杜毅超,吳健敏,劉金鳳

(1.廣西大學(xué)動物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，廣西南寧 530004; 2.廣西獸醫(yī)研究所動物疫病病原學(xué)與診斷重點(diǎn)實(shí)驗室，廣西南寧 530001)

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文獻(xiàn)綜述

豬細(xì)小病毒病毒樣顆粒研究進(jìn)展

杜毅超1,2,吳健敏2*,劉金鳳2

(1.廣西大學(xué)動物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，廣西南寧 530004; 2.廣西獸醫(yī)研究所動物疫病病原學(xué)與診斷重點(diǎn)實(shí)驗室，廣西南寧 530001)

摘要：豬細(xì)小病毒(PPV)是引起母豬繁殖障礙和仔豬死亡的主要病原，疫苗免疫預(yù)防是控制該病的主要手段。由于對生物安全的擔(dān)心，目前國內(nèi)使用的疫苗仍以滅活苗為主。病毒樣顆粒(VLPs)疫苗以其安全性高、免疫原性好成為各類病毒疫苗研究的熱門方向。豬細(xì)小病毒病毒樣顆粒(PPV-VLPs)是不含PPV DNA的空衣殼結(jié)構(gòu)，由PPV VP2結(jié)構(gòu)蛋白體外自行組裝形成，形態(tài)上與天然病毒粒子相似，具有很強(qiáng)的免疫原性和生物學(xué)活性。論文就VLPs疫苗的免疫機(jī)制及PPV-VLPs的組裝及其在國內(nèi)外的研究進(jìn)行綜述，為PPV- VLPs研究提供參考。

關(guān)鍵詞：豬細(xì)小病毒；VP2；病毒樣顆粒

豬細(xì)小病毒(Porcine parvovirus，PPV)是一種高度穩(wěn)定且持久感染的自主型病毒[1]。能引起懷孕母豬的繁殖性障礙，典型臨床癥狀是胚胎和胎兒感染死亡，懷孕母豬流產(chǎn)、產(chǎn)死胎及木乃伊胎等，還引起仔豬皮炎、腹瀉、非化膿性心肌炎和呼吸系統(tǒng)疾病[2-3]。PPV為細(xì)小病毒科(Parvoviridae)細(xì)小病毒屬(Parvovirus)的單鏈DNA病毒，根據(jù)其遺傳學(xué)特征可分為6型，即PPV-1、PPV-2、PPV-3、PPV-4、PPV-5[4-5]和PPV-6[6]。疫苗免疫仍是目前預(yù)防和控制PPV的重要措施，但現(xiàn)有疫苗不僅存在過敏反應(yīng)、毒力返祖、細(xì)胞及體液免疫能力低下等缺陷，還存在病毒體外增殖困難、生產(chǎn)成本高及病毒擴(kuò)散等問題。在PPV基因工程亞單位疫苗的開發(fā)方面，由于蛋白折疊錯誤及表達(dá)系統(tǒng)的低效，使得基于重組蛋白的亞單位疫苗的免疫原性往往很低，因此利用新技術(shù)開發(fā)安全、高效的新一代疫苗是當(dāng)前亟待解決的問題[6]。

病毒樣顆粒(VLPs)疫苗是基因工程亞單位疫苗研究的新方向，VLPs是由一種或多種病毒衣殼蛋白自行裝配而成的空殼顆粒，不含病毒核酸，不能復(fù)制，沒有感染性，形態(tài)結(jié)構(gòu)上與天然病毒粒子相同或相似，即使沒有佐劑也可刺激機(jī)體產(chǎn)生強(qiáng)烈的體液和細(xì)胞免疫[7]。迄今為止，VLPs可以在許多不同的表達(dá)系統(tǒng)(大腸埃希菌、酵母、植物細(xì)胞、哺乳動物細(xì)胞和昆蟲細(xì)胞)有效表達(dá)并自行裝配，已報道的VLPs有100多種以上[8]。VLPs疫苗以其安全性高、免疫原性強(qiáng)的優(yōu)勢展現(xiàn)出廣闊的應(yīng)用前景。

1　VLPs及其免疫機(jī)制

VLPs是由病毒的單個或多個核衣殼蛋白自行裝配形成的規(guī)則超分子結(jié)構(gòu)，有的含包膜，通常為二十面體或棒狀結(jié)構(gòu)，直徑25 nm～100 nm[9-10]。VLPs的免疫原性和抗原性與病毒的核衣殼蛋白和包膜的結(jié)構(gòu)特征有關(guān)。VLPs的空間結(jié)構(gòu)能夠允許其重復(fù)且高密度的展示病毒特有的病原相關(guān)分子模式(PAMPs)，PAMPs可以激活固有免疫反應(yīng)，被Toll樣受體(TLRs)及宿主細(xì)胞中其他模式識別受體(PRRs)識別，通過刺激抗原遞呈細(xì)胞(APCs)包括巨噬細(xì)胞、樹突狀細(xì)胞(DCs)等進(jìn)行抗原攝取，經(jīng)加工后遞呈給MHCⅡ類分子，促進(jìn)DCs的成熟與遷移，誘導(dǎo)產(chǎn)生刺激分子，從而激活一系列的免疫應(yīng)答[11]。一些外源性VLPs仍保留與天然病毒相似受體結(jié)合區(qū)域，可以被當(dāng)做內(nèi)源性抗原以交叉遞呈的方式通過MHCⅠ類途徑進(jìn)行遞呈,從而活化CD8+T細(xì)胞，實(shí)現(xiàn)CD8+T細(xì)胞介導(dǎo)的保護(hù)性免疫反應(yīng),這對于清除細(xì)胞內(nèi)的病原體至關(guān)重要。APCs呈遞抗原與抗原的大小、形狀、表面電荷等有關(guān)，主要取決于抗原的大小。VLPs的形態(tài)大小也使其更適合被DCs捕獲，定位于DCs的晚期內(nèi)吞體[12-13]。

VLPs展示的多個B細(xì)胞和T細(xì)胞抗原表位，可通過MHCⅠ、MHCⅡ類途徑進(jìn)行抗原提呈，并且自身具有佐劑分子效應(yīng)[12,14-16]，亦有些免疫原性較差的VLPs需要高效佐劑以增強(qiáng)免疫應(yīng)答[17]。此外，VLPs可交聯(lián)B細(xì)胞膜表面免疫球蛋白誘導(dǎo)強(qiáng)烈的B細(xì)胞反應(yīng)，還可有效刺激CD4+T細(xì)胞的增殖和細(xì)胞毒性T細(xì)胞(CTL)反應(yīng)[18]。在某些情況下，VLPs可以直接激活B細(xì)胞受體和刺激T細(xì)胞非依賴性IgM反應(yīng)[19]。因此，低劑量的VLPs可以激活動物免疫系統(tǒng)的多種保護(hù)性反應(yīng)，可大大的降低獸用疫苗的成本。

在安全方面，VLPs由于缺少病毒核酸，從而消除了病毒在復(fù)制、嵌合、返祖、重組和重配過程中的風(fēng)險。利用不同表達(dá)系統(tǒng)制備VLPs也不會造成致病性病毒的傳播，生產(chǎn)的疫苗也不存在毒力返祖、產(chǎn)生免疫缺陷的風(fēng)險。

VLPs除了可以直接作為相應(yīng)病毒的疫苗之外，還可以作為一種抗原遞呈載體。通過基因工程技術(shù)將不同種(型)病毒蛋白基因插入或融合在一起形成嵌合病毒樣粒子(cVLPs)。單個VLPs上嵌合多個免疫原性較低的可溶性抗原可以有效提高可溶性抗原的免疫原性。此外，還可以分別表達(dá)包括非蛋白類抗原在內(nèi)的外源抗原和VLPs，再通過化學(xué)方法以共價或非共價的方式將其偶聯(lián)至VLPs表面，也可在VLPs表面設(shè)計外源抗原的結(jié)合位點(diǎn)[20-21]。能結(jié)合到VLPs表面的抗原有短肽、環(huán)肽、全長蛋白等蛋白抗原以及多糖、半抗原等非蛋白抗原[22]。VLPs還可以作為一種有效的藥物傳遞系統(tǒng)，將抗癌藥物阿霉素(DOX)共價結(jié)合到輪狀病毒VLPs表面，再連接上包含半乳糖的細(xì)胞靶向配體，可以被體內(nèi)不同的細(xì)胞吸收。Zhao Q等[23]證明與VLPs結(jié)合的DOX與單一DOX相比，可以提高藥物代謝動力學(xué)，還可以降低藥物對細(xì)胞的毒性。在治療慢性疾病如關(guān)節(jié)炎、阿爾茨海默病中治療性VLPs疫苗展示出廣闊的發(fā)展前景[24]。

2　PPV VLPs的研究現(xiàn)況

PPV是單股負(fù)鏈DNA病毒，無囊膜，病毒粒子大小22 nm～25 nm，由60個衣殼蛋白亞基組成，結(jié)構(gòu)呈二十面體等軸對稱[25]。PPV基因組大小約5.0 kb，末端約有120 bp～200 bp的回文結(jié)構(gòu)(形狀類似“Y”或“T”形)。研究表明，PPV基因組極為簡潔，擁有2個啟動子，通過可變剪接可高效表達(dá)7種蛋白，P4啟動子控制非結(jié)構(gòu)蛋白NS1、NS2及NS3的合成；P40啟動子控制結(jié)構(gòu)蛋白VP1和VP2的合成，VP2蛋白N端有9個連續(xù)甘氨酸富集區(qū)，是VP3蛋白的切割位點(diǎn)，VP3蛋白由VP2蛋白水解后而得；此外，VP2 mRNA還可表達(dá)一個非結(jié)構(gòu)蛋白SAT[26-27]。VP2蛋白為衣殼蛋白主要成分，約占衣殼蛋白的90%，VP2蛋白有9個線性的B細(xì)胞抗原表位，能誘發(fā)抗PPV的特異中和抗體的抗原表位都位于N端。VP2基因易發(fā)生突變，一些關(guān)鍵位點(diǎn)(如第378、383、436和565位)的突變，對PPV是積極的選擇，更利于PPV的存活[28]。

PPV VP2基因決定病毒的血凝活性、宿主范圍和種屬進(jìn)化關(guān)系，不同毒株之間的差異均位于VP2基因；VP2蛋白對病毒的感染有極其重要的作用，用VP2的抗體封閉PPV易感宿主細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)病毒喪失了對易感細(xì)胞的感染性。PPV衣殼蛋白亞基含有8個β轉(zhuǎn)角、1個α螺旋和4個氨基酸loop區(qū)域(loop1:86-101 aa、loop2:212-245 aa、loop3:273-333 aa、loop4:413-424 aa)，loop區(qū)域是抗原位點(diǎn)所在區(qū)域[27]。這些抗原位點(diǎn)可以誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生中和抗體，保護(hù)機(jī)體免受病毒的攻擊。Pan[29]等分別構(gòu)建重組腺病毒(recombinant adenovirus，RAV)VP2 loop缺失突變株rAd-VP2 Δloop2、rAd-VP2 Δloop4、rAd-VP2 Δloop2-loop4，轉(zhuǎn)染HEK-293細(xì)胞表達(dá)，結(jié)果loop4、loop2-loop4缺失突變株均很難表達(dá)出完整的PPV VLPs，而loop2缺失突變株則能裝配出大量規(guī)則的PPV VLPs。

2.1PPV VLPs

Rymerson R T等[30]將PPV VP2基因插入植物雙元表達(dá)載體，在轉(zhuǎn)基因煙草中進(jìn)行表達(dá)。結(jié)果從煙葉組織中提取到能自行組裝成VLPs的VP2可融性蛋白，皮下免疫接種小鼠，小鼠產(chǎn)生中和抗體并得到保護(hù)，中和抗體滴度達(dá)1∶2 700以上。表明植物表達(dá)系統(tǒng)可以制備VLPs疫苗。

Tamosiunas R P等[31]利用釀酒酵母表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)PPV VP2蛋白，制備了9種抗VP2蛋白的單克隆抗體(MAb)，經(jīng)間接ELISA檢測，MAb的敏感性和特異性分別為93.4%和97.4%，釀酒酵母表達(dá)系統(tǒng)在制備診斷用PPV VLPs展示了令人鼓舞的應(yīng)用前景。Guo C等[32]篩選畢赤酵母蛋白酶缺陷株表達(dá)VP2蛋白，通過優(yōu)化表達(dá)時間，獲得595.76 mg/L的高水平表達(dá)。

桿狀病毒-昆蟲細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)是最常用的表達(dá)體系。早在1992年，Martinez C等[33]將PPV VP2基因克隆到桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)中，并在昆蟲細(xì)胞中高效表達(dá)，表達(dá)的VP2 蛋白能自行裝配成VLPs，用3 μg的重組抗原配1.5 μg的佐劑制成疫苗，免疫母豬能誘導(dǎo)產(chǎn)生強(qiáng)烈的免疫應(yīng)答。Antonis A F G等[6]用昆蟲/桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)大規(guī)模制備PPV-VLPs，測試其免疫原性及保護(hù)效果，結(jié)果不足微克的VLPs制成油包水油乳劑苗免疫豚鼠后，誘發(fā)高水平的抗體滴度；0.7 μg的VLPs單次免疫仔豬能完全抵抗PPV強(qiáng)毒株的攻擊。利用His標(biāo)簽可以高效純化蛋白，Zhou H等[34]將帶有His標(biāo)簽的VP2基因嵌入pFastbac1載體構(gòu)建重組質(zhì)粒pFastPVP2和重組桿粒B-pFastPVP2并分別轉(zhuǎn)入大腸埃希菌和sf9昆蟲細(xì)胞中表達(dá)，經(jīng)Ni-NTA親和層析純化蛋白，電鏡觀察到直徑20 nm～30 nm球形粒子，血凝試驗可知重組VP2蛋白的血凝滴度達(dá)到1∶8 192，且昆蟲細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)的VP2蛋白可以用于建立ELISA，而大腸埃希菌表達(dá)系統(tǒng)則不能。

2.2嵌合多表位PPV VLPs

PPV VLPs可以與外源抗原嵌合，為開發(fā)預(yù)防和控制豬病的多聯(lián)苗提供了可能。Hong H等[35]將PPV VP2基因和口蹄疫病毒(FMDV)衣殼蛋白前體P1-2A基因融合后和偽狂犬病病毒(PRV) TK-/gE-/LacZ+基因缺失疫苗株的基因組共轉(zhuǎn)染PK-15細(xì)胞，獲得了重組病毒PRV TK-/gE-/P1-2A-VP2，以106TCID50的重組病毒免疫小鼠后，用107TCID50PRV Ea株攻毒，結(jié)果小鼠獲得完全保護(hù)。Pan Q等[36]將豬圓環(huán)病毒2型(PCV2) 編碼Cap蛋白抗原表位165-200 aa的基因嵌合到PPV VP2基因5′端，通過HEK-293細(xì)胞組裝成VLPs，VLPs形態(tài)大小和血凝性都與PPV全病毒粒子相似，PPV VP2 N端缺失并不影響VLPs的組裝，這種嵌合型VLPs為研究能同時預(yù)防PCV和PPV的疫苗提供了可能。Xu Z W等[37]將PCV2 ORF2(700 bp)插入到PPV VP2基因3′端1 215 bp～1 216 bp處，并轉(zhuǎn)染到COS-7細(xì)胞，分析表達(dá)產(chǎn)物沒有發(fā)現(xiàn)VLPs，通過對PPV衣殼蛋白三維結(jié)構(gòu)分析發(fā)現(xiàn)，在PPV VP2基因3′端插入外源基因，可能會影響VLPs的形成，但也不排除由插入片段過大造成。Chen Y等[38]成功構(gòu)建含有PPV VP2基因和增強(qiáng)型綠色熒光蛋白(EGFP)基因以及PRV TK-/gE-/gI-/LacZ+基因直徑約為150 nm的重組偽狂犬病病毒(PRV SA215/VP2)粒子和30 nm～40 nm的PPV空衣殼；仔豬免疫保護(hù)試驗表明5×105TCID50的重組病毒免疫仔豬，能誘導(dǎo)仔豬和分娩母豬產(chǎn)生對PPV和PRV的特異性體液免疫應(yīng)答，并能完全抵御PPV和PRV Fa強(qiáng)毒株的攻擊。Rodriguez[39]等將帶有CD8+T細(xì)胞表位(SYVPSAEQI)的瘧原蟲環(huán)子孢子蛋白(CSP)基因與PPV VP2基因融合轉(zhuǎn)染sf9細(xì)胞獲得的重組PPV VLPs提高了免疫原性，能夠誘導(dǎo)特定的CD8+T細(xì)胞反應(yīng)，2 d內(nèi)就能使寄生在肝中的瘧原蟲環(huán)子孢子減少95%。蔣春英等[40]將日本腦炎病毒((JEV) E蛋白中編碼的B細(xì)胞表位及T細(xì)胞表位序列，連接到PPV VP2基因的5′端，轉(zhuǎn)化大腸埃希菌BL21(DE3)后，成功表達(dá)了重組蛋白，Western blot分析表明，表達(dá)產(chǎn)物能分別被抗JEV多克隆抗體和抗PPV多克隆抗體識別，電鏡觀察顯示，N端連接JEV多表位肽的PPV VP2蛋白能夠在體外組裝成有活性的VLPs。潘群興等[41]將具有空間構(gòu)象的O型FMDV VP1多表位基因 (VP1：21-40、141-160、200-213殘基)插入并替換PPV VP2蛋白表面不同Loop區(qū)的部分基因序列，并在VP2蛋白N端引入通用型輔助性T淋巴細(xì)胞表位(PADRE)，人工合成嵌合基因并克隆到桿狀病毒轉(zhuǎn)移載體pFastBac HAT中，轉(zhuǎn)化到大腸埃希菌DH10Bac 感受態(tài)細(xì)胞，獲得重組桿狀病毒質(zhì)粒并轉(zhuǎn)染sf9細(xì)胞后，電鏡觀察到重組蛋白能自行組裝成VLPs，紅細(xì)胞凝集試驗證實(shí)具有與全病毒類似的血凝活性；此后，Pan Q等[42]將嵌合基因重組到腺病毒載體上并在HEK-293細(xì)胞中表達(dá)，在不影響VLPs組裝的情況下，PPV VP2蛋白的loop區(qū)可以嵌入57個氨基酸，分別用5×105TCID50的重組腺病毒和100 μg豬O型口蹄疫合成肽疫苗免疫豬，重組腺病毒刺激豬產(chǎn)生的抗O型FMDV抗體水平更高，引起的T淋巴細(xì)胞增殖更顯著，并能對豬產(chǎn)生完全的免疫保護(hù)。

3　展望

PPV VLPs能夠很好地模擬天然PPV粒子的結(jié)構(gòu)，具有與天然PPV相同的血凝活性和免疫原性。PPV VLPs還允許外源抗原基因的插入或融合，形成在表面展示外源表位的嵌合VLPs，可以實(shí)現(xiàn)多價或多種病毒抗原的同步免疫。VLPs還可以作為一種新型的亞單位疫苗，具有很好的構(gòu)象，易被機(jī)體免疫系統(tǒng)識別，而且感染性遺傳物質(zhì)的缺失使其安全性更高。因此，基于VLPs的疫苗研究具有廣闊的前景。但PPV VLPs疫苗的生產(chǎn)也存在一些技術(shù)難題，如常用的幾種表達(dá)系統(tǒng)形成VLPs的效率較低，形成VLPs的各個基因表達(dá)量不易控制，大規(guī)模制備過程復(fù)雜。相信在不久的將來，隨著分子生物學(xué)、系統(tǒng)生物學(xué)、基因工程和相關(guān)純化技術(shù)的進(jìn)步，相關(guān)的技術(shù)難題將被克服。

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收稿日期：2016-01-22

基金項目：廣西科技合作與交流計劃項目(桂科合14125008-2-6)；廣西自然基金項目(2014GXNSFAA118120)；廣西重點(diǎn)實(shí)驗室建設(shè)項目(14-045-31-A-5)

作者簡介：杜毅超(1991-)，男，甘肅靈臺人，碩士研究生，主要從事動物傳染病與分子免疫學(xué)研究。*通訊作者

中圖分類號:S852.659.2

文獻(xiàn)標(biāo)識碼:A

文章編號:1007-5038(2016)07-0071-05

Progress on Porcine Parvovirus Virus-like Particles

DU Yi-chao1,2,WU Jian-min2,LIU Jin-feng2

(1.CollegeofAnimalScienceandTechnology,GuangxiUniversity,Nanning,Guangxi,530004,China;2.GuangxiKeyLaboratoryofAnimalEpidemicEtiologyandDiagnosis,GuangxiVeterinaryResearchInstitute,Nanning,Guangxi,530001,China)

Abstract:Porcine parvovirus(PPV) is a main pathogen that causes serious reproductive disease of swine and death of piglets,and vaccination is one of the major measures.Due to bio-safety concern,the inactivated vaccine was mainly used at home.Virus-like particles(VLPs) has the advantages of higher security and immunogenicity,it has become one of the hottest direction of virus vaccine research.Porcine parvovirus virus-like particles(PPV-VLPs) are empty capsid particles without PPV DNA,which are self-assembled by VP2 structural protein and are analogous to natural virus particles in morphology,and it has very strong bioactivity and immunogenicity.To provide the reference for the research of PPV-VLPs,this article reviewed immune mechanism of VLP-based vaccines and self-assembling of PPV-VLPs in the domestic and overseas.

Key words:Porcine parvovirus;VP2;virus-like particle