潘嚴(yán)

[摘要] 目的 探討B(tài)eagle犬骨髓像各個細(xì)胞系正常值的參數(shù)范圍及其細(xì)胞形態(tài)學(xué)特征，并和正常成人的骨髓像進(jìn)行了比較，為了給新藥臨床前研究中受試物作用的靶器官是造血系統(tǒng)的臨床前藥物安全評價研究實驗提供診斷依據(jù)。 方法 對30只實驗對照用Beagle犬（雌雄各半）和正常成人的骨髓涂片用瑞-姬氏混合染色液染色后進(jìn)行形態(tài)學(xué)觀察，油鏡下，分類計數(shù)粒細(xì)胞系統(tǒng)，紅細(xì)胞系統(tǒng)，淋巴細(xì)胞系統(tǒng)，單核細(xì)胞系統(tǒng)，漿細(xì)胞系統(tǒng)及其他細(xì)胞，總計500個有核細(xì)胞，以百分率表示。高倍鏡下計數(shù)全片巨核細(xì)胞數(shù)并計算其粒紅比值。用SPSS19.0進(jìn)行配對比較，計算t值和P值。 結(jié)果 Beagle犬正常骨髓像中骨髓細(xì)胞名稱，骨髓增生變化的分級，骨髓細(xì)胞各系統(tǒng)、各階段的細(xì)胞形態(tài)學(xué)的劃分基本是參見人的骨髓細(xì)胞學(xué)分類標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行，Beagle犬和正常成人在粒細(xì)胞系統(tǒng)，紅細(xì)胞系統(tǒng)，巨核細(xì)胞系統(tǒng)等六大系統(tǒng)細(xì)胞存在顯著性差異（P<0.01或<0.05）。正常情況下，Beagle犬同系同階段的骨髓細(xì)胞胞體均比人的略小，犬粒細(xì)胞系統(tǒng)可見環(huán)核，核染色質(zhì)比人粗糙，胞質(zhì)量沒有人的粒細(xì)胞胞質(zhì)豐富；Beagle犬成熟淋巴細(xì)胞一般<10%，正常成人成熟淋巴細(xì)胞20%～30%；Beagle犬骨髓像中顆粒型巨核細(xì)胞明顯比人多，并常見破骨細(xì)胞。Beagle犬的粒紅比可簡記為2～2.2倍。人的粒紅比值2～4倍。 結(jié)論 Beagle犬和正常成人在骨髓有核細(xì)胞增生程度，有核細(xì)胞（粒系，紅系，巨核系），淋巴細(xì)胞，非造血細(xì)胞的數(shù)量和形態(tài)學(xué)特征等方面存在顯著差異。通過犬和正常成人骨髓像的比較，給深入研究藥物對造血系統(tǒng)的改變提供了參考數(shù)值。

[關(guān)鍵詞] Beagle犬；正常成人；粒紅比值；骨髓像

[中圖分類號] R329 [文獻(xiàn)標(biāo)識碼] A [文章編號] 2095-0616（2016）01-21-05

[Abstract] Objective To investigate the parameter range of the normal value and morphological features of bone marrow cells between Beagle dog and normal adult， and provide a diagnostic basis for the research that the target organs of test samples function in the preclinical study of new medicines is the safety evaluation research experiment of the pre-clinical medicines of hematopoietic system. Methods 30 experimental control Beagle dogs （half male and half female） and normal adults' bone marrow smear were Rui-Ji mixed staining fluid， and morphologically observed. Under the oil microscopy， there were a total 500 nucleated cells， such as differential counting granulocyte system， erythrocyte system， lymphocyte system， monocyte system， plasmocyte system and other cells， which was expressed with a percentage. Under a high power microscopy， the number of megakaryocytes and calculate their myeloid erythroid ratio were counted. Made a pair comparison with SPSS19.0 and compute t value and P value. Results Name of bone marrow cells in normal marrow picture of Beagle dogs， the classification of the change of bone marrow hyperplasia， and the classification of cell morphology of each system and phase of bone marrow cells basically referenced the classification standards of the human's bone marrow cells. P value of granulocyte system， erythrocyte system， megakaryocyte system and so on six big systems cells of Beagle dogs and normal adults was less than 0.01 or less than 0.0005， so there were significant differences. Under normal circumstances， the cell body of the bone marrow cells of homologous Beagle dog in the same phase was slightly smaller than people's， dogs' granulocyte system had a visible core-annulus， and their nuclear chromatin was rougher than people's， and their quality of cells was less rich than peoples' granulocytes； The mature lymphocytes of Beagle dog was usually less than 10%， and the mature lymphocytes of normal adults was between 20% and 30%； The number of granular megakaryocytes in born marrow picture of Beagle dogs was obviously larger than that of people， and there were usually osteoclasts. The myeloid erythroid ratio of Beagle dog could be counted as 2 to 2.2 times and people's myeloid erythroid ratio was 2 to 4 times. Conclusion There are differences in terms of the hyperplasia degree of bone marrow nucleated cells， the number and morphological features of nucleated cells （granulocytes， erythrocytes， megakaryocytes）， lymphocytes， non-hematopoietic cells of Beagle dogs and normal adults. Through the comparison of bone marrow picture of dogs and normal adults， it provides referential data for an in-depth research that the medicines change the hematopoietic system.

[Key words] Beagle dog； Normal adult； Myeloid erythroid ratio； Born marrow group

從1993年以來的新藥非臨床研究技術(shù)指導(dǎo)原則，對新藥（諸如一些化學(xué)合成藥、生物制劑、中藥）的長期毒性試驗研究中，均要求進(jìn)行骨髓細(xì)胞學(xué)檢查[1]。2005年二月版中藥天然藥物長期毒性研究技術(shù)指導(dǎo)原則中又明確指出當(dāng)受試物可能對造血系統(tǒng)有影響時，應(yīng)進(jìn)一步進(jìn)行骨髓檢查[2]。在藥物重復(fù)給藥毒性試驗技術(shù)指導(dǎo)原則中也反復(fù)強調(diào)了重復(fù)給藥毒性試驗通常需要制備骨髓涂片，以便當(dāng)受試物可能對動物造血系統(tǒng)有影響時進(jìn)行骨髓檢查。技術(shù)指導(dǎo)原則重申進(jìn)行骨髓檢查，體現(xiàn)了骨髓檢查在藥物重復(fù)給藥試驗中的重要性?？鼓[瘤藥物臨床前毒性研究中也涉及到根據(jù)細(xì)胞毒類藥物毒性或潛在毒性的情況，按一定比例增加劑量，建立這種比例可接受的終點，包括骨髓抑制等嚴(yán)重毒性的直接測定。由于造血系統(tǒng)常常會受到藥物的影響，所以骨髓涂片評價也是在藥物安全性評價中評估藥物對造血系統(tǒng)影響的一個重要的組成部分[3]。劉芳，范玉明等提出了骨髓造血及血液毒理學(xué)這一新興的學(xué)科概念[4]。李建祥等著重論述了血液毒理學(xué)的研究方法包括骨髓的毒性研究[5]。因此研究骨髓像顯得尤為重要。目前關(guān)于Beagle犬正常骨髓像的形態(tài)學(xué)特點和描述及參考數(shù)據(jù)較少，建立起相關(guān)的參考數(shù)據(jù)，給深入研究骨髓毒性，以及犬等動物的異常細(xì)胞學(xué)形態(tài)提供客觀的數(shù)據(jù)支持。

1 材料與方法

1.1 一般材料

本研究收集了北京瑪斯生物技術(shù)有有限公司提供的30只Beagle犬（5～6個月齡，雌雄各半）。采用1.5%戊巴比妥靜脈注射進(jìn)行麻醉，每公斤注射2mL或3mL麻醉放血后，采集第6或第7肋骨，用涂片法制作骨髓涂片。正常成人采用髂骨前上棘穿刺，涂骨髓片與涂血片方法基本一致[6]。

1.2 方法

等骨髓涂片自然晾干或于37℃溫相中促干后，使用珠海貝索生物技術(shù)公司出品的瑞氏-姬姆薩混合染色液對骨髓涂片進(jìn)行染色，一般環(huán)境溫度在15～28℃，染色時間為30～40min。當(dāng)溫度低或高時，可適當(dāng)分別延長和縮短染色時間。油浸鏡下分類計數(shù)500個有核細(xì)胞，以百分率表示。高倍鏡下計數(shù)全片巨核細(xì)胞數(shù)，血小板計數(shù)25個（成熟有血小板形成和成熟無血小板形成）[7]。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法

通過Excel2010版把骨髓細(xì)胞各個系統(tǒng)的分類計數(shù)值匯總成平均值及標(biāo)準(zhǔn)差，再根據(jù)每類骨髓細(xì)胞的平均值及標(biāo)準(zhǔn)差用SPSS19.0統(tǒng)計軟件進(jìn)行兩組獨立樣本的t檢驗，計算t值和P值[8]（詳見表1～2），以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 Beagle犬和人骨髓有核細(xì)胞分類計數(shù)值

根據(jù)人骨髓有核細(xì)胞增生程度的標(biāo)準(zhǔn)劃分，犬的骨髓像增生程度是增生明顯活躍。參見有核細(xì)胞分類計數(shù)方法計數(shù)500只有核細(xì)胞后進(jìn)行分類匯總，兩者再加以比較。

從表1，2，可以很清楚地看出Beagle犬和正常成人在粒細(xì)胞系統(tǒng)，紅細(xì)胞系統(tǒng)，淋巴細(xì)胞系統(tǒng)，單核細(xì)胞系統(tǒng)，漿細(xì)胞系統(tǒng)和巨核細(xì)胞系統(tǒng)六大系統(tǒng)的細(xì)胞，兩者之間存在顯著性差異（P<0.01，P<0.05）。

2.2 犬骨髓細(xì)胞形態(tài)學(xué)特征

2.2.1 粒細(xì)胞系統(tǒng) 以成熟階段細(xì)胞為主，原幼粒細(xì)胞胞體比成熟階段細(xì)胞稍大，胞核多呈圓形或橢圓形，核染色質(zhì)較細(xì)致呈沙粒狀，分布較均勻，有3～5個淡藍(lán)色核仁，胞漿量少。中性桿狀核粒細(xì)胞更多見，相對中性分葉核粒細(xì)胞就少一些。嗜酸性粒細(xì)胞有時較多見。并且犬的核染色質(zhì)比人的略粗糙，排列不整齊，著色也不夠均勻。尚有部分細(xì)胞的核染色質(zhì)出現(xiàn)聚集，胞質(zhì)量也不如人的豐富[10]。

2.2.2 紅細(xì)胞系統(tǒng) 以中晚幼紅細(xì)胞為主。原、早幼紅細(xì)胞的胞核圓形或橢圓形，位于中央或稍偏位，核染色質(zhì)呈粒狀，有聚集趨勢。原始紅細(xì)胞的胞質(zhì)比原粒細(xì)胞的胞質(zhì)著色更深。犬的中晚幼紅細(xì)胞胞體較小，胞質(zhì)少，邊緣不整齊。

2.2.3 巨核細(xì)胞系統(tǒng) 幼巨核細(xì)胞的核染色質(zhì)呈顆粒狀，胞質(zhì)量多，有細(xì)小的嗜天青顆粒。顆粒巨核不規(guī)則核染色質(zhì)粗糙，胞質(zhì)豐富，含有大量的紫紅色顆粒[11]。Beagle犬的巨核細(xì)胞要注意與破骨細(xì)胞加以鑒別，兩者最主要的不同點是胞核。而犬成熟型的巨核細(xì)胞胞體比破骨細(xì)胞略小，胞核巨大不規(guī)則或分葉，看不見核仁。細(xì)胞周圍可附有血小板，有時可見血小板正在脫出。

2.2.4 淋巴細(xì)胞系統(tǒng) 犬的成熟淋巴細(xì)胞占有核細(xì)胞的比例約<10%左右。細(xì)胞特點核偏位，在核一側(cè)有少量胞漿，且著色呈半透明狀。

2.2.5 其他細(xì)胞 犬的正常骨髓像中成骨細(xì)胞比較常見。Beagle犬成骨細(xì)胞胞體較大，多為長橢圓形或不規(guī)則形，常多個成簇分布，有時單個存在。胞核橢圓形或圓形，常偏于一側(cè)，核染色質(zhì)呈粗網(wǎng)狀排列，胞質(zhì)豐富，淡藍(lán)色，常有空泡，離核較遠(yuǎn)處常有橢圓形淡染區(qū)偶見少量紫紅色顆粒，胞質(zhì)邊緣模糊呈云霧狀。成骨細(xì)胞又稱為造骨細(xì)胞，與漿細(xì)胞有許多相似之處，而且有時單個存在，兩者應(yīng)注意鑒別。

2.3 正常成人骨髓像

正常情況下，人同系同階段的骨髓細(xì)胞均比Beagle犬的略大。粒系數(shù)目約40%～60%成熟粒細(xì)胞中桿狀核多于分葉核分化、形態(tài)正常。紅系數(shù)目約20%，以中晚幼紅細(xì)胞為主平均各約10%。巨核系整張骨髓片可見巨核細(xì)胞7～35個，難見原始巨核細(xì)胞。產(chǎn)板型巨核細(xì)胞占50%～60%，髓片約每25個成熟紅細(xì)胞應(yīng)有一個血小板，不能出現(xiàn)異形和巨大血小板。淋巴細(xì)胞約20%，難見到原始淋巴和幼稚淋巴細(xì)胞。單核細(xì)胞主要是成熟階段數(shù)目小于4%，漿細(xì)胞主要是成熟階段數(shù)目小于2%。骨髓片中可以見到少量非造血細(xì)胞，如網(wǎng)狀細(xì)胞，吞噬細(xì)胞，組織嗜酸細(xì)胞等。無異常細(xì)胞和寄生蟲，不易見核分裂象。骨髓有核細(xì)胞增生活躍。粒紅比正常2～4∶1，粒紅比人可簡記為2～4倍[12]。

2.4 Beagle犬與正常成人骨髓像的差異

Beagle犬有核細(xì)胞增生程度是依據(jù)人骨髓有核細(xì)胞增生程度的標(biāo)準(zhǔn)來定可判斷為增生明顯活躍，雄性犬粒紅比值為（1.48±0.32），雌性犬粒紅比值為（1.23±0.24）。此結(jié)果與吉蘭姣，塔娜等[13]測的Beagle犬正常骨髓粒紅比值的結(jié)果比較一致（1.25±0.41）。為了便于記憶，犬的粒紅比值可簡化為2～2.2倍。正常成人粒紅比值可以簡記為2～4倍。犬的中晚幼粒細(xì)胞胞核可呈環(huán)形核[10]，正常成人沒有。犬的中晚幼紅細(xì)胞胞漿不如人的豐富，核染色質(zhì)較人粗糙。淋巴細(xì)胞數(shù)量比人少，有時能見到異形淋巴細(xì)胞2型容易和單核細(xì)胞混淆注意鑒別。Beagle犬正常骨髓像中破骨細(xì)胞和成骨細(xì)胞比較多見，正常成人偶見。以上Beagle犬形態(tài)學(xué)特征和喬建維，李志榮等狗、大白鼠正常骨髓像觀察[14]一文中所述的犬的細(xì)胞形態(tài)觀察結(jié)果較一致。

3 討論

根據(jù)本次研究得出的數(shù)據(jù)表明Beagle犬與正常成人在骨髓細(xì)胞六大主要系統(tǒng)中細(xì)胞形態(tài)學(xué)特征存在不同點，細(xì)胞計數(shù)值也存在著顯著性差異。依據(jù)人的骨髓有核細(xì)胞增生程度五級估計，犬的有核細(xì)胞與成熟紅細(xì)胞的比例是高于正常成人的，這可能與骨穿的部位和方法有密切的關(guān)系。目前長期毒性試驗非嚙齒類實驗動物一般選擇犬的股骨作為穿刺部位，穿刺時應(yīng)當(dāng)注意骨髓穿刺針垂直刺入皮膚肌肉，抵達(dá)股骨轉(zhuǎn)子窩的位置后再左右旋轉(zhuǎn)進(jìn)入骨髓腔，當(dāng)?shù)竭_(dá)骨髓腔時有落空或疏松感視為已進(jìn)入骨髓腔，注射器針筒部分可見骨髓液時才能算抽吸完畢[2]。正常成人骨髓穿刺術(shù)的方法主要有胸骨穿刺術(shù)，髂骨前（后）上棘穿刺術(shù)脊突穿刺術(shù)和脛骨前穿刺術(shù)五種[15]。臨床上穿刺術(shù)的選擇依據(jù)患者病史、癥狀、體征而定，必要時行多部位穿刺以便能全面了解骨髓情況。每張骨髓涂片最好都含有骨髓小粒，這是骨髓液的特征，以便與血液相鑒別。Beagle犬骨髓涂片時需用種屬動物血清稀釋，注意涂片的厚薄程度，以便全片計數(shù)巨核細(xì)胞并注意與破骨細(xì)胞加以鑒別，兩者最主要的不同點是胞核。破骨細(xì)胞胞體巨大，直徑60～100μm，形態(tài)不規(guī)則，邊緣清楚或不整齊如撕紙狀。胞核小且較多，3至幾十個，圓形橢圓形，大小較一致，彼此孤立，隨意排列，無核絲相連。核染色質(zhì)較粗糙。胞質(zhì)極豐富，呈紅藍(lán)相間色，胞質(zhì)中有較多較細(xì)小，大小不均排列稀疏的紫紅色顆粒。正常成人骨髓涂片直接推片，不需用血清稀釋。

在新藥安全評價試驗中，Beagle犬的骨髓像很容易受到抗腫瘤藥或者免疫抑制劑如環(huán)磷酰胺、米托恩醌的影響發(fā)生改變，可見骨髓三系收到明顯抑制，淋巴細(xì)胞大量增多，形成骨髓空洞，停藥半個月至1個月后恢復(fù)正常骨髓像。這可能和藥物劑量以及動物本身的個體差異有關(guān)聯(lián)。由本次研究得出Beagle犬骨髓有核細(xì)胞分類值和粒紅比值在性別上有不同。正常成人骨髓有核細(xì)胞計數(shù)值和粒紅比值不分性別，但是兒童骨髓特征有核細(xì)胞較成人豐富，幼兒骨髓淋巴細(xì)胞值較成人偏高。幼年動物（4～6個月齡的Beagle犬）的骨髓像粒系和紅系與兒童骨髓像相似，紅系偏高。體質(zhì)較差的Beagle犬呈貧血性骨髓像，鏡下可見嗜酸，嗜堿粒細(xì)胞增多，也可見血液寄生蟲[9]。

本次研究顯示Beagle犬正常骨髓像各細(xì)胞系，各階段細(xì)胞的比值在正常范圍，互相間的比例也正常。Beagle犬和正常成人在骨髓有核細(xì)胞增生程度，有核細(xì)胞三系（粒系，紅系，巨核系），淋巴細(xì)胞，非造血細(xì)胞的數(shù)量和形態(tài)學(xué)特征等方面存在明顯的差異。

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（收稿日期：2015-10-09）