型病毒一樣具有水平傳播力，一個直接的證據(jù)是在少數(shù)未接受NAs治療的急性乙型肝炎患者樣本中檢出了LAM耐藥株。

本課題組Xu等[9]對201例未接受過NAs治療的急性乙型肝炎患者血清進(jìn)行分析，通過直接測序并通過克隆測序證實14例陽性耐藥患者中有11例出現(xiàn)了LAM耐藥突變模式rtM204I/V。此外Baxa等[10]也在未接受過抗病毒治療的慢性乙型肝炎患者中檢測到少數(shù)患者發(fā)生耐藥突變。這些研究均表明LAM耐藥株具有水平傳播能力。

3 ADV相關(guān)耐藥突變

ADV是一種中效的抗HBV藥物,其基因耐藥屏障也較低，在我國廣泛用于LAM耐藥患者和慢性乙型肝炎的初治過程中,HBV感染患者接受ADV 治療 1、2、3、4、5 年 HBV 累積耐藥率分別為 0、3%、11%、18%、29%，一旦發(fā)生耐藥，臨床則考慮換藥或與其他核苷類藥物聯(lián)合治療[11]。目前，公認(rèn)的經(jīng)典的ADV耐藥突變?yōu)閞tA181V和rtN236T，其中rtN236T突變主要發(fā)生在B基因型HBV感染中，而且發(fā)現(xiàn)大部分ADV耐藥突變都是兩個或兩個以上[12]。此外，有研究提示還存在其他ADV相關(guān)耐藥突變形式。本課題組Liu 等[13-14]通過大樣本臨床耐藥檢測分析、臨床隨訪監(jiān)測結(jié)合表型耐藥分析，發(fā)現(xiàn)并鑒定了兩種新的ADV原發(fā)耐藥突變模式，即rtA181S和rtN236V，其中通過測序分析大樣本的慢性乙型肝炎患者，檢出帶有rtA181S突變的患者占有率為0.53%(98/18 419)，其在經(jīng)ADV 治療過的5 344 例患者中占0.86%(46/5 344)，通過TA 基因克隆分析RT區(qū)，檢測發(fā)現(xiàn)在發(fā)生病毒學(xué)突破時有6 例患者均出現(xiàn)rtA181S 突變，表型耐藥分析rtN236T、rtA181S、rtA181V 和rtA181S+rtN236T突變株的EC50分別是野生株的7.9倍、3.7倍、5.6倍、9.8倍，提示rtA181S是一種中等ADV相關(guān)耐藥突變。由于rtA181S突變對LAM、ETV、TDF 3種藥物敏感，在2例發(fā)生rtA181S突變的患者中采取ETV和LAM+ADV挽救治療方案，發(fā)現(xiàn)ETV和LAM+ADV用藥能夠有效的抑制病毒復(fù)制，但LAM+ADV聯(lián)合用藥不能減少rtA181S的突變比例，治療過程中rtA181S突變株持續(xù)存在，提示ETV挽救治療可能更有效。同年課題組在6例ADV難治性患者中檢測到rtN236V突變，表型耐藥分析顯示rtN236V突變是一種新型少見的ADV耐藥突變，其與rtA181S突變類似。

此外，本課題組[15]對18 419例患者分析發(fā)現(xiàn)rtI233V突變與ADV耐藥相關(guān)，測序檢測出rtI233V突變在經(jīng)ADV治療和未接受治療的患者中分別為38/344、8/13 075(P<0.01),克隆測序發(fā)現(xiàn)8例經(jīng)ADV治療過的患者在發(fā)生病毒學(xué)突變時均檢測到rtI233V±rtA181V/rtN236T突變存在，表型耐藥顯示rtI233V、rtN236T、rtI233V+N236T突變株對ADV的耐藥倍數(shù)是野生株的2倍、6.82倍、5.28倍，在ADV用藥過程中rtL233V、rtN236T、rtI233V+N236T突變株的復(fù)制能力與野生株相比分別為97.5%、30.2%、69.7%。發(fā)現(xiàn)rtI233V突變雖然對ADV的敏感性低，但能夠恢復(fù)rtN236T突變株的復(fù)制能力，提示rtI233V突變可能是一種新的ADV相關(guān)的替換突變。由于rtA181S、rtN236V、rtI233V 3種突變均對LAM、ETV、TDF敏感，在針對發(fā)生rtA181S、rtN236V、rtI233V突變的ADV耐藥患者中，臨床均可以使用ETV挽救治療，抑制病毒復(fù)制，使ALT恢復(fù)至正常水平。

根據(jù)最新的慢性乙型肝炎防治指南[16]在針對ADV耐藥治療失敗的患者，可以采取以下兩種挽救方案:(1) 針對發(fā)生ADV耐藥，但之前未使用LAM的患者，可以換用ETV或TDF; (2) 針對治療LAM/LdT耐藥時出現(xiàn)的ADV耐藥患者，可以換用TDF或ETV+ADV。

4 ETV相關(guān)耐藥突變

ETV是一種高基因屏障NAs藥物，是所有抗HBV藥物中發(fā)生耐藥最低的。據(jù)統(tǒng)計其在初治患者中6年耐藥率僅1.2%，但在作為LAM耐藥患者的挽救治療中6年耐藥率達(dá)60%[17]。目前認(rèn)為ETV耐藥是在LAM耐藥基礎(chǔ)上出現(xiàn)的，當(dāng)出現(xiàn)LAM敏感的突變位點時，病毒對ETV的敏感性會下降[18]。ETV耐藥多在rtL180M、rtM204I/V的基礎(chǔ)上出現(xiàn)3個以上的位點突變，如rtT184A/G/F/I/L/S、rtS202C/G/I或rtM250I/L/V。此外，Hayashi等[19]從對1例ETV難治性患者的血清樣本中發(fā)現(xiàn)了2種可能與ETV耐藥相關(guān)的新型突變rtI163V和rtA186T的存在,該突變伴隨LAM耐藥出現(xiàn)。將發(fā)生病毒學(xué)突破的樣本血清接種到小鼠中，通過構(gòu)建小鼠模型，動態(tài)監(jiān)測證實rtA186T突變與ETV耐藥密切相關(guān)，能夠降低HBV聚合酶對ETV的親和力，而rtI163V突變與ETV耐藥不相關(guān)。上述研究均表明ETV耐藥與LAM耐藥相關(guān)，這可能對指導(dǎo)臨床聯(lián)合用藥有幫助，但是否存在其他ETV耐藥有待研究。

在長期用藥研究中，臨床上長期使用ETV抗病毒治療安全有效，通過對慢性乙型肝炎患者使用5年的ETV療效觀察，發(fā)現(xiàn)除了 TDF以外，ETV相比其他抗病毒藥物對HBV DNA的抑制作用更強(qiáng)，其耐藥率低，因此推薦ETV作為第一線抗病毒藥物治療[20]。

5 TDF相關(guān)耐藥突變

TDF是與針對人免疫缺陷病毒1型和HBV的NAs藥物。TDF是目前耐藥基因屏障最高的藥物之一，其抗病毒治療效果強(qiáng)，幾乎不發(fā)生耐藥。迄今為止，尚未有證實的有關(guān)TDF耐藥突變形式存在。以往有研究提出rtA194T[21-22]為TDF耐藥相關(guān)突變，但未獲得公認(rèn)。Murakami等[23]在有關(guān)TDF對發(fā)生HBV耐藥克隆的影響的研究中，發(fā)現(xiàn)TDF對rtA181T/ N236T的敏感性有所降低，TDF敏感性因HBV基因型和耐藥性HBV克隆的不同而不同。此外，最新研究發(fā)現(xiàn)經(jīng)TDF治療后，約60%的病毒血癥患者中檢測到rtD263E突變存在，推測該突變可能是一種TDF應(yīng)答不佳相關(guān)突變形式[24]。

6 NAs多重耐藥突變

多重耐藥突變是指在HBV基因組上同時出現(xiàn)了針對核苷類和核苷酸類抗HBV藥物的耐藥突變。目前，隨著NAs抗病毒藥物的廣泛使用，LAM、ADV、ETV、TDF幾代藥物頻繁應(yīng)用于臨床慢性乙型肝炎感染的治療過程，其中LAM、ADV作為低耐藥基因屏障藥物，其耐藥發(fā)生率呈上升趨勢，在針對耐藥突變而采取的挽救治療或其他原因而應(yīng)用的多種NAs治療的慢性乙型肝炎患者體內(nèi)，可能存在針對多種藥物聯(lián)合治療而引發(fā)的耐藥突變。

本課題組Liu等[25]在回顧性分析大樣本慢性乙型肝炎患者中，在經(jīng)LAM、ADV、ETV及LAM+ADV聯(lián)合治療的患者體內(nèi)檢測到rtL180M+A181V+S202G+M204V+N236T、rtL180M+S202G+M204V+N236T兩種帶有LAM和ADV耐藥的多重耐藥突變的病毒株，該病毒株對LAM、ETV、ADV單一治療和LAM+ADV聯(lián)合治療的敏感性下降。在此之前，本課題組[26]報道了1例發(fā)生多重耐藥的慢性乙型肝炎患者，通過動態(tài)監(jiān)測患者NAs用藥和多重耐藥發(fā)生的演變過程，發(fā)現(xiàn)ETV耐藥不僅在LAM耐藥突變基礎(chǔ)上出現(xiàn)，而且能夠加速LAM耐藥突變的出現(xiàn)。在經(jīng)LAM、ADV、ETV序貫治療過程中患者由單一耐藥突變發(fā)展到多重耐藥突變?？寺y序共檢出33種病毒突變株，其中3種為多重耐藥突變株，即rtL180M+A181V+S202G+M204V+N236T、L180M+S202G+M204V+N236T和L180M+A181V+S202G+M204V的存在。我們通過對大樣本的測序篩查，在40例患者樣本中共檢出了11種多重耐藥突變形式，采用ADV+ETV治療對多重耐藥HBV感染有較好的抑制效果[27]。Kim 等[28]研究經(jīng)LAM、ADV、ETV單一治療和LAM+ADV挽救治療后發(fā)生多重耐藥突變的患者，分析6例接受過LAM+ADV挽救治療的患者，通過體外克隆實驗，發(fā)現(xiàn)大部分多重耐藥突變發(fā)生在不同的基因組，提示LAM+ADV補(bǔ)救治療效果可能與多重耐藥株突變基因位點無關(guān)，而取決于藥物潛在的低抗病毒阻力，因此認(rèn)為有效的聯(lián)合用藥對多重耐藥患者是一種有效的補(bǔ)救治療。

當(dāng)前，隨著NAs在臨床抗病毒治療過程中的廣泛使用，針對HBV感染患者的治療方案也發(fā)生了很大的變化，從以往一用藥到現(xiàn)在聯(lián)合用藥。雖然在一定程度抑制了疾病的進(jìn)展，取得一定的臨床療效。但由此引發(fā)的耐藥突變問題變得也更為復(fù)雜，同時帶來的經(jīng)濟(jì)問題也給廣大患者造成了一定負(fù)擔(dān)。為此，需要臨床醫(yī)生提高對HBV耐藥發(fā)生的認(rèn)識，以采取有效的應(yīng)對措施減少耐藥發(fā)生，提高抗HBV治療效果。

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(責(zé)任編輯：王全楚)

The progress of drug resistant mutation in polymerase/reverse transcriptase of hepatitis B virus

ZHAO Li1, SU Heling1, LIU Yan2, XU Dongping2

1．Guilin Medical University, Guilin 541004; 2.Center for Clinical Research and Translational Medicine, 302 Hospital of PLA,China

Currently nucleos (t) ide analogs (NAs) are most common anti-hepatitis B virus (HBV) drug used in clinic. However, the requirement of long-term use may lead to treatment failure due to drug-resistant mutation of the virus. As HBVpolymerase/reverse transcriptase is the target for anti-HBV NAs, drug-resistant mutations occur in this region. Different NAs usually have individual mutational patterns, while cross and multiple drug-resistant mutational patterns also exist. It is important for valid management of chronic hepatitis B by carefully observing occurrence and evolution of drug-resistant mutants during anti-HBV therapy, using sensitive assays for early detection and dynamical monitoring of viral resistance, and therefore conducting reasonable rescue therapy on time.

Hepatitis B virus; Drug resistance; Mutation; Antiviral therapy

國家自然科學(xué)基金面上項目(81371852)

趙麗，碩士研究生，研究方向：主要從事乙肝病毒基因變異方面的研究。E-mail: zhaoli302@sina.cn

徐東平，研究員，E-mail: xudongping302@sina.com；劉妍，副研究員，E-mail:Liuyan5360@163.com

10.3969/j.issn.1006-5709.2016.11.029

R512.6+2

A

1006-5709(2016)11-1317-04

2016-03-17