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特異性抗神經(jīng)元抗體對副瘤性神經(jīng)系統(tǒng)綜合征及癌癥的預測和早期診治價值

陳齊鳴

副瘤性神經(jīng)系統(tǒng)綜合征(paraneoplastic neurological syndromes,PNS)是一種與惡性腫瘤密切相關(guān)的神經(jīng)系統(tǒng)疾病。它既非癌腫的直接侵犯、壓迫及轉(zhuǎn)移所至，也不是由于癌腫導致的代謝障礙、感染、血管性疾病、惡病質(zhì)及放療和化療的并發(fā)癥引起的中樞神經(jīng)系統(tǒng)(CNS)損害,往往是一種很小的固體腫瘤或處于癌前期階段的腫瘤而導致的神經(jīng)系統(tǒng)的遠隔癥狀。因而PNS可在腫瘤發(fā)生前或與腫瘤同時也可在腫瘤發(fā)生后或在腫瘤復發(fā)時出現(xiàn)。與PNS相關(guān)的惡性腫瘤主要見于小細胞肺癌(small cell lung cancer,SCLC)[1-2]、乳腺癌、卵巢癌等婦科腫瘤[3]，還可見于前列腺癌、食管癌、卵巢畸胎瘤、結(jié)腸癌、白血病、胸腺瘤、黑色素瘤、睪丸癌、非何杰金氏淋巴瘤等其它癌腫。近年來由于發(fā)現(xiàn)了部分PNS患者血清和腦脊液(CSF)中存在特異性抗神經(jīng)元抗體，如抗-Hu抗體(ANNA-1)、抗-Yo抗體(PCA-1)、抗-Ri抗體(ANNA-2)、抗CV2抗體、抗-Amphiphysin抗體及抗-Ma2/TA[3-5]六種確定性抗體，從而認為PNS發(fā)病機制可能與自身免疫有關(guān)，引起國內(nèi)外醫(yī)學界對此病的強烈關(guān)注，并進行了深入而廣泛的研究。

在上述PNS患者自身抗體中，抗-Hu抗體研究較為詳細?？?Hu抗體是一種多克隆IgG抗體，主要與中樞及外周神經(jīng)元和小細胞肺癌細胞核中一種相對分子量為35 000-40 000的蛋白結(jié)合，與細胞質(zhì)反應輕微，不與核仁反應[3-5]。與抗-Hu抗體結(jié)合的蛋白為RNA結(jié)合蛋白的大家族，用抗-Hu抗體篩選人cDNA文庫可以得到三種不同的目的基因，產(chǎn)生HuD、HuC和Hel-N1三種基因產(chǎn)物，HuD為一種高度保守的人類神經(jīng)元的RNA結(jié)合蛋白，包括3個RNA結(jié)合位點，在mRNA編碼蛋白質(zhì)中其重要作用，參與神經(jīng)元mRNA前體的剪接、細胞定位和穩(wěn)定，維持神經(jīng)元的表現(xiàn)型及神經(jīng)系統(tǒng)的正常分化和發(fā)育[6]。

在SCLC等多種癌腫的癌細胞中含有神經(jīng)內(nèi)分泌顆粒，內(nèi)有HuD蛋白，具有內(nèi)分泌和化學受體功能，并能誘導針對HuD蛋白的自身抗體，產(chǎn)生多種PNS。SCLC患者無論是否發(fā)生PNS，癌細胞中都有HuD蛋白的高度表達，并發(fā)PNS的患者，其血清中都有高滴度Hu抗體，且2/3患者Hu抗體出現(xiàn)在SCLC潛伏期中。有抗-Hu抗體的SCLC患者預后較好，生存期較長，而且早期發(fā)現(xiàn)的SCLC的患者易得到根治，但有些PNS患者往往是由于神經(jīng)系統(tǒng)早期嚴重損傷而致殘。因此，對SCLC的HuD抗原激發(fā)的PNS進行深入研究，特別是探索免疫學的發(fā)病機制，對于PNS及SCLC的早期診治有重要意義。

1PNS與體液免疫

Vega F[7]等用Schuller數(shù)學公式對16例副瘤性腦脊髓炎(PEM)和14例副瘤性亞急性感覺性神經(jīng)元病(SSN)患者抗-Hu抗體的鞘內(nèi)合成進行了計算并進行了比較，發(fā)現(xiàn)PEM患者CSF中有高滴度抗體88%存在鞘內(nèi)合成，而SSN為7%，兩者相比有極大的差異(P<0.0001),該結(jié)果支持PNS是一種體液免疫密切相關(guān)的自身免疫性疾病。de Graaf等[8]用流式細胞評估伴有抗-Hu抗體陽性的PNS患者(Hu-PNS)中的主要淋巴細胞亞群，與對照組比較，Hu-PNS患者CSF中B細胞亞群顯示出顯著的絕對值和相對值增多，CD4+、CD8+和NK細胞數(shù)僅顯示絕對值增多，在Hu-PNS的血與CSF中，相對的B細胞增多與抗-Hu抗體的鞘內(nèi)合成結(jié)果一致。

Greealee等[9]認為抗-Hu抗體是副瘤性的免疫球蛋白，可識別所有神經(jīng)元中的細胞核抗原，發(fā)現(xiàn)IgG抗體能夠進入神經(jīng)元內(nèi)并與神經(jīng)元胞內(nèi)蛋白起反應，可導致神經(jīng)元不可逆的死亡。用抗Hu血清進行大鼠的海馬與小腦腦片培養(yǎng)，即時評價神經(jīng)元抗體的攝取和延遲培養(yǎng)過程中神經(jīng)元的死亡，為測試抗-Hu抗體的特異性細胞毒效應，將靶抗原HuD吸附前與吸附后抗-Hu抗體的IgG血清與大鼠腦片培養(yǎng)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)：(1)大鼠海馬及小腦神經(jīng)元快速攝取抗-Hu抗體；(2)抗體在活的神經(jīng)元中被攝??；(3)在細胞內(nèi)結(jié)合的抗-Hu抗體導致神經(jīng)元死亡；(4)用HuD吸附抗-Hu抗體后顯著減少神經(jīng)元內(nèi)的IgG聚集并且消除了細胞毒作用。確認抗體介導的神經(jīng)元死亡的特異性。抗-Hu抗體導致神經(jīng)元死亡的現(xiàn)象是Hu-PNS患者發(fā)生神經(jīng)系統(tǒng)不可逆損傷的主要原因。

2PNS與細胞免疫

實驗室研究表明，通過激活的CD8+T細胞加入γ-干擾素共同孵育可以溶解自身注入HuD抗原的纖維母細胞[10]。

Tanaka[11]認為PNS是由惡性腫瘤觸發(fā)的自身免疫過程，針對的靶抗原是腫瘤和中樞神經(jīng)系統(tǒng)(CNS)細胞核共同抗原。攻擊細胞內(nèi)蛋白的特異性神經(jīng)元抗體可能導致細胞毒T淋巴細胞(CTL)介導的細胞死亡。目前有下列發(fā)現(xiàn)支持這一假說：(1)腦脊液中單核細胞突出占優(yōu)勢；(2)在腫瘤和神經(jīng)組織中有炎性細胞的侵潤，主要是CD8+T淋巴細胞；(3)在CNS病灶中，利用T細胞受體檢測侵潤的T淋巴細胞是寡克隆的;(4)僅僅抗細胞內(nèi)蛋白抗體如抗-Hu抗體并不能產(chǎn)生疾病模型;(5)Hu-PNS周圍血中的單個核白細胞(PBMC)分離CD8+T細胞中可誘導產(chǎn)生具有活性的CTL;(6)Hu-PNS具有共同人類白細胞Ⅰ型抗原(HLA)決定簇，表明Hu-PNS在細胞表面提交某些抗原多肽可刺激CD8+T細胞，作為效應細胞攻擊靶組織?？乖禺愋缘腃 TL介導的細胞死亡是將來建立腫瘤免疫和PNS神經(jīng)疾病動物模型潛在的研究方向。

De Jongste[12]利用多參數(shù)流式細胞儀對11例新診斷為Hu-PNS患者血清與CSF配對標本中的淋巴細胞亞群及樹狀突細胞進行了研究，與9例其它炎癥性神經(jīng)系統(tǒng)疾病，12例其它神經(jīng)系統(tǒng)疾病進行對照，患者CSF中的調(diào)節(jié)性T細胞、中央記憶T細胞、類別轉(zhuǎn)換性B細胞和樹狀突細胞升高。這些研究結(jié)果支持Hu-PNS局部激活免疫系統(tǒng)，提示Hu-PNS和其它炎癥性CNS疾病有共同的致病途徑。

3尚未解決的科學問題和國內(nèi)研究現(xiàn)狀

上述研究雖然有所見解和收獲，但是確缺乏深入系統(tǒng)和廣泛的研究，很多的現(xiàn)象無法用現(xiàn)有的理論去解釋。目前發(fā)現(xiàn)相同的腫瘤HuD抗原導致的PNS的表現(xiàn)型差異性較大，如：(1)70%的惡性腫瘤患者在確診前就出現(xiàn)PNS[13]。(2)抗-Hu抗體與SCLC和PNS三者的組合中有多種表現(xiàn)型，PNS可累及CNS和周圍神經(jīng)系統(tǒng)各個不同部位神經(jīng)元造成損害,如亞急性感覺性神經(jīng)元病是以周圍神經(jīng)損害為主，而邊緣葉腦炎是以大腦顳葉海馬的神經(jīng)元損傷為主[13-15]；(3)SCLC伴抗-Hu抗體的患者,腫瘤生長隱匿,腫塊通常很小,生存期較一般腫瘤患者延長，而且可以緩解，預后較好，提示HuD抗原激發(fā)的免疫效應不僅僅損傷CNS，也有顯著的抑瘤效應[3，16-17]；(4)不同的腫瘤如十二指腸神經(jīng)內(nèi)分泌腫瘤、肺腺癌、乳腺癌等可產(chǎn)生相同的抗-Hu抗體和不同的PNS[18-19]。上述種種謎團尚未得到解決。

我們在原國家教育部、安徽省人事廳、科技廳、教育廳、衛(wèi)生廳以及法國巴黎居里大學Salpêtrière醫(yī)學院附院Dlattre教授及法國醫(yī)科院神經(jīng)分子免疫實驗室(INSERMU 134)Schuller教授的大力支持下于1993年開展了對PNS的臨床及免疫學研究，在國內(nèi)報道3種特異性神經(jīng)元抗體與PNS的臨床表現(xiàn)、臨床分型及相關(guān)腫瘤之間的關(guān)系，建立了實驗室免疫學診斷標準，開展了對抗-Hu、抗-Yo及抗-Amphiphysin抗體的檢測，發(fā)現(xiàn)PNS/SCLC患者血清中抗-Hu抗體滴度高達1：64 000,CSF中高達1：4 000，尿液中高達1：200，在患者CNS中存在特異性抗體合成，抗體特異活性明顯增高[19]。采用流式細胞術(shù)檢測10例PNS患者外周血T細胞亞群、活化及調(diào)節(jié)性T細胞，并與正常人及SCLC患者比較，發(fā)現(xiàn)PNS患者外周血CD3+，CD4+T細胞及CD4+/CD8+降低，活化T細胞增多及調(diào)節(jié)性T細胞減少。提示其細胞免疫功能總體處于低下狀態(tài)；并有T細胞過度激活及調(diào)節(jié)性T細胞所介導的免疫抑制功能的降低[20]。針對PNS患者外周血單個核白細胞(PBMC)的增殖反應及其對SCLC細胞株(H446)的抑制作用發(fā)現(xiàn)PNS患者的PBMC經(jīng)白介素-2刺激后，患者CD4+比例(76.54±3.96)%較正常對照組(51.75±7.3)%顯著升高(P<0.05),所以PNS患者PBMC增殖反應以CD4+T細胞為主[21]。國內(nèi)外的研究結(jié)果均表明PNS與自身腫瘤抗原導致的自身免疫有關(guān)。

4科學假設

HuD抗原在PNS自身免疫致病過程中可能起激發(fā)作用，導致機體產(chǎn)生體液免疫出現(xiàn)高滴度的特異性神經(jīng)元自身抗體，產(chǎn)生體液免疫作用于中樞神經(jīng)元，另一方面也激發(fā)宿主CNS中的特異性細胞免疫，涉及到某些T細胞亞群如CD4+，CD8+，Th17/Treg調(diào)節(jié)性T細胞及NKT細胞。宿主體內(nèi)發(fā)生的自身免疫反應對患者一方面有保護作用，抑制和殺傷自身腫瘤細胞，使高度惡性SCLC很少轉(zhuǎn)移。另一方面卻把自身中樞神經(jīng)元誤認為腫瘤細胞，造成自身神經(jīng)元損傷，而導致多種CNS和周圍神經(jīng)系統(tǒng)副瘤綜合征。針對上述現(xiàn)象,我們對于HuD激發(fā)的PNS的免疫學發(fā)病機制提出以下幾種假設:(1)抗-Hu抗體是多克隆免疫球蛋白IgG，識別神經(jīng)元中的胞核抗原，抗體能夠主動進入CNS和周圍神經(jīng)系統(tǒng)神經(jīng)元內(nèi)并與神經(jīng)元胞內(nèi)蛋白HuD起反應，直接導致神經(jīng)元不可逆的死亡;(2)特異性神經(jīng)元抗體和CTL共同作用于CNS的不同部位神經(jīng)元死亡而導致PNS異質(zhì)性;(3)PNS患者個體免疫應答機制不同，存在明顯的輔助性T細胞亞群(Th1/Th2,Th17/Treg)之間平衡失調(diào)，而產(chǎn)生自身免疫的病理過程。

為闡明PNS發(fā)病機制及早期診治PNS及相關(guān)的惡性腫瘤找到新的突破口，本課題擬采用如下方法和技術(shù)：(1)制備神經(jīng)元核蛋白HuD基因產(chǎn)物為激發(fā)抗原，刺激伴有SCLC的Hu-PNS患者體內(nèi)抗原特異性T細胞亞群并進行分析；(2)分析HuD抗原刺激前后的Th1/Th2，Th17/Treg失衡；(3)采用活細胞熒光染料CFSE標記法測定淋巴細胞針對照射后SCLC細胞的增殖反應；(4)采用碘化丙酊和CFSE雙標記法測定HuD特異性效應T細胞對SCLC細胞的毒性作用；(5)應用ELISPOT技術(shù)，測定特異性T細胞克隆；(6)建立人SCLC種植裸鼠動物模型，觀察抗-Hu抗體和/或HuD特異性T細胞在活體內(nèi)對宿主CNS的破壞作用及對腫瘤細胞的殺傷作用。

5科學意義

目前國內(nèi)外對該項目基礎(chǔ)理論研究比較薄弱，因而積極深入探討PNS的免疫學發(fā)病機制，以達到早期診斷PNS、阻斷自身免疫系統(tǒng)對宿主CNS損傷、提高抗腫瘤免疫的作用，期望最終達到預防或者治愈這種致殘率死亡率較高的疾病并發(fā)掘全新的抗腫瘤的治療方法。

[參考文獻]

[1]White D,Beringer T.Paraneoplastic limbic encephalitis in an elderly patient with small cell lung carcinoma[J].Ulster Med J,2010,79(1):22-24.

[2]Bowyer S,Webb S,Millward M,Jasas K,Blacker D,Nowak A.Small cell lung cancer presenting with paraneoplastic limbic encephalitis[J].Asia J Clin Oncol,2011,7(2):180-184.

[3]Karim AR,Jacob S.Immunological markers in neurological disorders[J]．Ann Clin Biochem,2012,49(Pt 1):29-43.

[4]Langer JE,Lopes MB,Fountain NB,et al.An unusual presentation of anti-Hu-associated paraneoplastic limbic encephalitis[J].Dev Med Child Neurol,2012,54(9):863-866.

[5]Graus F,Dalmau J.paraneoplastic neuropathies[J].Curr Opin Neurol,2013,26(5):489-495.

[6]Szabo A,Dalmau J,Manleyy G,et al.HuD,a paraneoplastic encephalomyelitis antigen,contains RNA-binding domains and is homologous to Elav and Sex-lethal[J].Cell,1991,67(2):325-333.

[7]Vega F,GRAUS F,CHEN QM,et al.Intrathecal synthesis of the anti-Hu antibody in patients with paraneoplastic encephalomyelitis or sensory neuronopathy：clinial-immunologic correlation[J].Neurology，1994,44：2145-2147.

[8]de Graaf M1,de Beukelaar J,Bergsma J,et al.B and T cell imbalances in CSF of patients with Hu-antibody associated PNS[J].J Neuroimmunol,2008,195(1-2):164-170.

[9]Greenlee JE,Clawson SA,Hill KE,et al.Neuronal uptake of anti-Hu antibody,but not anti-Ri antibody,leads to cell death in brain slice cultures[J].J Neuroinflammation,2014,11(1):160.

[10]Tanaka K,Tanaka M,Inuzuka T,et al.Cytotoxic T lymphocyte-mediated cell death in paraneoplastic sensory neuronopathy with anti-Hu antibody[J].J Neurol Sci,1999,163(2):159.

[11]Tanaka K1.Pathogenesis of paraneoplastic neurological syndromes[J].Brain Nerve,2010,62(4):309-318.

[12]de Jongste AH1,de Graaf MT,van den Broek PD,et al.Elevated numbers of regulatory T cells,central memory T cells and class-switched B cells in cerebrospinal fluid of patients with anti-Hu antibody associated paraneoplastic neurological syndromes[J].J Neuroimmunol,2013,258(1-2):85-90.

[13]Honnorat J,Viaccoz A.New concepts in paraneoplastic neurological syndromes[J]．Rev Neurol(Paris),2011,167(10):729-736.

[14]Xu L,Hu J,Chen Q.Two cases of paraneoplastic limbic encephalitis associated with small cell lung cancer and a literature review[J].Expl Ther Medi,2015,9(2):335-340.

[15]Antoine JC,Camdessanche JP.Paraneoplastic disorders of the peripheral nervous system[J]．Presse Med,2013,42(6 Pt2):235-244.

[16]Graus F,Dalmou J,Rene R,et al.Anti-Hu antibodies in patients with small-cell lung cancer:association with complete response to therapy and improved survival[J].J Clin Oncol,1997,15(8):2866-2872.

[17]Ryu JY,Lee SH,Lee EJ,et al.A case of paraneoplastic limbic encephalitis associated with small cell lung cancer[J]．Tubrc Respir Dis,2012,73(5):273-277.

[18]Nappi L,Formisano L,Damiano V,et al.Paraneoplastic sensitive neuropathy associated with anti-hu antibodies in a neuroendocrine tumor of duodenum:a case report[J].Int J Immunopathol Pharmacol,2010,23(4)：1281-1285.

[19]陳齊鳴，宋文英，溫偉,等.特異性神經(jīng)元抗核抗體Hu抗體的研究[J].中華神經(jīng)科雜志，1996,29(3):156-159.

[20]Zhang L,Qian W,Chen Q，et al.Imbalance in circulating T lymphocyte subsets contributes to Hu antibodi-associated paraneoplastic neurological syndromes[J].Cellular Immunology,2014,290(2):245-250.

[21]Yin L,Qu HD,Chen QM.Proliferative response of peripheral blood mononuclear cells in anti-Hu antibody-associated patients with paraneoplastic neurological syndrome and their depressant effect on small cell lung cancer cells[J].Mol Med Red,2015,11(3):1595-1600.

[作者單位] 蚌埠醫(yī)學院第一附屬醫(yī)院 神經(jīng)內(nèi)科,安徽 蚌埠 233004

·述評·

收稿日期：(2015-11-26)

DOI：10.14126/j.cnki.1008-7044.2016.01.001

[作者簡介]陳齊鳴(1956-)，男，教授/主任醫(yī)師，研究生。