周靜

（中國人民解放軍68305部隊，甘肅 永登 730305）

流式細胞術(shù)的臨床應用及研究進展

周靜

（中國人民解放軍68305部隊，甘肅 永登 730305）

流式細胞術(shù)已從最初的實驗室技術(shù)發(fā)展成為臨床病理學家和免疫學家用于診斷、監(jiān)測腫瘤和免疫性疾病病人病情的常規(guī)工具。文章將對流式細胞術(shù)在腫瘤、免疫性疾病、細胞治療和移植等方面的應用進展作綜述。

流式細胞術(shù)；臨床應用

流式細胞術(shù)（Flow Cytometry，F(xiàn)CM）就是讓細胞處于快速流動中，然后對流動中的細胞或生物粒子進行分析或分選。它是集成了激光技術(shù)、計算機科學、流體力學、光電測量技術(shù)、細胞熒光化學技術(shù)等多項技術(shù)的一種生物分析技術(shù)。

1 流式細胞術(shù)和腫瘤的診斷、預后

惡性腫瘤的早期診斷是提高治愈和生存率的關鍵，但癌癥早期多缺乏客觀明確的診斷指標，難以獲得形態(tài)學上的證據(jù)。流式細胞術(shù)可測定細胞內(nèi)DNA含量的能力給腫瘤診斷帶來了極大的幫助。因為人體正常細胞多是以二倍體形式存在，而癌變的細胞其DNA數(shù)量會發(fā)生變化，所以流式細胞術(shù)可為腫瘤生物學行為的判斷提供重要依據(jù)，有助于癌變的早期診斷。流式細胞術(shù)的檢測標本可為實體瘤標本、穿刺標本、胸腹水標本、尿液、胃鏡、支氣管鏡鉗取的活檢標本等，首先將實體瘤組織解聚、分散制備成單細胞懸液，用熒光染料染色后對細胞的DNA含量進行分析，最后將不易區(qū)分的群體細胞分成三個亞群 （G0/GI期、S期、G2期），DNA含量直接代表細胞的倍體狀態(tài)，非倍體細胞與腫瘤惡性程度有關，DNA非整倍體細胞峰的出現(xiàn)即為癌變的重要標志［1］。

越來越多的研究表明流式細胞術(shù)在血液系統(tǒng)惡性病變的預后評估及疾病監(jiān)測，腫瘤病人的免疫狀態(tài)評價等方面有重要作用［2-3］。若僅依靠形態(tài)學診斷淋巴造血系統(tǒng)腫瘤，僅有一小部分明顯的腫瘤如霍奇金淋巴瘤被確診，目前淋巴造血系統(tǒng)腫瘤的分類綜合了形態(tài)學、細胞學、分子生物學等指標［4］，診斷更加準確。流式細胞術(shù)分析可以得出惡性病變細胞的免疫表型、細胞的DNA含量，這可以用來選擇特異的治療，并為疾病的診斷、預后提供重要信息。比如，不同的CD20陽性B細胞惡性病變目前通常使用抗CD20單抗治療，一小部分CD52陽性的T細胞核B細胞惡性病變可使用抗CD52單抗治療。流式細胞術(shù)可用來區(qū)分套細胞淋巴瘤和與之形態(tài)相似的其它CD20陽性B細胞淋巴瘤［5］。因為這些B細胞腫瘤的抗原表達譜各有不同，因此流式細胞術(shù)通過確定腫瘤細胞的抗原表達譜及相對的抗原表達量可促進疾病的診斷。流式細胞術(shù)還具有在混合細胞中檢測少量特定細胞的能力，這可以用于評估腫瘤治療后的殘存惡性細胞，通常來說若治療后仍存在惡性細胞提示較差的預后。流式細胞術(shù)還可快速檢測細胞中DNA的相對含量，這可用于急性淋巴細胞白血病的治療指導。

2 流式細胞術(shù)和免疫性疾病

T、B和NK淋巴細胞的水平是監(jiān)測機體的免疫狀態(tài)的重要指標。通過表面標志物監(jiān)測各免疫細胞及細胞內(nèi)各種細胞因子水平，以及對淋巴細胞各亞群數(shù)量的測定可了解患者的免疫狀態(tài)。流式細胞術(shù)與單克隆抗體結(jié)合，對細胞表面和細胞內(nèi)抗原、癌基因及膜受體的定量檢測取得了很大的進展。其原理主要是：利用抗原抗體特異性反應，先將不同單克隆抗體帶上各種熒光染料作為熒光探針，這種熒光探針與單克隆抗體結(jié)合緊密。當細胞經(jīng)過激光器發(fā)射的激光照射后，細胞膜的抗原抗體復合物上的熒光探針就可以發(fā)射出不同光譜的繼發(fā)熒光，帶熒光探針的單克隆抗體與細胞表面相應抗原的結(jié)合的繼發(fā)熒光量轉(zhuǎn)換成電信號，這就代表了細胞表面的抗原量。這些熒光通過流式細胞儀的識別和分辨，便可實現(xiàn)對細胞表面抗原的定量檢測。

流式細胞術(shù)可用于HIV感染后CD4陽性T細胞的計數(shù)［6］，以及多種原發(fā)性免疫缺陷病，如自發(fā)免疫性淋巴組織增生綜合征、多發(fā)免疫缺陷、抗體缺陷病的分類和預后評估。流式細胞術(shù)對同種異體干細胞移植或同種異體骨髓移植后病人特定免疫細胞的定量對病人移植后的生存分析有重要作用。

3 流式細胞術(shù)和細胞治療、移植

流式細胞術(shù)可分選特定的細胞群，然后用于細胞治療。CD34陽性是人造血干細胞的標志之一，應用流式細胞術(shù)可分離、提純CD34陽性細胞以供細胞移植治療。自體CD34陽性細胞移植治療大大地減少了以往移植過程中可能的腫瘤細胞的混入，降低了疾病再復發(fā)的風險。已有文獻報道采用分選、純化的CD34陽性干細胞治療乳腺癌、非霍奇金淋巴瘤、多發(fā)性骨髓瘤，結(jié)果表明治療后可形成持久的造血重建［7-9］，但是由于研究樣本量較少且缺乏對照，因此其有效性有待進一步驗證。

流式細胞術(shù)的應用還包括在輸血后、移植前、孕期、移植前HLA型別判定時檢測人類白細胞抗原（HLA）的抗體。20世紀80年代有研究［10］報道若流式細胞術(shù)可檢測到移植捐贈者的HLA抗體，發(fā)生早期移植物抗宿主反應可能較大。之后，大量研究證實了這一發(fā)現(xiàn)不僅適用于腎移植，也適用于其他實體器官移植。在血液系統(tǒng)疾病中，明確地檢測到針對HLA抗原的HLA抗體也提示移植失敗。因此，多數(shù)情況下，捐贈者HLA抗體的測出是移植禁忌癥。

基于微粒技術(shù)來檢測HLA抗體的新方法極大地促進了流式細胞術(shù)的臨床應用，這種技術(shù)顯著地降低了以往方法的假陽性。新近，還出現(xiàn)了基于多路技術(shù)平臺的新型流式細胞術(shù)，可同時檢測100種獨特的雙色熒光微粒。在微粒上連接特異性DNA探針后，這種多路流式細胞術(shù)還可用于檢測HLA基因型別，最多可同時檢測100個HLA等位基因。因此，現(xiàn)在只需一臺流式細胞儀就可開展高通量的HLA型別分析。這項技術(shù)在檢測干細胞或器官移植病人的HLA分子間的單氨基酸序列差異上也有較高的敏感性和特異性。

4 結(jié)語

流式細胞術(shù)的發(fā)展和應用對疾病的診斷、分類，腫瘤病人及同種異體干細胞移植、器官移植病人的監(jiān)測、預后評估都有重要作用。流式細胞術(shù)產(chǎn)生的高通量數(shù)據(jù)應該得到很好的利用，這需要生物信息學的大力推動。

［1］ 張韞，楊鑫，李忻.流式細胞術(shù)在臨床檢驗中的應用［J］.中日友好醫(yī)院學報，2012，26（5）：303-306.

［2］ Zhou，Y.M.Othus，etal.Pre-andpost-transplant quantificationofmeasurable（'minimal'）residualdiseasevia multiparameter flow cytometry in adult acute myeloid leukemia［J］.Leukemia，2016，2.2

［3］ Wang，Y.L.Peng，et al.Clinical value to quantitate hematogones in Chinese childhood acute lymphoblastic leukemiabyflowcytometryanalysis［J］.Internationaljournal oflaboratoryhematology，2016.

［4］ Swerdlow（2008）.WHOclassificationoftumoursofhaematopoietic andlymphoidtissues，WorldHealthOrganization.

［5］ Wang，W.L.Gao，et al.The application of CD73 in minimal residual disease monitoring using flow cytometry in B-cell acute lymphoblastic leukemia［J］.Leukemia&lymphoma，2015，1-8.

［6］ Wang，L.H.Degheidy，et al.Quantitative Flow Cytometry MeasurementsinAntibodiesBoundperCellBasedonaCD4 Reference［J］.Currentprotocolsincytometry，2016，75，21-22.

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