鄒　瀟，　聶淑科，　譚　旸，　張允建△

1武漢大學醫(yī)院本部內(nèi)科，武漢　430072

2華中科技大學同濟醫(yī)學院附屬協(xié)和醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，武漢　430022

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群居相互接觸對小鼠腦梗死康復訓練效果及預后的影響

鄒瀟1，聶淑科2，譚旸2，張允建2△

1武漢大學醫(yī)院本部內(nèi)科，武漢430072

2華中科技大學同濟醫(yī)學院附屬協(xié)和醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，武漢430022

摘要：目的探討群居相互接觸對腦梗死小鼠康復訓練效果的影響及可能機制。方法2月齡雄性C57BL/6小鼠96只，隨機分為4組，假手術(shù)隔離飼養(yǎng)組16只，假手術(shù)配對飼養(yǎng)組16只，大腦中動脈缺血(MCAO)隔離飼養(yǎng)組32只，MCAO配對飼養(yǎng)組32只。假手術(shù)組小鼠行假手術(shù)，模型組小鼠行MCAO手術(shù)，術(shù)后根據(jù)分組分別行單只隔離和配對飼養(yǎng)。各組小鼠均于術(shù)后進行康復訓練：每天進行1 h轉(zhuǎn)棒、平衡木及網(wǎng)屏訓練。康復訓練后第1、3、7、14天行動物行為學評分，測量血清C-反應蛋白(CRP)濃度；第14天處死小鼠，2，3，5-氯化三苯基四氮唑(TTC)染色法測腦梗死體積。結(jié)果在康復訓練第7及14天，MCAO配對飼養(yǎng)組小鼠的行為學評分和血清CRP水平均低于MCAO隔離飼養(yǎng)組小鼠(均P<0.05)，且假手術(shù)配對飼養(yǎng)組血清CRP水平低于假手術(shù)隔離飼養(yǎng)組；第14天時，MCAO配對飼養(yǎng)組和MCAO隔離飼養(yǎng)組小鼠腦梗死體積差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。結(jié)論群居相互接觸有助于增加康復訓練效果，降低血清CRP水平，對腦梗死體積無影響。

關(guān)鍵詞：群居相互接觸；腦梗死；康復訓練；C-反應蛋白

對缺血性腦血管病患者在發(fā)病早期進行及時有效的康復訓練，可以促進腦梗死后患者神經(jīng)功能恢復，明顯減少繼發(fā)性殘疾，提高生活質(zhì)量[1]。卒中后，與外界溝通和接觸較多患者的預后往往好于那些與社會脫離的孤獨患者[2-3]。卒中后患者往往伴有不同程度的抑郁情緒，與周圍環(huán)境交流減少，對卒中的預后產(chǎn)生負面影響[4]。C-反應蛋白(C-reactive protein，CRP)在正常人體血清中含量少，但在嚴重感染、損傷和壞死等情況下其水平可顯著升高，有研究發(fā)現(xiàn)CRP與腦梗死關(guān)系密切[5]。近來研究表明，焦慮抑制狀態(tài)與社會活動、免疫因素(如CRP)有著密切的關(guān)系[6]。本研究著重觀察群居接觸(social interaction)對腦缺血小鼠模型康復效果及預后的作用，同時觀察其對血清CRP水平的影響。

1材料和方法

1.1試劑與儀器

小鼠超敏C反應蛋白(high-sensitivity C-reactive protein，hs-CRP)ELISA試劑盒購自中美科技有限公司，2，3，5-氯化三苯基四氮唑(triphenyltetrazolium chloride，TTC)購自美國Sigma公司，其他化學試劑均為國產(chǎn)分析純試劑。

1.2實驗動物及分組

2月齡C57BL/6雄性小鼠96只，體質(zhì)量約20 g，由華中科技大學同濟醫(yī)學院實驗動物學部提供。將實驗小鼠隨機分為4組，假手術(shù)隔離飼養(yǎng)組16只，假手術(shù)配對飼養(yǎng)組16只，大腦中動脈缺血(middle cerebral artery occlusion，MCAO)隔離飼養(yǎng)組32只，MCAO配對飼養(yǎng)組32只。各組小鼠行MCAO手術(shù)或假手術(shù)，術(shù)后動物分為單只隔離飼養(yǎng)和配對飼養(yǎng)。配對飼養(yǎng)為2只雄性小鼠一籠。

1.3MCAO模型的制備

MCAO模型制備參照Hata等[7]的方法改良，缺血1 h后將線栓取出。假手術(shù)組采用同樣的手術(shù)操作但不插入線栓。

1.4術(shù)后康復訓練及指標檢測

所有小鼠均于術(shù)后即開始進行康復訓練。分別進行平衡木行走、轉(zhuǎn)棒轉(zhuǎn)動訓練及網(wǎng)屏抓握訓練，每項20 min，共1 h。于康復訓練后1、3、7、14 d，MCAO各組分別取8只小鼠，假手術(shù)組分別取4只小鼠，進行行為學評分。行為學測試完畢，處死小鼠，留取全血，4 000 r/min離心5 min，取上清-80℃保存，測CRP濃度。

1.5康復訓練方法

①平衡木訓練，讓鼠在1個方木棒上行走，主要評估及訓練平衡功能。②轉(zhuǎn)棒訓練，是將鼠放在1根分別向順、逆時針交替轉(zhuǎn)動的木棒上行走，評估及訓練動態(tài)平衡功能。③網(wǎng)屏訓練，是先將網(wǎng)屏水平放置，將鼠放在其上，然后緩緩地將其一端抬高，在2 s內(nèi)將此屏變成垂直位，保持5 s，觀察鼠是否會從網(wǎng)屏上掉下來或用前爪握住網(wǎng)屏，用于評價前爪抓握能力及肌力情況。

1.6行為學評分

①平衡木行走評分：能跳上橫木，在上面行走不會跌倒為0分；能跳上橫木，在上面行走跌倒的機會小于50%為1分；能跳上橫木，在上面行走跌倒的機會大于50%為2分；在健側(cè)后肢幫助下能跳上橫木，但受累的癱側(cè)后肢不能幫助向前移動為3分；在平衡木上不能行走，但可坐在上面為4分；將鼠放在平衡木上會掉下來為5分。

②轉(zhuǎn)棒行走評分：棒轉(zhuǎn)動過程中鼠可在轉(zhuǎn)棒上行走為0分；轉(zhuǎn)動過程中鼠不會掉下且持續(xù)時間達60 s以上為1分；轉(zhuǎn)動開始后，鼠從棒上掉下來為2分；轉(zhuǎn)動開始前鼠就從棒上掉下來為3分。

③網(wǎng)屏試驗評分：鼠前爪抓住網(wǎng)屏達5 s，且不滑落為0分；鼠暫時握住網(wǎng)屏，滑落一段距離，但未掉下來為1分；鼠在5 s內(nèi)掉下來為2分；網(wǎng)屏轉(zhuǎn)動開始時鼠即掉下來為3分。

取每組每只小鼠各項評分之和的平均值，作為其綜合評分。

1.7血清CRP濃度

ELISA法檢測，具體方法按說明書進行。

1.8腦梗死體積測定

術(shù)后第14天，處死動物，快速取小鼠全腦，去掉嗅球、小腦和低位腦干，行冠狀大腦切片，每片厚1 mm，迅速置1% TTC中，避光，37 ℃溫孵20 min，其間每隔7～8 min翻動1次，染色后以4%多聚甲醛固定。拍照后使用Image Pro Plus軟件分析計算腦梗死體積。

1.9數(shù)據(jù)分析及統(tǒng)計學處理

2結(jié)果

2.1各組小鼠術(shù)后不同時間點行為學評分比較

隨著時間推移，各組小鼠行為學評分呈下降趨勢。MCAO配對飼養(yǎng)組于術(shù)后康復7 d、14 d行為學評分明顯低于MCAO隔離飼養(yǎng)組，差異具有統(tǒng)計學意義(均P<0.05)(表1)。

2.2各組不同時間點血清CRP濃度比較

MCAO組小鼠在腦缺血康復后1 d，血清CRP濃度即開始增高，明顯高于假手術(shù)組。缺血康復后3 d，CRP濃度進一步增高，7 d時達高峰，14 d時逐漸降低。MCAO配對飼養(yǎng)組于術(shù)后康復7 d、14 d血清CRP濃度明顯低于MCAO隔離飼養(yǎng)組，差異具有統(tǒng)計學意義(均P<0.05)。假手術(shù)配對飼養(yǎng)組小鼠隨時間推移，血清CRP濃度無明顯變化；假手術(shù)隔離飼養(yǎng)組小鼠隨時間推移，血清CRP濃度逐漸升高，14 d時達高峰，7、14 d時明顯高于假手術(shù)配對飼養(yǎng)組小鼠，差異具有統(tǒng)計學意義(均P<0.05)，見表2。

表1　各組小鼠術(shù)后不同時間點行為學評分比較±s)

與MCAO隔離飼養(yǎng)組比較，*P<0.05；與假手術(shù)隔離飼養(yǎng)組比較，#P<0.05

表2　各組在不同時間點血清CRP濃度比較

與MCAO隔離飼養(yǎng)組比較，*P<0.05；與假手術(shù)隔離飼養(yǎng)組比較，#P<0.05

2.3TTC染色測定腦梗死體積

正常腦組織經(jīng)TTC染色呈紅色，梗死組織呈白色。缺血康復后14 d，假手術(shù)隔離飼養(yǎng)組和假手術(shù)配對飼養(yǎng)組小鼠腦組織經(jīng)TTC染色后均未見有白色梗死灶，見圖1A、B；MCAO隔離飼養(yǎng)組和配對飼養(yǎng)組缺血小鼠均可見右側(cè)腦組織白色梗死區(qū)域；其中隔離飼養(yǎng)組的腦梗死相對體積比為(18.36±3.65)%，配對飼養(yǎng)組為(15.00±4.46)%，兩組小鼠腦梗死相對體積比差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，見圖1C、D。

A：假手術(shù)隔離飼養(yǎng)組；B：假手術(shù)配對飼養(yǎng)組；C：MCAO隔離飼養(yǎng)組；D：MCAO配對飼養(yǎng)組圖1　各組小鼠腦組織TTC染色結(jié)果Fig.1 TTC staining of brain tissues of mice in each group

3討論

卒中后早期康復訓練是促進神經(jīng)功能恢復，改善患者預后的重要手段[8]?？祻陀柧毜男Ч芎芏嘁蛩赜绊?，患者與周圍環(huán)境事物的溝通及社會化程度，與康復訓練效果關(guān)系密切。與社會脫離，孤獨，抑郁情緒往往會嚴重影響康復訓練效果及卒中預后[9]。2種飼養(yǎng)方式(單只隔離飼養(yǎng)或者配對飼養(yǎng))的小鼠均于腦缺血術(shù)后即開始系統(tǒng)康復訓練，于第1、3、7、14天，通過行為學評分來判斷康復訓練效果。系統(tǒng)康復訓練，可明顯降低小鼠行為學評分；配對飼養(yǎng)組小鼠康復效果明顯好于單只隔離飼養(yǎng)組小鼠，在術(shù)后康復7 d，14 d行為學評分明顯低于單只隔離飼養(yǎng)組，差異具有統(tǒng)計學意義(均P<0.05)。結(jié)果提示，增加與環(huán)境和外界的溝通，可明顯改善康復效果。

兩組小鼠在缺血前飼養(yǎng)狀態(tài)相同，缺血后才分別給予不同的飼養(yǎng)方式。因此，群居相互接觸(Social interaction)可能更多的在缺血病灶的二次擴散階段發(fā)揮作用。術(shù)后14 d檢測腦梗死體積，配對飼養(yǎng)組小鼠腦梗死體積略小于單只隔離飼養(yǎng)組，但兩組間差異沒有統(tǒng)計學意義。群居相互接觸對腦梗死體積的影響及機制需要進一步的實驗研究。

C-反應蛋白是一種機體組織損傷或炎癥的時相蛋白，其水平在一定程度上反映與缺血性腦卒中病理相關(guān)的炎性反應程度，較強的炎性反應可以加速梗死區(qū)半暗帶的惡化，加重腦損傷，CRP水平和腦梗死的嚴重程度有一定相關(guān)[10]。近來研究還發(fā)現(xiàn)，抑郁癥患者血清中CRP含量增高，提示CRP與抑郁癥存在聯(lián)系[11]。小鼠腦缺血后，CRP水平在急性期內(nèi)升高明顯，術(shù)后7 d達頂峰，14 d逐漸下降。配對飼養(yǎng)可明顯降低缺血后小鼠血清中CRP含量，且術(shù)后7 d和14 d時與單只隔離飼養(yǎng)小鼠差異明顯(P<0.05)。在假手術(shù)組，可見隨著隔離飼養(yǎng)時間的增加，小鼠血清中CRP水平逐漸增高，14 d時與配對飼養(yǎng)組差異明顯(P<0.05)。在健康人群中，同樣觀察到，減少社會交流會導致血清CRP含量增高[12]。目前研究結(jié)果提示，群居相互接觸減少，會引起血清CRP含量增高，而增高的CRP會加重缺血后神經(jīng)功能損傷[13]。

綜上所述，群居相互接觸可有效增加腦缺血康復訓練效果，對神經(jīng)功能損傷有一定減輕作用，CRP可能在其中扮演了重要的角色，其具體機制還有待進一步研究。

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(2015-10-24收稿)

Effects of Social Interaction on Rehabilitation Training Outcomes and Prognosis of Mice with Ischemic Infarction

Zou Xiao1，Nie Shuke2，Tan Yang2etal

1DepartmentofInternalMedicine，HospitalofWuhanUniversity，Wuhan430072，China2DepartmentofNeurology，UnionHospital，TongjiMedicalCollege，HuazhongUniversityofScienceandTechnology，Wuhan430022，China

AbstractObjectiveTo explore the effects of social interaction on rehabilitation training outcomes of mice with ischemic infarction and the possible mechanism.MethodsNinety-six male C57BL/6 mice of two months old were randomly divided into four groups：sham operation group with isolated breeding(n=16)，sham operation group with paired breeding(n=16)，middle cerebral artery occlusion(MCAO)group with isolated breeding(n=32)，MCAO with paired breeding(n=32).After the operation，the mice were isolated in individual cages or paired with an animal in different groups.All the mice were given 1-h balancing，grasping，rotating and walking exercises every day.Behavioral assessments were made and the C-reactive protein(CRP)concentrations in blood serum were detected at 1，3，7，and 14 days after rehabilitation training.At 14 days，the animals were sacrificed and the infarct size determined by TTC staining.ResultsThe behavior score and serum CRP level were much lower in MCAO group with paired breeding than in MCAO group with isolated breeding at 7 and 14 days after rehabilitation training(bothP<0.05).The CRP level was also significantly decreased in sham operation group with paired breeding than that in sham operation group with isolated breeding(P<0.05).There was no significant difference in the infarct size of mice between the paired mice with MCAO and isolated MCAO mice at 14days(P>0.05).ConclusionSocial interaction significantly improves the outcomes of rehabilitation training and reduces the serum CRP concentration in mice with ischemic infarction，but has no significant effects on the infarct size.

Key wordssocial interaction；cerebral ischemia；rehabilitation；C-reactive protein

中圖分類號：R743.33

DOI：10.3870/j.issn.1672-0741.2016.01.015

通訊作者△，Corresponding author，E-mail：zhangyunjian66@126.com

鄒瀟，女，1980年生，主治醫(yī)師，E-mail：23928642@qq.com