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體外誘導(dǎo)臍帶血間充質(zhì)干細(xì)胞向軟骨細(xì)胞分化研究進(jìn)展

李興福段莉梁宇杰熊建義吳漢偉王大平

510182，廣州醫(yī)科大學(xué)(李興福)；518035， 深圳市組織工程重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室、深圳市第二人民醫(yī)院(段莉、熊建義、吳漢偉、王大平)；518035，北京大學(xué)深圳研究生院(梁宇杰)

摘要種子細(xì)胞是軟骨組織工程三大要素之一。臍帶血間充質(zhì)干細(xì)胞(UCB-MSC)可被誘導(dǎo)轉(zhuǎn)化為軟骨細(xì)胞，具有構(gòu)建組織工程化軟骨的潛能，是目前軟骨組織工程領(lǐng)域研究的新熱點(diǎn)。UCB-MSC作為一種新型干細(xì)胞可用于臨床治療關(guān)節(jié)軟骨缺損。該文就體外誘導(dǎo)UCB-MSC向軟骨細(xì)胞分化研究進(jìn)展作一綜述。

關(guān)鍵詞軟骨組織工程；軟骨細(xì)胞；臍帶血間充質(zhì)干細(xì)胞

軟骨組織工程技術(shù)涉及種子細(xì)胞、支架材料和細(xì)胞因子[1]，臨床上已用于修復(fù)關(guān)節(jié)軟骨缺損，但由于種子細(xì)胞來(lái)源有限且體外擴(kuò)增易發(fā)生去分化，極大地限制了軟骨組織工程技術(shù)的發(fā)展。臍帶血間充質(zhì)干細(xì)胞(UCB-MSC)經(jīng)體外誘導(dǎo)可向軟骨細(xì)胞分化，有望解決軟骨組織工程種子細(xì)胞的供應(yīng)問(wèn)題。

在不同誘導(dǎo)條件下，UCB-MSC不但可向不同譜系分化，還可跨胚層分化[2]。此外，UCB-MSC的免疫原性低，不易引起移植物抗宿主病。目前學(xué)者們對(duì)誘導(dǎo)UCB-MSC向軟骨細(xì)胞分化的方法尚未達(dá)成統(tǒng)一共識(shí)，其機(jī)制也眾說(shuō)紛蕓。

1誘導(dǎo)因子

眾所周知，間充質(zhì)干細(xì)胞(MSC)在增殖和分化過(guò)程中受到誘導(dǎo)因子的調(diào)控。誘導(dǎo)不同來(lái)源的MSC向軟骨細(xì)胞分化需要各具特色的誘導(dǎo)因子，而目前用于誘導(dǎo)UCB-MSC向軟骨細(xì)胞分化的誘導(dǎo)因子主要包括轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子 (TGF)-β超家族、胰島素樣生長(zhǎng)因子(IGF)和成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子(FGF)等。

1.1TGF-β超家族

TGF-β超家族是MSC成軟骨細(xì)胞誘導(dǎo)中常見(jiàn)的生長(zhǎng)因子，包括 TGF-β、骨形態(tài)發(fā)生蛋白(BMP)、激活素和抑制素等，其中TGF-β與BMP最為常用。

TGF-β超家族可促進(jìn)軟骨細(xì)胞增殖，調(diào)節(jié)軟骨細(xì)胞分化，并刺激軟骨細(xì)胞合成胞外基質(zhì)，在軟骨形成過(guò)程中起到重要作用。TGF-β可促進(jìn)轉(zhuǎn)錄因子SOX9表達(dá),而SOX9可調(diào)控Ⅱ型膠原合成，這對(duì)軟骨細(xì)胞分化至關(guān)重要，因此TGF-β具有誘導(dǎo)多種來(lái)源的MSC向軟骨細(xì)胞分化的潛力[3-4]。Rey-Rico等[5]研究發(fā)現(xiàn)，復(fù)合于支架材料的TGF-β1緩釋可誘導(dǎo)MSC向軟骨細(xì)胞分化。然而，單純TGF-β誘導(dǎo)易導(dǎo)致軟骨細(xì)胞肥大化，不利于構(gòu)建組織工程化軟骨[6]。有研究[7]發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)GF和甲狀旁腺激素相關(guān)蛋白(PTHrP)可抑制軟骨細(xì)胞早期肥大化。因此，TGF-β與 FGF或PTHrP聯(lián)合使用或可抑制UCB-MSC在分化過(guò)程中發(fā)生早期肥大化。

BMP在軟骨形成過(guò)程中發(fā)揮重要作用，常用于誘導(dǎo)MSC向軟骨細(xì)胞分化。BMP-2、BMP-4、BMP-6均具有誘導(dǎo)MSC向軟骨細(xì)胞分化的功能，但并不能單獨(dú)誘導(dǎo)MSC團(tuán)塊成功分化為軟骨，而其與TGF-β聯(lián)合使用可達(dá)到理想效果[8]。An等[9]聯(lián)合使用BMP-6與TGF-β3誘導(dǎo)UCB-MSC向軟骨細(xì)胞分化，取得理想效果。此外，BMP能促進(jìn)軟骨細(xì)胞增殖并啟動(dòng)其成熟過(guò)程[10],有利于組織工程化軟骨的完善。

1.2IGF

IGF家族包括IGF-1和IGF-2，均可促進(jìn)細(xì)胞增殖，且IGF-1作用較強(qiáng)。IGF-1不僅能促進(jìn)軟骨細(xì)胞增殖和成熟，而且可刺激軟骨細(xì)胞合成基質(zhì)蛋白多糖，并具有誘導(dǎo)MSC向軟骨細(xì)胞分化的能力。 Zhong等[11]研究發(fā)現(xiàn)，IGF-1可促進(jìn)軟骨細(xì)胞增殖和成熟,但其也會(huì)使軟骨細(xì)胞肥大化。Mara等[12]研究發(fā)現(xiàn)，IGF-1誘導(dǎo)UCB-MSC向軟骨細(xì)胞分化的效率不如TGF-β3，表現(xiàn)為由IGF-1誘導(dǎo)的UCB-MSCⅡ型膠原、聚集蛋白聚糖和SOX9表達(dá)水平低于由TGF-β3誘導(dǎo)的UCB-MSC,尤其是在UCB-MSC微球誘導(dǎo)體系，IGF-1的劣勢(shì)更為明顯。目前學(xué)者們對(duì)IGF-1誘導(dǎo)MSC成軟骨機(jī)制尚不完全清楚。

1.3FGF

FGF可促進(jìn)軟骨細(xì)胞和MSC增殖，其中堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子(bFGF)的應(yīng)用最為廣泛。bFGF可促進(jìn)軟骨細(xì)胞分泌基質(zhì)蛋白，并阻止蛋白聚糖降解，故常用于構(gòu)建組織工程化軟骨。在誘導(dǎo)MSC向軟骨細(xì)胞分化時(shí)，bFGF常與TGF、BMP及IGF等聯(lián)合使用，可有效促進(jìn)MSC向軟骨細(xì)胞分化并維持軟骨細(xì)胞表型[13]。FGF家族在促進(jìn)MSC快速增殖的同時(shí)，還能保持MSC的多向分化能力，故可用于MSC培養(yǎng)擴(kuò)增階段。

1.4其他誘導(dǎo)因子

除上述誘導(dǎo)因子外，PTHrP、胰島素、白細(xì)胞介素(IL)-10、腫瘤壞死因子 (TNF)-α等也具有成軟骨誘導(dǎo)作用[14-15]。目前學(xué)者們認(rèn)為可采用多種誘導(dǎo)因子協(xié)同作用來(lái)誘導(dǎo)MSC向軟骨細(xì)胞分化，以避免單獨(dú)使用誘導(dǎo)因子造成的不良結(jié)果，如聯(lián)合使用TGF-β3、BMP-6及bFGF可高效誘導(dǎo)MSC向軟骨細(xì)胞分化，同時(shí)使用PTHrP可抑制軟骨細(xì)胞早期肥大化，或可構(gòu)建理想組織工程化軟骨。

2軟骨細(xì)胞與UCB-MSC共培養(yǎng)

共培養(yǎng)技術(shù)可高效誘導(dǎo)MSC向軟骨細(xì)胞分化，已被廣泛應(yīng)用于構(gòu)建組織工程化軟骨，且取得顯著效果。在共培養(yǎng)體系中，軟骨細(xì)胞分泌TGF-β刺激轉(zhuǎn)錄因子SOX9表達(dá)，從而促進(jìn)MSC向軟骨細(xì)胞分化，同時(shí)MSC分泌FGF刺激軟骨細(xì)胞增殖及胞外基質(zhì)合成分泌[16-17]。由此可知，共培養(yǎng)體系可誘導(dǎo)UCB-MSC向軟骨細(xì)胞分化。Zuo等[18]在體外將大鼠軟骨細(xì)胞和MSC分別進(jìn)行直接共培養(yǎng)和間接共培養(yǎng)，3周后采用流式細(xì)胞儀分離兩種細(xì)胞并進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果提示直接共培養(yǎng)組軟骨細(xì)胞SOX9、Ⅱ型膠原、聚集蛋白聚糖表達(dá)水平明顯高于間接共培養(yǎng)組，且兩組軟骨細(xì)胞SOX9、Ⅱ型膠原、聚集蛋白聚糖表達(dá)水平高于MSC；因此認(rèn)為在共培養(yǎng)體系中軟骨細(xì)胞與MSC之間相互作用，且MSC促進(jìn)軟骨細(xì)胞形成基質(zhì)蛋白的作用強(qiáng)于軟骨細(xì)胞對(duì)MSC的誘導(dǎo)作用，MSC與軟骨細(xì)胞直接物理接觸在促進(jìn)軟骨基質(zhì)蛋白表達(dá)中起到更重要的作用。

目前共培養(yǎng)體系中細(xì)胞接種密度、接種比例、培養(yǎng)時(shí)間及理化因素干預(yù)等方面均存在爭(zhēng)議，而應(yīng)用共培養(yǎng)技術(shù)誘導(dǎo)UCB-MSC向軟骨細(xì)胞分化面臨諸如UCB-MSC培養(yǎng)成功率低等問(wèn)題。為獲得優(yōu)質(zhì)足量的透明軟骨細(xì)胞，還需對(duì)共培養(yǎng)體系進(jìn)行深度探討。

3轉(zhuǎn)基因技術(shù)

轉(zhuǎn)基因技術(shù)不僅可以誘導(dǎo)MSC定向分化，還能規(guī)避諸多風(fēng)險(xiǎn)，并在體內(nèi)外持續(xù)作用，提高M(jìn)SC分化效率，因此其逐漸成為軟骨組織工程領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)。用于軟骨組織工程的基因常能表達(dá)具有軟骨誘導(dǎo)作用的生長(zhǎng)因子如TGF-β、IGF、BMP等，以及調(diào)控軟骨發(fā)育的轉(zhuǎn)錄因子如SOX9、血小板反應(yīng)蛋白(TSP)-2、音猬因子(Shh)等。Odabas等[19]研究發(fā)現(xiàn)，原代軟骨細(xì)胞經(jīng)BMP-7轉(zhuǎn)染后，分泌基質(zhì)能力和增殖能力均有明顯增強(qiáng)，BMP-7轉(zhuǎn)染組形成的軟骨優(yōu)于非BMP-7 轉(zhuǎn)染組。Wang等[20]研究發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)染SOX9的UCB-MSC高表達(dá)聚集蛋白聚糖和Ⅱ型膠原，提示短期SOX9過(guò)表達(dá)可促進(jìn)UCB-MSC向軟骨細(xì)胞分化。Jeong等[21]采用血小板反應(yīng)蛋白(TSP)-2 siRNA轉(zhuǎn)染人類(lèi)UCB-MSC，發(fā)現(xiàn)TSP-2可經(jīng)Notch信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路促進(jìn)人類(lèi)UCB-MSC向軟骨細(xì)胞分化，并能抑制人類(lèi)UCB-MSC肥大化，且不同來(lái)源的MSC向軟骨細(xì)胞分化的潛力受細(xì)胞內(nèi)TSP-2表達(dá)水平的影響；因此認(rèn)為細(xì)胞內(nèi)TSP-2表達(dá)水平可作為篩選優(yōu)質(zhì)MSC的參考標(biāo)準(zhǔn)。

目前轉(zhuǎn)基因技術(shù)用于促進(jìn)UCB-MSC向軟骨細(xì)胞分化仍存在諸多問(wèn)題，如操作過(guò)程中細(xì)胞損傷，生長(zhǎng)因子長(zhǎng)期過(guò)表達(dá)可引起細(xì)胞異常生長(zhǎng)等。只有妥善解決以上問(wèn)題，才能將轉(zhuǎn)基因技術(shù)更好地推廣到軟骨組織工程領(lǐng)域。

4三維培養(yǎng)

三維環(huán)境有利于充分發(fā)揮細(xì)胞間的相互作用，且能容納高密度的細(xì)胞黏附，有利于細(xì)胞增殖，而支架材料可為軟骨細(xì)胞生長(zhǎng)提供良好的三維環(huán)境，因此在誘導(dǎo)MSC向軟骨細(xì)胞分化過(guò)程中經(jīng)常使用。Yang等[22]利用瓊脂糖支架間接共培養(yǎng)MSC與軟骨細(xì)胞15 d，發(fā)現(xiàn)63∶1(軟骨細(xì)胞∶MSC)的培養(yǎng)比例更有利于細(xì)胞合成聚集蛋白聚糖和Ⅱ型膠原。Kang等[23]應(yīng)用聚乙醇酸/聚乳酸(PGA/PLA)支架建立MSC與軟骨細(xì)胞直接共培養(yǎng)體系，體外培養(yǎng)8周，結(jié)果除1∶9(軟骨細(xì)胞∶MSC)共培養(yǎng)組外，其余各組均發(fā)生軟骨樣改變，5∶5(軟骨細(xì)胞∶MSC)共培養(yǎng)組表現(xiàn)尤為突出；在裸鼠皮下培養(yǎng)6周后, 單純軟骨細(xì)胞培養(yǎng)組和5∶5共培養(yǎng)組都有明顯軟骨樣改變，且5∶5共培養(yǎng)組表現(xiàn)出更好的均質(zhì)性；體內(nèi)培養(yǎng)6周組較體外培養(yǎng)8周組具有更好的力學(xué)性能，其中體內(nèi)5∶5共培養(yǎng)組楊氏模量達(dá)到(4.52±0.41) MPa，接近于正常軟骨組織。以上研究提示三維共培養(yǎng)體系可高效誘導(dǎo)MSC向軟骨細(xì)胞分化。

通過(guò)支架材料協(xié)調(diào)生長(zhǎng)因子與細(xì)胞之間的相互作用以促進(jìn)MSC向軟骨細(xì)胞分化，備受學(xué)者們的關(guān)注。膠原蛋白水凝膠在人體環(huán)境內(nèi)能保持初期的形狀和力學(xué)性能，有望用于制作人造軟骨和人造椎間盤(pán)等，并能作為 “基座材料”構(gòu)建UCB-MSC三維誘導(dǎo)體系，促進(jìn)細(xì)胞分化和組織形成。

5力學(xué)刺激

關(guān)節(jié)軟骨在正常生理狀態(tài)下會(huì)受到各種力學(xué)刺激(如壓力、剪切力等)。力學(xué)刺激通過(guò)改變細(xì)胞內(nèi)第二信使(NO或Ca2+)的濃度，影響TGF、IL-1、IL-6及TNF等的表達(dá)，從而影響MSC向軟骨細(xì)胞分化，進(jìn)而影響軟骨修復(fù)[24]。Song等[25]對(duì)40只成年雄性大鼠建立兩側(cè)股骨髁部髕骨溝全層軟骨缺損模型，并隨機(jī)分為4組，制動(dòng)組術(shù)后不給予運(yùn)動(dòng)刺激，其余3組分別在術(shù)后2、4和8周開(kāi)始給予適度運(yùn)動(dòng)刺激，各組一半大鼠在術(shù)后10周被處理并檢測(cè)，另一半在術(shù)后14周被處理并檢測(cè)，結(jié)果術(shù)后4周開(kāi)始接受運(yùn)動(dòng)刺激的大鼠軟骨修復(fù)效果最好，術(shù)后8周開(kāi)始接受運(yùn)動(dòng)刺激的大鼠軟骨修復(fù)效果最差。以上研究提示，時(shí)機(jī)適宜的力學(xué)刺激有利于軟骨損傷修復(fù)，而過(guò)早或過(guò)晚的力學(xué)刺激不利于軟骨損傷修復(fù)。因此，在促進(jìn)軟骨損傷修復(fù)時(shí)，應(yīng)注意把握力學(xué)刺激的時(shí)機(jī)。

力學(xué)刺激可促進(jìn)MSC向軟骨細(xì)胞分化，但最佳施力大小、時(shí)機(jī)、方式等尚不明確，需進(jìn)一步研究。此外，低氧環(huán)境、弱激光刺激等也具有軟骨誘導(dǎo)作用[26-27]，因此在誘導(dǎo)UCB-MSC向軟骨細(xì)胞分化過(guò)程中可聯(lián)合物理因素干預(yù)，以提高誘導(dǎo)率。

6展望

目前利用UCB-MSC構(gòu)建組織工程化軟骨存在諸多問(wèn)題。首先，UCB-MSC的提取培養(yǎng)成本較高，且原代培養(yǎng)成功率較低；其次，UCB-MSC體外培養(yǎng)周期較長(zhǎng)，易發(fā)生分化；最后，UCB-MSC凍存復(fù)蘇技術(shù)不成熟，長(zhǎng)期儲(chǔ)存UCB-MSC的難度較大[28-29]。 共培養(yǎng)體系誘導(dǎo)UCB-MSC定向分化的效率高且成本低，但UCB-MSC與軟骨細(xì)胞之間的相互作用機(jī)制及其調(diào)節(jié)機(jī)制尚不完全清楚。隨著對(duì)軟骨發(fā)育調(diào)控機(jī)制的深入了解，更多的技術(shù)和方法將被引入這一領(lǐng)域，從而解決以上難題，促進(jìn)軟骨組織工程技術(shù)的發(fā)展。

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(收稿: 2016-02-24; 修回: 2016-04-07)

(本文編輯: 盧千語(yǔ))

基金項(xiàng)目：國(guó)家自然科學(xué)基金(81572198、81260161、81000460)、廣東省醫(yī)學(xué)科研基金(A2016314)、深圳市科技創(chuàng)新委員會(huì)基礎(chǔ)研究布局項(xiàng)目(JCYJ20160301111338144)、深圳市科技創(chuàng)新委員會(huì)技術(shù)攻關(guān)項(xiàng)目(JSGG20140519105550503)

通信作者：王大平E-mail: dapingwang1963@qq.com

DOI：10.3969/j.issn.1673-7083.2016.04.011