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加味香連丸的質(zhì)量控制研究*

2016-03-14 00:58:44張曉雪余河水張麗娟宋新波
關(guān)鍵詞:芍藥黃芩批號

張曉雪,武 婕,余河水,張麗娟,李 薇,宋新波,2

(1.天津中醫(yī)藥大學(xué),天津 300193;2.天津中一制藥有限公司,天津 300193)

加味香連丸的質(zhì)量控制研究*

張曉雪1,武 婕1,余河水1,張麗娟1,李 薇1,宋新波1,2

(1.天津中醫(yī)藥大學(xué),天津 300193;2.天津中一制藥有限公司,天津 300193)

[目的]對加味香連丸質(zhì)量控制進(jìn)行研究。[方法]采用薄層色譜法對加味香連丸中白芍、當(dāng)歸、黃芩進(jìn)行定性鑒別,建立高效液相色譜法同時測定加味香連丸中芍藥苷、柚皮苷、黃芩苷、厚樸酚的含量。[結(jié)果]白芍、當(dāng)歸、黃芩的薄層色譜鑒別斑點清晰,陰性對照無干擾;高效液相色譜方法測定加味香連丸中芍藥苷、柚皮苷、黃芩苷、厚樸酚分別在0.011 68~0.116 8、0.022~0.22、0.255~0.025 5、0.004 1~0.041 g/L范圍內(nèi)線性關(guān)系良好,平均回收率分別為98.75%、99.79%、99.22%、99.36%(n=6);RSD分別為1.63%、1.3%、1.57%、1.6%。[結(jié)論]本法簡便易行、準(zhǔn)確、重現(xiàn)性良好,為加味香連丸的質(zhì)量控制提供了理論依據(jù)。

加味香連丸;薄層色譜;高效液相色譜法;芍藥苷;柚皮苷;黃芩苷;厚樸酚

痢疾是痢疾桿菌引起的腸道傳染病。臨床主要表現(xiàn)為發(fā)熱、腹痛、腹瀉、里急后重、排黏液膿血樣大便。痢疾夏季發(fā)病率高,中醫(yī)學(xué)認(rèn)為多由濕熱之邪所致[1-8]。其中加味香連丸就是常用于治療大腸濕熱所致痢疾的中成藥之一。具有清熱祛濕,化滯止痛的功效,現(xiàn)代應(yīng)用多用于治療泄瀉、慢性結(jié)腸炎[9-10]。收載于2015版《中國藥典》[11]。本品由木香、黃芩、白芍、姜厚樸、檳榔、制吳茱萸、炙甘草、姜黃連、黃柏、當(dāng)歸、麩炒枳殼、醋延胡索等12味藥物組成。其中白芍、當(dāng)歸、枳殼、黃芩、厚樸均為主要藥味,但現(xiàn)行標(biāo)準(zhǔn)僅有木香、厚樸、枳殼和延胡索的薄層色譜定性鑒別項及鹽酸小檗堿的含量測定項[12-13],所以本實驗對加味香連丸中的白芍、黃芩、當(dāng)歸進(jìn)行定性鑒別,并采用高效液相色譜法(HPLC)同時測定加味香連丸中芍藥苷、柚皮苷、黃芩苷、厚樸酚的含量。為進(jìn)一步提高加味香連丸用藥安全和質(zhì)量控制研究提供科學(xué)依據(jù)。

1 儀器和試藥

1.1 儀器 LC-2010AHT型液相色譜儀(日本島津公司),島津LC-2010色譜工作站;AB135-S電子分析天平(上海躍進(jìn)醫(yī)療器械有限公司);HH.S21-6數(shù)顯式電熱恒溫水浴鍋(上海躍進(jìn)醫(yī)療器械有限公司);1AB恒溫干燥箱(天津市天宇實驗儀器有限公司);SHB-Ⅲ循環(huán)水式真空泵(天津科諾儀器設(shè)備有限公司)。薄層層析硅膠GF254板、G板(青島鼎康硅膠有限公司)。

1.2 試藥 加味香連丸(批號3082226、3082225、2083019),購自北京同仁堂制藥有限公司;陰性樣品均為實驗室自制。芍藥苷(批號AB017P)、阿魏酸(批號AB156F)、藁本內(nèi)酯(批號AB177W),均購自天津一方科技有限公司;黃芩苷(批號110715-201312)、黃芩素(批號111595-20130905)、漢黃芩素(批號111514-20130403)、柚皮苷(批號110722-2013012)、厚樸酚(批號110729-201309)、當(dāng)歸對照藥材(批號120927-201516),均購自中國藥品生物制品檢定所。芍藥對照藥材(批號2013-006)、黃芩對照藥材(批號2013-010),均購自天津中醫(yī)藥大學(xué)。

1.3 試劑 甲醇(色譜級、美國Fisher Scientific公司);甲苯、三氯甲烷、二氯甲烷、環(huán)己烷、乙醚、乙酸乙酯、乙醇、磷酸、鹽酸、甲酸(分析級、天津百世化工有限公司);超純水。

2 方法與結(jié)果

2.1 定性鑒別

2.1.1 白芍的薄層鑒別 取3種批號的加味香連丸研勻,取粉末1 g,加無水乙醇20 mL,振蕩10 min,濾過,濾液揮干,殘渣加無水乙醇2 mL溶解,作為供試品溶液。取按加味香連丸處方及制備工藝制備缺白芍的陰性樣品1 g,同法制成陰性對照品溶液。取白芍對照藥材0.5 g,同法制成對照藥材溶液。另取芍藥苷對照品,加乙醇制成每1 mL含1 mg的溶液,作為對照品溶液。吸取上述6種溶液各5 μL,分別點于同一硅膠G板上,以三氯甲烷-乙酸乙酯-甲醇-甲酸(40∶5∶15∶0.2)為展開劑,展開,取出,晾干,噴以5%香草醛硫酸溶液,于105℃烘至斑點顯色清晰。供試品色譜中,在對照品及對照藥材色譜相應(yīng)的位置上顯相同顏色的斑點,在與白芍陰性對照色譜中,無此斑點。色譜圖見圖1。

圖1 白芍薄層色譜

2.1.2 當(dāng)歸的薄層鑒別 取3種批號的加味香連丸研勻,取粉末0.5 g,加甲醇20 mL,超聲30 min,濾過,濾液揮干,殘渣加少量水溶解,用稀鹽酸調(diào)pH2~3左右,用30、20、20 mL乙醚分別萃取3次,合并萃取液,揮干,殘渣用2 mL甲醇溶解,作為供試品溶液。取按加味香連丸處方及制備工藝制備缺當(dāng)歸的陰性樣品1 g,同法制成陰性對照品溶液。取當(dāng)歸對照藥材0.5 g,加乙醚超聲20 min,濾過,濾液揮干,殘渣加1 mL無水乙醇溶解,作為當(dāng)歸對照藥材溶液。另取阿魏酸和藁本內(nèi)酯對照品,加甲醇制成每1 mL含1 mg的溶液,作為對照品溶液。吸取上述7種溶液各10 μL,分別點于同一硅膠G板上,以環(huán)乙烷-二氯甲烷-乙酸乙酯-甲酸(40∶25∶10∶1)為展開劑,展開,取出,晾干,置紫外光燈(254、365 nm)下檢視。供試品色譜中,在與對照品及對照藥材色譜相應(yīng)的位置上顯相同顏色的斑點,在與當(dāng)歸陰性對照色譜中,無此斑點。色譜圖見圖2。

圖2 當(dāng)歸薄層色譜

2.1.3 黃芩的薄層鑒別 取3種批號的加味香連丸研勻,取粉末1 g,加乙酸乙酯-甲醇(3∶1)的混合溶液30 mL,加熱回流30 min,放冷,濾過,蒸干,殘渣加甲醇5 mL使溶解,取上清液為供試品溶液。取按加味香連丸處方及制備工藝制備缺黃芩的陰性樣品1 g,另取黃芩對照藥材1 g,同法制成陰性對照品溶液及黃芩對照藥材溶液。另取黃芩苷、黃芩素、漢黃芩素對照品加甲醇制成每1 mL含1、0.5、0.5 mg的溶液,作為對照品溶液。吸取上述8種溶液各10 μL,分別點于同一硅膠GF254板上,以甲苯-乙酸乙酯-甲醇-甲酸(10∶3∶2∶1)為展開劑,飽和30 min,展開,取出,晾干,置紫外燈(254 nm)下檢視。供試品色譜中,在與對照品及對照藥材色譜相應(yīng)的位置上顯相同顏色的斑點,在與黃芩陰性對照色譜中,無此斑點。色譜圖見圖3。

圖3 黃芩薄層色譜圖

2.2 定量分析

2.2.1 色譜條件 色譜柱:SHIMADZU VP-ODS(250 mm×4.6 mm,5 μm);以甲醇(A):0.1%磷酸水(B)為流動相,梯度洗脫(0~15 min,20%~30%A;15~50 min,30%~75%A;50~65 min,75%~100%A);檢測波長為230 nm;流速:1.0 mL/min;柱溫:30℃;進(jìn)樣量10 μL,理論塔板數(shù)按黃芩苷峰計算應(yīng)不低于6 000。

2.2.2 混合對照品溶液的制備 取芍藥苷、柚皮苷、黃芩苷、厚樸酚對照品適量,精密稱定,加入甲醇制成每1 mL含0.116 8 mg芍藥苷、0.22 mg柚皮苷、0.255 mg黃芩苷、0.041 mg厚樸酚的混合對照品溶液。

2.2.3 供試品溶液的制備 取加味香連丸,研成細(xì)末,精密稱定0.5 g,置25 mL容量瓶中,加入適量甲醇,浸漬2 h,在45℃下,超聲提?。üβ?50 W,頻率40 kHz)30 min,放至室溫,再用甲醇定容至刻度線,過濾,濾液用微孔濾膜(0.45 μm)濾過,取續(xù)濾液作為供試品溶液。按照加味香連丸處方量和制備工藝制備缺白芍、枳殼、黃芩、厚樸的陰性樣品,按照供試品溶液的制備方法制備陰性對照溶液。

2.2.4 專屬性實驗 精密吸取混合對照品溶液、供試品溶液和陰性對照溶液進(jìn)樣,結(jié)果陰性樣品無干擾,證明此色譜條件可行。見圖4。

圖4 加味香連丸供試品、陰性樣品吸混合對照品的色譜圖

2.2.5 方法學(xué)考察

2.2.5.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備 精密吸取1、2、4、6、8、10 mL“2.2.2”項下的混合對照品貯備液,分別置于不同的10 mL容量瓶中,加入甲醇定容,在“2.2.1”項下色譜條件進(jìn)樣分析,以對照品質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)(X),峰面積為縱坐標(biāo)(Y),計算線性回歸方程,得到芍藥苷、柚皮苷、黃芩苷、厚樸酚的回歸方程分別,線性范圍為0.01168~0.116 8 g/L,線性范圍為0.022~0.22 g/L;0.999 8),線性范圍為0.025 5~0.255 g/L;厚樸酚30000000X+677.54(r2=0.9997),線性范圍為0.004 1~0.041 g/L。

2.2.5.2 精密度實驗 精密吸取混合對照品溶液,即“2.2.2”制備的對照品溶液,按“2.2.1”項下方法測定峰面積,連續(xù)進(jìn)樣6次。測得芍藥苷、柚皮苷、黃芩苷、厚樸酚峰面積值得RSD為0.34%、0,86%、0.54%、0.27%,精密度符合要求。

2.2.5.3 穩(wěn)定性實驗 取同一供試品溶液分別在0、2、4、6、8、12、24 h進(jìn)樣1次,依法進(jìn)行含量測定,測定芍藥苷、柚皮苷、黃芩苷、厚樸酚峰面積RSD分別為0.43%、0.72%、1.24%、0.48%,表明供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.2.5.4 重復(fù)性實驗 取同一批號(3082226)樣品6份,按“2.2.3”項下制備方法制備供試品溶液,按“2.2.1”項下方法測定分析,結(jié)果6份樣品中芍藥苷的平均含量1.98 mg/g,RSD=0.85%,柚皮苷的平均含量4.42 mg/g,RSD=1.24%,黃芩苷的平均含量3.02 mg/g,RSD=0.69%,厚樸酚的平均含量0.28 mg/g,RSD=0.74%,結(jié)果表明重復(fù)性符合要求。

2.2.5.5 加樣回收率實驗 取同一批號(3082226)的樣品6份,各0.5 g,精密稱定,置25 mL容量瓶中,分別精密加入芍藥苷0.001 05 g、柚皮苷0.002 45 g、黃芩苷0.001 40 g、厚樸酚0.000 13 g,按“2.2.3”項下的方法制備供試品溶液,依法測定樣品中的芍藥苷、柚皮苷、黃芩苷、厚樸苷的含量,計算回收率。結(jié)果芍藥苷、柚皮苷、黃芩苷、厚樸苷平均回收率為98.75%、99.79%、99.22%、99.36%;RSD分別為1.63%、1.30%、1.57%、1.60%。結(jié)果見表1。

2.2.5.6 樣品測定 取3批樣品(批號3082226、3082225、2083019),按“2.2.3”項下方法制備供試品溶液,分別測定芍藥苷、柚皮苷、黃芩苷、厚樸酚的峰面積,結(jié)果芍藥苷的含量分別為2.0400、2.0394、2.035 3 mg/g,柚皮苷的含量分別為4.909 1、5.010 9、4.904 8 mg/g,黃芩苷的含量分別為3.018 2、3.034 2、3.012 6 mg/g,厚樸酚含量分別為0.279 6、0.283 0、0.276 7 mg/g。

表1 回收率測定結(jié)果

3 結(jié)論與討論

3.1 薄層色譜的選擇 因為加味香連丸處方中白芍、當(dāng)歸、黃芩均為主要藥味,但查閱《中國藥典》及參考文獻(xiàn)均未對處方中白芍、當(dāng)歸、黃芩進(jìn)行薄層色譜鑒別。所以本實驗選擇三者進(jìn)行定性鑒別,對加味香連丸中定性鑒別進(jìn)行補充。在展開劑的選擇上,分別參考了《中國藥典》中單味藥材的薄層鑒別方法,但發(fā)現(xiàn)芍藥苷、阿魏酸、黃芩苷等的比移(Rf)值太小,所以適當(dāng)?shù)恼{(diào)整了展開劑的極性比例,發(fā)現(xiàn)分離成分的Rf值和分離度較好。

3.2 色譜條件的選擇 參考文獻(xiàn)[14-16]芍藥苷、柚皮苷、黃芩苷及厚樸酚最佳吸收波長分別為230、274、284、294 nm,通過比較4個波長下4種成分的含量變化,最終選擇230 nm為最佳檢測波長,此時4種成分含量均較高,且與雜峰分離較好。

在流動相的選擇上,考察了甲醇-0.1%冰醋酸水溶液、甲醇-0.1%磷酸水溶液、乙腈-0.2%磷酸水溶液[17-20],結(jié)果表明甲醇-0.1%磷酸水溶液的峰形較好,又考察了此條件下流動相的洗脫程序,發(fā)現(xiàn)梯度程序比等度程序能更好將四種成分與雜質(zhì)峰分離,峰形較好,且陰性樣品無干擾。

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·啟 事·

《天津中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報》2017年征訂征稿啟事

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The research of quality contral of Jiawei Xianglian pill

ZHANG Xiao-xue1,WU Jie1,YU He-shui1,ZHANG Li-juan1,LI Wei1,SONG Xin-bo1,2
(1.Tianjin university of Traditional Chinese Medicine,Tianjin 300193,China;2.Tianjin Zhongyi pharmaceutical Co.Ltd,Tianjin 300193,China)

[Objective]To research the quality control of Jiawei Xianglian pill.[Methods]Paeoniae Radix Alba,Angelicae Sinesis Radix and Scutellaria Radix of Jiawei Xianglian pill was identified by TLC.HPLC was applied to determine the content of paeoniflorin,naringin,baicalin and magnolol.[Results]TLC identification methods had good specificities without interference from negative control.The calibration curves of paeoniflorin, naringin,baicalin and magnolol were linear in the ranges of 0.011 68~0.116 8,0.022~0.22,0.255~0.025 5 and 0.004 1~0.041 mg/mL.The average recoveries wear 98.75%(RSD=1.63%),99.79%(RSD=1.3%),99.22%(RSD= 1.57%),99.36%(RSD=1.6%).[Conclusion]This method was simple,pricise and repeatablewhich can be used for quality control of Jiawei Xianglian pill.

Jiawei Xianglian pill;TLC;HPLC;Paeoniflorin;Naringin;Baicalin;Magnolo

R284

A

1673-9043(2016)06-0413-05

2016-07-11)

10.11656/j.issn.1673-9043.2016.06.13

天津市科技計劃項目(14TXZYJH00440)。

張曉雪(1988-),女,碩士研究生,主要研究方向為中藥質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究。

宋新波,E-mail:songxinbo@tjutcm.edu.cn。

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