王碧涵，李宗菊，左 奎，袁曉芹，馬紹賓

（云南大學生命科學學院，云南 昆明 650091）

紅菇屬分子生物學的研究進展*

王碧涵，李宗菊，左 奎，袁曉芹，馬紹賓**

（云南大學生命科學學院，云南 昆明 650091）

從種類鑒定、系統(tǒng)發(fā)育關系兩個方面概述了近年來國內(nèi)外對紅菇屬（Russula）的研究進展。其中，重點歸納了4種常見分子生物學技術（ITS、LSU、RPB2及RAPD序列分析）在紅菇屬研究中的應用，并對紅菇屬的分子系統(tǒng)學研究作了展望。

紅菇屬；新種；親緣關系；DNA分子標記

紅菇屬（Russula） 隸屬于擔子菌門（Basidiomycotina）傘菌綱（Agaricomycetes）紅菇目（Russulales）紅菇科（Russulaceae）。該屬子實體各個部位（特別是菌褶）很脆，菌柄短而粗，菌蓋常有鮮艷的顏色，菌褶通常有囊狀體，子實體通常肉質(zhì)，菌肉由較典型菌絲纏繞著成群球狀胞組成，菌絲無鎖狀聯(lián)合，孢子具淀粉質(zhì)紋飾[1]。迄今為止，全世界已有記載的種類大約有750種（包括變種）[2]。紅菇屬在世界范圍內(nèi)分布廣泛，而在中國發(fā)現(xiàn)的新種約占已知紅菇屬種類的8%，表明了中國紅菇屬資源的獨特性[3]。

紅菇常發(fā)生于針葉林、闊葉林和混交林地上，和一些樹種形成外生菌根，與植物群落有著密切的對應關系[4]。許多種類具有很高的食用價值和藥用價值，其味道鮮美，營養(yǎng)豐富，部分紅菇還具有改善糖代謝紊亂、調(diào)節(jié)體內(nèi)脂質(zhì)代謝[5]、抗癌[6]等作用。但紅菇屬亦有很多種類是有毒的，食用后可能引起腸胃炎型中毒癥狀[7]。傳統(tǒng)的形態(tài)學鑒定主要通過觀察新鮮樣本的菌蓋和菌柄的顏色、形狀、大小，以及菌褶的顏色、著生狀態(tài)，孢子印顏色、孢子紋飾、糊狀反應等[8]。但傳統(tǒng)形態(tài)學分類也有許多不足，例如由于地域分隔，紅菇屬種內(nèi)的形態(tài)多樣性偏高，親緣種較難鑒定。因此近年來引入的分子生物學方法，如ITS、LSU、RPB2序列分析和RAPD等方法，可以為紅菇屬的鑒定提供依據(jù)和補充[9]。

1 紅菇屬分子生物學研究中的常用技術

1.1 ITS（internal transcribed space）

內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)，即3個高度保守的編碼核糖體的基因（18S rDNA、5.8S r DNA、28S rDNA）之間的間隔區(qū)（圖1）[10]。由于其進化相對迅速并且具有多態(tài)性，因而適合于等級水平較低的系統(tǒng)學研究[11]，是目前真菌界亦是紅菇屬鑒定新種最常用的分子標記方法之一。然而ITS序列分析也存在很多不足之處，如片段較小，受到基因庫完善程度、高度同源性序列，物種ITS區(qū)可變程度等一些因素的影響，并不能鑒定出所有真菌[12]。必要時需結(jié)合傳統(tǒng)的形態(tài)學和其他分子標記方法，才能使結(jié)果更加準確。

圖1 ITS結(jié)構Fig.1 The structure of ITS（internal transcribed space）

1.2 LSU（large subunit）

核糖體大亞基，即核糖體中較大的亞基，是28S rDNA基因上保守區(qū)和可變區(qū)中片段較長的基因[13]。由于其不同的結(jié)構域在進化上差別較大，而在真菌系統(tǒng)發(fā)育研究中一般選擇某一變異較大的結(jié)構域來研究，因此可用于屬及屬以上的研究[14]，而在對紅菇屬進行種類鑒定時，LSU序列分析方法可與ITS序列分析方法同時使用，使鑒定結(jié)果更加準確。

1.3 RAPD（randomly amplified polymorphic DNA）

隨機擴增多態(tài)性DNA分析（randomly amplified polymorphic DNA），即運用隨機引物擴增尋找多態(tài)性DNA片段，作為分子標記。RAPD是由Williams等[15]于1990年發(fā)展起來的一種技術。其基本原理是，利用人工合成的較短的隨機排列堿基順序的核酸單鏈（通常為10個核苷酸）為引物，在一種熱穩(wěn)定DNA多聚酶的作用下，對所研究的未知序列的基因組DNA進行PCR擴增，產(chǎn)生一組不連續(xù)的分子量為200 bp～2 000 bp的DNA片段。RAPD技術是近些年由PCR技術衍生的一種常用的技術，由于其無須事先了解目的基因序列、無須使用同位素、所需樣品量較少、引物具有普遍適應性、比較適用于自動化操作和分析[16]，而逐漸成為研究真菌親緣關系以及遺傳多樣性的常用方法之一，尤其適用于種下水平的分類學研究，如鑒定子實體和分離菌株的親緣關系，但在紅菇屬中的應用較少。

1.4 RPB2（the second largest RNA polymerase subunit）

RPB2，即編碼RNA聚合酶Ⅱ第二大亞基的基因，與BTF3（general transcription factor） 結(jié)合可以形成復雜的轉(zhuǎn)錄活性[17]，主要負責蛋白質(zhì)編碼基因的轉(zhuǎn)錄。由于其單拷貝和進化速率慢，較其他基因相對保守，因而可與ITS、LSU等分子標記方法結(jié)合，應用于紅菇屬的系統(tǒng)發(fā)育研究中。

2 紅菇屬的分子生物學研究

2.1 種類鑒定

2.1.1 鑒定未知紅菇樣本

ITS經(jīng)常與形態(tài)鑒定結(jié)合被用以鑒定未知樣本，常用于各屬種大型野生真菌的鑒定，在紅菇屬中也被廣泛的應用。田慧敏等[18]用形態(tài)學和ITS序列鑒定了內(nèi)蒙古自治區(qū)賽罕烏拉國家級自然保護區(qū)的4個紅菇樣本，分別為銅綠紅菇（Russula aeruginea）、細弱紅菇（R.gracillima）、斑點紅菇（R.maculata）和觸黃紅菇（R.luteotacta）。菌物學家發(fā)現(xiàn)新種后，也需要用分子標記的方法進行證實。Li等[19]在中國東北部長白山發(fā)現(xiàn)新種吉林紅菇（R.jilinensis），并用ITS序列鑒定（圖2），最大簡約法構建的系統(tǒng)發(fā)育樹可看出R.jilinensis與R.curtipes是近緣種，其形態(tài)學上也較為相似，但可用菌蓋顏色及棲息地區(qū)分。Li等[20]在中國西南發(fā)現(xiàn)2個新種：R.atroaeruginea和R.sichuanensis，對這兩個新種進行了形態(tài)和ITS序列分析的描述，并利用ITS系統(tǒng)發(fā)育樹得以證實。Steven等[21]對發(fā)現(xiàn)于圭亞那的卡帕賴馬高原的3個紅菇新種R.myrmecobroma、R.paxilliformis和R. gelatinivelata進行了形態(tài)學和生態(tài)學描述及分類討論，并用分子數(shù)據(jù)證實了分類群的親緣關系。

2.1.2 鑒定組織分離株的真?zhèn)?/p>

紅菇屬有較多種類屬于高經(jīng)濟價值的蘑菇，比如大紅菇（Russula alutacea）、正紅菇（R.vinosa），在我國東南沿海地區(qū)以及東南亞國家廣受歡迎；青頭菌（R.virescens）在云南等西南省份都有食用的傳統(tǒng)。由于紅菇科真菌全部為外生型共生菌，目前沒有純?nèi)斯ぴ耘嗟膱蟮?，國?nèi)僅見乳菇屬的松乳菇（Lactarius deliciosus）、紅汁乳菇（L.hatsudake） 半人工栽培的例子。因此分離篩選紅菇純培養(yǎng)菌株，保存其種質(zhì)資源，對于紅菇后續(xù)馴化開發(fā)具有重要意義。用ITS序列測定除了可以鑒定紅菇新種外，亦可用于真菌組織分離株與子實體之間的對比。如顏軍等[22]采用組織分離法從市售牛肝菌子實體分離得到兩株性狀穩(wěn)定的分離株，用ITS序列分析將其分別鑒定為牛肝菌科（Boletaceae）成員及廣義美味牛肝菌（Boletus edulis）。用ITS序列分析在紅菇屬中也有相似的案例。王桂文等[23]比對了組織分離株和紅菇子實體的ITS序列，發(fā)現(xiàn)分離株的ITS序列全長小于子實體的ITS序列全長，并且組織分離株與紅菇屬真菌的遺傳距離大，由此推測組織分離株可能不是紅菇的分離株而是子實體的寄生菌或污染菌。

在鑒定組織分離株方面，隨機擴增多態(tài)性DNA（RAPD）亦可提供可靠依據(jù)。孫文波等[24]用RAPD分析了紅菇（Russulasp.） 子實體和分離菌株的DNA多樣性，結(jié)果表明分離菌株和子實體之間的DNA相似性非常高。吳學謙等[25]對采自野外的正紅菇（R.vinosa）子實體及其組織分離菌株進行RAPD和ITS分析，結(jié)果顯示分離到的菌株并非來自其子實體，子實體內(nèi)存在多種伴生菌。上述這些結(jié)果表明RAPD既可以單獨使用，也可與其他分子標記方法，如與ITS結(jié)合，可高效準確地鑒定紅菇屬組織分離菌株的真?zhèn)危故秤眉兣囵B(yǎng)紅菇的安全性得到保障。

2.1.3 鑒定商品紅菇

通過ITS序列比對，可以清晰分辨形態(tài)相似的毒菌和食用菌。紅菇屬中的亞稀褶黑菇和稀褶黑菇就是一個重要的例子（表1）。二者在形態(tài)上較為相似，肉眼難以分辨，因此導致的中毒事件在民間時有發(fā)生。有報道稱，鑒定兩者可以使用ITS序列分析方法，在ITS區(qū)域中，不同采集地的亞稀褶黑菇（Russula subnigricans） 與稀褶黑菇 （R.nigricans）的5.8S rDNA為同源性100%，而兩側(cè)ITS之間卻表現(xiàn)出的種內(nèi)和種間的多態(tài)性。其中種內(nèi)差異均不超過5%，而種間差異高達10%左右。因此可以依據(jù)此數(shù)據(jù)來分辨劇毒的亞稀褶黑菇與可食用的稀褶黑菇[26]。陳新華[27]結(jié)合ITS及LSU序列分析，首次對廣東梅州商品紅菇進行形態(tài)學和分子學鑒定，由此進一步分析了該商品紅菇營養(yǎng)成分及功能成分。

表1 亞稀褶黑菇和稀褶黑菇ITS分布長度比較Tab.1 Comparison of the ITS and rDNAs length variation between Russula subnigricans(RS)and R.nigricans(RN)

2.1.4 確定分類地位

在基因庫完善程度較好的情況下，利用得到的ITS序列可以驗證或重新確定物種的分類地位。Somanjana等[28]首次對點柄黃紅菇（Russula senecis）完整的ITS序列進行測序，并通過系統(tǒng)發(fā)育分析證實了其分類地位在Ingratula亞屬的Ingratae列下的Foetentinae亞組內(nèi)。不僅如此，不同種類的紅菇，由于生存環(huán)境相似，在長期的進化中可能出現(xiàn)一些相同或相似的形態(tài)特征，這就可能導致不同種類的紅菇被劃分成同一種類；然而有些屬于同一種類的，由于環(huán)境不同，在長期進化過程中，其形態(tài)特征也可能發(fā)生變化；加之有些用于分類的形態(tài)特征可能是多系起源，具有同一形態(tài)特征的種類在系統(tǒng)發(fā)育樹上卻相距較遠[29]。這3種情況都比較容易導致分類錯誤的產(chǎn)生。Razaq等[30]利用ITS序列分析鑒定了Russula foetentoides，將來自巴基斯坦的樣本與來自喜馬拉雅森林的樣本鑒定為不同的種。Looney等[31]在分類學的框架下分析了25個由W.A.Murrill描述的北美紅菇種的歷史樣本，結(jié)果顯示，R.albimarginata和R.emeticiformis是一種美國東部常見的物種R.vinacea的同種異名；4個未知分類群（R. albimarginata、R.pinophila、R.subcremeiceps和R. subrubescens）已分化到亞組水平；對R.westii提出了另一種分類方式，對比了源自加拿大的樣本和R. levyana，二者ITS1序列相似性高達99%，但形態(tài)差異卻很大，說明單獨使用ITS1序列可能不足以劃分紅菇屬內(nèi)物種。

2.2 系統(tǒng)發(fā)育分析

2.2.1 親緣關系

ITS分子標記是構建系統(tǒng)發(fā)育樹，研究種間親緣關系遠近的常用方法之一。曹政等[32]根據(jù)ITS序列分析結(jié)果得出，采自中國吉林省的標本與Russula firmula聚在同一分支上，而與其它近緣種存在明顯的差異。在乳菇屬中，也有利用ITS序列鑒定親緣關系的例子。陳玉華等[33]基于ITS序列計算出江西的松乳菇 (Lactarius deliciosus)與意大利、西班牙、法國與西班牙的序列間遺傳距離最大為0.012，而云南與法國的序列間遺傳距離為0，是同源序列；系統(tǒng)發(fā)育樹顯示松乳菇和紅汁乳菇 (Lactarius hatsudake)、橙色乳菇 (L.akahatsu)親緣關系較近。不僅如此，在樣本采自同一地區(qū)，同屬于紅菇科，但不同屬的情況下，通過ITS序列分析，也能分析比較出少量樣本的親緣關系。付立忠等[34]對采自浙江麗水山區(qū)的4個紅菇科樣本進行ITS區(qū)段克隆測序和序列特征比較分析，并在核酸序列數(shù)據(jù)庫GenBank中對其ITS序列進行了同源性檢索比對，系統(tǒng)發(fā)育分析表明，紅菇屬的赭蓋紅菇 （R.mustelina）、綠菇 （R. virescens）和青灰紅菇（R.parazurea）三者間序列差異較小，更具有親緣關系。如果將樣本的來源范圍擴大，鑒定親緣關系則同時需要ITS標記和LSU標記，才能獲得較準確的結(jié)果。Myung等[35]利用ITS和LSU標記鑒定了紅菇亞屬Compacta的稀褶黑菇（R. nigricans） 和亞稀褶黑菇（R.subnigricans） 的系統(tǒng)發(fā)育關系，發(fā)現(xiàn)與日本的亞稀褶黑菇相比，韓國的亞稀褶黑菇與北美的R.eccentrica更具有親緣關系，說明韓國的亞稀褶黑菇被誤分類，應修正為R.eccentrica。但也有研究表明，在對特定的亞屬內(nèi)種進行親緣關系分析時，LSU序列標記并不是最佳方法，而是可將RPB2與ITS結(jié)合，才能獲得較為準確結(jié)果。Myung等[36]分別利用ITS、LSU、RPB2序列鑒定了韓國的Amoneula亞屬的絨紫紅菇（R.mariae）和微紫柄紅菇（R.violeipes）兩個種。這兩個種用形態(tài)學方法和LSU序列分析法均難以區(qū)分，但用ITS和RPB2鑒定發(fā)現(xiàn)其互為單源。因此，作者認為在鑒定Amoneula亞屬時，ITS和RPB2是最好的方法。國內(nèi)也有利用ITS構建系統(tǒng)發(fā)育樹分析親緣關系，利用RPB2驗證其結(jié)果正確性的研究報道。肖冬來等[37]構建的ITS序列系統(tǒng)發(fā)育樹表明福建正紅菇（R.vinosa）與云南大紅菌（R.griseocarnosa）間序列差異較小，親緣關系較近，與歐洲紅菇（R.vinosa）、玫瑰紅菇（R.rosea） 間序列差異較大，親緣關系較遠，在系統(tǒng)發(fā)育樹上位于不同的分枝上，這與基于RPB2構建的系統(tǒng)發(fā)育樹得到的結(jié)果一致。

2.2.2 進化關系

研究紅菇屬的進化關系時，可將采集的不同樣品的ITS區(qū)段分別進行克隆測序，并將ITS序列在數(shù)據(jù)庫中進行同源性比對，構建系統(tǒng)發(fā)育樹。但也有研究表明，一定的地理因素并不會導致ITS序列發(fā)生改變。王桂文等[38]對采集自廣西浦北縣、容縣和上思縣的紅菇子實體樣本的ITS序列進行比對，并在GenBank/EMBL/DDBJ三大數(shù)據(jù)庫進行同源性檢索，得出結(jié)論：這三個縣的食用紅菇樣本沒有地理類群差異。這可能是由于相對于不同類型的北極森林和植物多樣性較大的熱帶雨林，廣西的3個不同縣之間的環(huán)境差異較小，因此還沒有形成地理類群差異。如果將范圍擴大到中國云南與北美及歐洲，那么地理種群差異將明顯增大。Cao等[39]用ITS序列分析了云南的紅菇樣本，結(jié)果表明云南的變綠紅菇（R. virescens）與北美及歐洲的紅菇樣本有3%～6%的序列差異，并形成明顯的進化枝。

除此之外，ITS序列分析還可用于紅菇的特殊性狀的進化地位分析，但這一方面的研究尚處于起步階段。Peter等[40]利用ITS-rDNA綜合分析檢測發(fā)現(xiàn)親硝基在臭紅菇亞屬中是一個普遍的特性，并處于較早的進化地位。

2.3 遺傳多樣性

ITS序列在研究紅菇的近緣屬乳菇屬的遺傳多樣性時亦有使用。李河等[41]利用ITS序列分析來自湖南省道縣、張家界市、芷江縣、麻陽縣和貴州省玉屏縣以及泰國6個橙黃乳菇（Lactarius akahatsu）種群38個菌株的遺傳結(jié)構和遺傳多樣性，結(jié)果表明橙黃乳菇種群具有豐富的遺傳多樣性。薛振文等[42]對4株紅汁乳菇（L.hatsudake）菌株用HKY85距離測量法分析其遺傳距離，結(jié)果表明，相比采自麗水市縉云與麗水城郊百果園的菌株遺傳距離為0，湖南的標本與上述標本存在一定的遺傳距離，推測地理隔離可能會對紅汁乳菇遺傳產(chǎn)生一定的影響。郭亮等[43]比較了中國湖南省、貴州省、云南省的松乳菇（L.deliciosus）的rDNA ITS區(qū)堿基序列的差異，群體遺傳分析結(jié)果表明松乳菇自然種群間有一定程度的基因漂流發(fā)生，還存在顯著的遺傳分化，但遺傳分化程度與地理距離沒有顯著的線性關系。

3 問題與展望

紅菇具有顯著的藥用價值和食用價值。目前，對紅菇屬的形態(tài)學研究、營養(yǎng)學研究、藥理學研究已經(jīng)逐漸成熟。而另一方面，對紅菇屬的鑒定、分類和遺傳學方面的研究卻仍然處于初始階段，具有很大的發(fā)展空間。傳統(tǒng)的形態(tài)學鑒定需要采集新鮮的樣本，而且容易受到環(huán)境及其觀察者的主觀性因素影響，加之紅菇屬有些菌株不易從形態(tài)特征上識別。DNA作為遺傳物質(zhì)，理論上比形態(tài)特征能更加清晰準確的反應菌株的遺傳信息及進化地位。因此在形態(tài)學鑒定的基礎上，可以結(jié)合ITS和LSU對紅菇屬的新種進行鑒定，用ITS、LSU、RAPD和RPB2對其進行親緣關系及進化關系的分析，用ITS、RPB2進行遺傳多樣性分析，使結(jié)果更加準確。

除了上述4種分子標記方法外，還有一些鑒定其它大型真菌常用的分子標記方法，例如張微思等[44]利用ISSR引物，對來自云南香格里拉、大理、楚雄和昆明的4個松口蘑（Tricholoma matsutake）居群的遺傳多樣性進行了研究，亦有一些在其它大型真菌中被統(tǒng)計過的序列位點。再如王瑩等利用生物信息學方法對美味牛肝菌（Boletus edulis）全基因組中的SSR位點進行了統(tǒng)計分析，并與其它3種擔子菌基因組灰蓋鬼傘（Coprinus cinereus）、裂褶菌（Schizphylhls commne）、糙皮側(cè)耳（Pleurotus ostreatus）進行了比較[45]。這些分子標記方法常見于研究得比較成熟的大型真菌中，而在紅菇屬的分子生物學研究中卻比較少，有待應用。

近年來，隨著分子標記方法的不斷成熟和改進，基因庫的不斷完善，一些類似紅菇屬的形態(tài)多樣的大型真菌的鑒定方法，從傳統(tǒng)的形態(tài)學分類鑒定，將逐漸轉(zhuǎn)向基于DNA分子標記方法的分類鑒定，但亦有少數(shù)學者對此提出質(zhì)疑和反對。主要原因有以下兩個方面：一是形態(tài)學上的特征可以肉眼分辨或是通過顯微鏡觀察得到，而分子數(shù)據(jù)則較為抽象，不同分子標記方法得出的結(jié)論有時不盡相同；二是形態(tài)學分類發(fā)展的歷史較長，而分子生物學技術是近百年來的一種新興技術，有些方面還不成熟。但無論如何，DNA輔之以形態(tài)學特征，這是分類學和系統(tǒng)學發(fā)展的方向。

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Research Advances on the Genus Russula using Molecular techniques

WANG Bi-han,LI Zong-ju,ZUO Kui,YUAN Xiao-qin,MA Shao-bin
(College of Life Science,Yunnan University,Kunming 650091,China)

The research progress on the genus Russula at home and abroad were summarized in recent years from two aspects: species confirmation and phylogenetic relationships.Among them,four common molecular biology techniques,such as ITS,LSU, RPB2 and RAPD sequence analysis,used in the study of Russula were emphatically discussed,and the study prospects of molecular phylogenetic on Russula were also given.

Russula;new species;genetic relationship;DNA molecular markers

S646.9

A

1003-8310（2016）02-0001-06

10.13629/j.cnki.53－1054.2016.02.001

*項目來源：國家“十二五”科技支撐計劃課題（2013BAD16B01）。

王碧涵（1991－），女，在讀碩士研究生，主要從事中國云南產(chǎn)紅菇屬的分子系統(tǒng)學研究。E－mail:bihanwang@foxmail.com

**通信作者：馬紹賓（1965－），男，博士，教授，主要從事大型真菌的分類及系統(tǒng)發(fā)育研究。E－mail:msbkm@126.com

2016－01－06