馬志科，馬 麗

(西北農(nóng)林科技大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院，陜西楊凌，712100)

動(dòng)物器官中肝素鈉提取方法研究進(jìn)展

馬志科，馬 麗

(西北農(nóng)林科技大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院，陜西楊凌，712100)

肝素(heparin)是一族天然酸性黏多糖化合物，具有抗凝血、抗血栓、降血脂等多種生理活性，是防止動(dòng)脈粥樣硬化、心腦血管疾病的有效藥物。論文介紹了肝素鈉的理化性質(zhì)，從動(dòng)物器官提取肝素鈉的鹽解法、酶解法、酶解結(jié)合法等方法的研究進(jìn)展，并對(duì)肝素鈉的臨床應(yīng)用做了綜述。

動(dòng)物器官，肝素鈉，提取方法，臨床應(yīng)用

肝素(heparin)是一族天然酸性黏多糖化合物，系麥克倫(Mclean)在1916年研究凝血問題時(shí)，從狗的肝臟中發(fā)現(xiàn)的。此后引起了人們的興趣和關(guān)注，十幾年后，又從牛肺中提取了肝素。肝素具有抗凝血活性，并作為臨床應(yīng)用的抗凝血?jiǎng)1]。從此以后，肝素鈉作為抗凝血藥物受到國內(nèi)外廣泛重視[2-3]。肝素是哺乳動(dòng)物體內(nèi)結(jié)締組織的肥大細(xì)胞產(chǎn)生的，它廣泛存在于各種器官組織中，如肝臟、肺臟、心臟、腎臟、胎盤、腸黏液和血液中。提取的主要原料為豬腸黏液和牛肺臟。常用的提取方法有鹽解法、酶解法、酶解結(jié)合法等，本文對(duì)肝素鈉的理化性質(zhì)、提取方法進(jìn)展及臨床應(yīng)用做一綜述。

1 肝素鈉的理化性質(zhì)

肝素是一種酸性黏多糖，屬于葡萄糖胺糖醛類物質(zhì)，是由氨基葡萄糖、葡萄糖醛酸和硫酸酯聚合而成。因?yàn)楦嗡胤肿又杏?個(gè)酸性集團(tuán)，故呈強(qiáng)酸性并高度帶負(fù)電荷，分子呈線形狀態(tài)，其分子質(zhì)量為3 ku～40 ku，平均分子質(zhì)量為16 ku。肝素及鈉鹽為白色或類白色粉末，無毒無味，有吸濕性，易溶于水，不溶于有機(jī)溶劑，如乙醇、丙酮等，但在乙醚中有一定溶解度。旋光度在+42～+56之間，波長(zhǎng)在185 nm～220 nm處有特征吸收峰。肝素有兩性化合物的特點(diǎn)，可與Na+、Ca2+等成鹽，也可與HCl、苦味酸等成鹽。肝素在酸性溶劑中不穩(wěn)定，容易被酸水解，可被氧化劑氧化[4]。對(duì)酶穩(wěn)定，分子中的羥基可以被酯化[5]。了解這些理化性質(zhì)，對(duì)提取分離肝素有重要實(shí)際意義。

2 肝素鈉的提取方法

自從發(fā)現(xiàn)和了解了應(yīng)用價(jià)值后，人們?cè)陂_始探索嘗試肝素提取方法，并對(duì)提取工藝進(jìn)行改進(jìn)。目前提取肝素鈉的方法有很多種，但實(shí)際常用的主要有鹽解法、酶解法、酶解結(jié)合法等較為普通。

2.1 鹽解法

肝素與蛋白質(zhì)結(jié)合在一起，存在于哺乳動(dòng)物腸黏膜、肺、肝等臟器內(nèi)，提取的過程實(shí)質(zhì)是去雜的過程。鹽解法提取工藝，首先將動(dòng)物腸黏膜破碎溶解，經(jīng)氯化鈉鹽析，大孔陰離子樹脂吸附，洗脫，其洗脫液用乙醇沉淀、脫水得粗品。粗品溶解后再經(jīng)鹽析，用脫色劑脫色，去除熱源后沉淀，脫水干燥后得到肝素鈉精制品。陳來同[6]經(jīng)過多年研究，對(duì)傳統(tǒng)提取肝素鈉方法進(jìn)行改進(jìn)，對(duì)鹽解溫度、pH、樹脂洗脫溫度、乙醇用量等方面做了優(yōu)化處理，總結(jié)了一種新的肝素鈉提取工藝，效價(jià)可達(dá)110 U/mg。進(jìn)一步對(duì)提取后的副產(chǎn)品綜合利用做了闡述。姜平等[7]采用農(nóng)場(chǎng)豬腸黏液小規(guī)?；崛「嗡剽c，根據(jù)實(shí)踐經(jīng)驗(yàn)小結(jié)出提取要點(diǎn)。鄭川[8]采用新鮮豬肺或冷凍豬肺自然解凍后，放入絞肉機(jī)中連續(xù)絞兩次，成糊狀后，在充分?jǐn)嚢柘录尤氲攘壳逅當(dāng)嚢?，用以提取肝素鈉。任紅媛等[9]對(duì)豬小腸肝素鈉提取及精制做了一些改進(jìn)，腸黏膜水解液的pH 10.0～11.0時(shí)，漿液變得渾濁且較黏稠，易堵塞D-254樹脂孔，不利于吸附；而溶液的pH 8.7～9.5時(shí)，漿液澄清度較好，提高了樹脂吸附率。通過精制處理，采用高錳酸鉀和過氧化氫兩步氧化，最后低溫離心得到精品肝素鈉。精品平均收率為0.74%，效價(jià)值為146.38 U/mg。除用小腸黏膜提取外，俞純方等[10]從豬大腸腌液中提取了肝素鈉，江燕等[11]也從牛肺中提取了精品肝素鈉。師希雄等[12]在傳統(tǒng)提取工藝上，結(jié)合微波輔助從羊肺中提取肝素鈉，用正交試驗(yàn)確定最佳提取工藝條件。結(jié)果表明，最佳提取工藝為料液比1∶15，微波作用時(shí)間180 s，微波功率480 W，沉淀劑用量0.8%，肝素鈉得率為294.78 mg/kg。關(guān)于樹脂吸附方面，劉生峰等[13]比較4種陰離子交換樹脂對(duì)肝素鈉的吸附效果，研究表明FPA98型大孔樹脂對(duì)肝素鈉吸附率達(dá)92%。

鹽解法提取肝素鈉有一定傳統(tǒng)優(yōu)勢(shì)，提取過程是在一定條件下，從動(dòng)物器官肥大細(xì)胞中使肝素蛋白質(zhì)復(fù)合物發(fā)生解離的過程。提取過程中影響因素很多，包括提取材料的新鮮程度，如材料污染有許多微生物會(huì)發(fā)酵分解肝素，還會(huì)產(chǎn)生一些有害物質(zhì)使樹脂中毒。研究發(fā)現(xiàn)，添加堿液可防止腸黏膜腐敗。對(duì)來不及提取的黏液可用2.0 mol/L NaOH溶液調(diào)pH 9.5～10.0，置低溫下作短期儲(chǔ)存[14]。NaCl的合理用量，提取溫度、時(shí)間、pH，吸附樹脂選用和質(zhì)量，洗脫等方面都對(duì)肝素鈉質(zhì)量有影響[15]。正確掌握工藝流程，把握好每個(gè)環(huán)節(jié)、操作注意事項(xiàng)等，就能提高肝素鈉的產(chǎn)量和質(zhì)量。

2.2 酶解法

肝素在動(dòng)物器官是以肝素-蛋白質(zhì)復(fù)合物的形式存在，除用鹽解法外，還可通過酶解去除復(fù)合物中的蛋白質(zhì)成分，游離出肝素。得到肝素鈉粗品后，利用蛋白質(zhì)水解酶除去殘存的蛋白質(zhì)，不僅能提高效價(jià)，而且能解蔽肝素活性釋放，獲得較高活性肝素鈉。張耕[16]研究從牛肺中提取肝素鈉工藝，用鹽解工藝不能將肝素與蛋白質(zhì)形成的糖蛋白完全分離，提取效果一般，采用胰蛋白酶酶解后再鹽解獲得較高的肝素收率。宋大巍等[17]也采用胰蛋白酶法提取肝素，并對(duì)工藝參數(shù)進(jìn)行了優(yōu)化研究。程林坤等[18]采用酶解法解離牦牛肺中肝素，提出粗品后，進(jìn)一步去除其殘存的結(jié)合蛋白質(zhì)，使用胰蛋白酶降解成小分子肽，結(jié)合H2O2氧化法對(duì)肝素鈉進(jìn)行精制。通過L9(34)正交試驗(yàn)結(jié)合天青A比色法測(cè)定肝素鈉效價(jià)，確定最佳工藝條件為：木瓜蛋白酶1∶5 000，酶解3 h，胰蛋白酶1∶2 000，過氧化氫1%，條件優(yōu)化后產(chǎn)品效價(jià)為131 U/mg，產(chǎn)率可達(dá)1.92%。孫學(xué)超等[19]采用3種復(fù)合酶從腸渣中提取肝素鈉，對(duì)比研究表明，木瓜蛋白酶和鏈蛋白酶復(fù)合酶提取肝素鈉，效價(jià)為15 USPU/mg；胰蛋白酶和鏈蛋白酶復(fù)合酶效價(jià)為34 USPU/mg；2709堿性蛋白酶和胰蛋白酶復(fù)合酶效價(jià)為39 USPU/mg。效價(jià)最高為2709堿性蛋白酶和胰蛋白酶，能有效提取腸渣中殘留的肝素鈉。

2.3 酶解結(jié)合法

近幾年來，在酶解法提取肝素鈉工藝中，結(jié)合其他方法進(jìn)行綜合提取，已獲得高效價(jià)肝素鈉精品。海文英等[20]采用堿性條件下酶解的方法，得到肝素鈉粗提取液，再用膜技術(shù)除去粗提液中的雜質(zhì)，后用D208樹脂吸附工藝，純化膜除雜濃縮液，最后用乙醇沉淀樹脂洗脫液得到肝素鈉。工藝流程為先變性，再用堿性酶解的方法，料液比為1∶1，溫度為55℃，NaCl濃度為35 g/L，pH9.5，酶解時(shí)間為3.5 h。在這樣較為溫和的條件下，保持了在提取過程中肝素活性，采用膜技術(shù)對(duì)肝素鈉粗提取液初步純化，經(jīng)過40℃條件下，操作壓力為0.2 MPa的微濾膜，有效分離了溶液中的懸浮顆粒、大分子蛋白質(zhì)、核酸等蛋白質(zhì)。微濾膜濾液再進(jìn)行兩步超濾膜除雜濃縮，濃縮倍數(shù)為10倍，超濾對(duì)肝素鈉的截留率為93%。對(duì)4種樹脂選 用D280樹脂吸附，最后用冷凍干燥的方法得到肝素鈉產(chǎn)品，單位效價(jià)達(dá)160 U/mg。董潔等[21]以豬小腸黏膜為原料，通過酶解-樹脂吸附/洗脫-膜分離-乙醇沉淀-干燥的提取工藝方法提取肝素鈉。此工藝方法與傳統(tǒng)的鹽解-離子交換-乙醇沉淀法相比，該法分離肝素鈉效價(jià)提高到160 U/mg，生產(chǎn)成本降低，工藝合理可行。

3 肝素鈉臨床應(yīng)用

經(jīng)分離提取的肝素鈉，是一種天然抗凝血物質(zhì)，具有抗凝血、抗血栓、降血脂等多種生理活性，是防止動(dòng)脈粥樣硬化、心腦血管疾病的有效藥物。普通肝素經(jīng)解聚制備成一類分子質(zhì)量低于6 ku的總稱為低分子肝素。臨床常見有依諾肝素鈉、達(dá)肝素鈉、那曲肝素鈣等，低分子肝素與普通肝素相比較有明顯的優(yōu)勢(shì)，分子質(zhì)量越低，半衰期較長(zhǎng)，抗凝血因子Xa活性越強(qiáng)，這樣就使抗血栓作用與出血作用分離，保持了肝素的抗血栓作用，而降低了出血的危險(xiǎn)。臨床上用于預(yù)防和治療血栓栓塞性疾病，如心肌梗死、血栓性靜脈炎、肺血栓等，特別是預(yù)防普外手術(shù)和骨科手術(shù)中的高危病人。肝素鈉提取工藝在不斷改進(jìn)，提取方法也日趨成熟。據(jù)中國產(chǎn)業(yè)調(diào)研網(wǎng)發(fā)布的《中國肝素鈉行業(yè)發(fā)展前景分析及投資風(fēng)險(xiǎn)預(yù)測(cè)報(bào)告(2015年-2020年)》報(bào)導(dǎo)，我國肝素原料藥供應(yīng)量居全球首位，占全球供應(yīng)量的50%以上。目前肝素是世界上最有效和臨床用量最大的抗凝血藥物，在血液透析治療中是唯一有效的特效藥物，低分子肝素具有更為廣泛的臨床醫(yī)學(xué)用途。隨著對(duì)肝素研究的不斷深入，肝素制劑中還有低抗凝活性肝素，改構(gòu)型肝素、類肝素等。這些藥物特點(diǎn)是具有低抗凝高抗栓、作用時(shí)間長(zhǎng)和出血作用少的優(yōu)點(diǎn)，很有開發(fā)前途，肝素的應(yīng)用領(lǐng)域還將進(jìn)一步擴(kuò)展。

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Progress on Extraction Methods of Heparin from Animal Organs

MA Zhi-ke, MA Li

(CollegeofAnimalScienceandTechnology,NorthwestA&FUniversity,Yangling,Shaanxi, 712100,China)

Heparin is a family of natural compounds of acid mucopolysaccharide. It has a variety of physiological activities such as anti-clotting, preventing thrombosis, reducing blood fat and so on. It is a significant drug to prevent atherosclerosis and cerebrovascular disease. This paper summarized the chemistry and physical characters of heparin. It also made a literature review about clinical applications and research progress on extracting heparin from animal organs by salt precipitation, enzymatic hydrolysis, enzymatic hydrolysis combined techniques.

animal organ; heparin; extraction method; clinical application

2015-11-21

國家現(xiàn)代農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系建設(shè)項(xiàng)目(CARS-38)

馬志科(1960- )，男，陜西武功人，碩士，高級(jí)實(shí)驗(yàn)師，主要從事實(shí)驗(yàn)教學(xué)及科研工作。

S852.23

A

1007-5038(2016)05-0106-03