胡元春 河南省新鄉(xiāng)市動物疫病預防控制中心 453000
豬圓環(huán)病毒地方株的分離與測定
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豬圓環(huán)病毒病 (PCVD)是由豬圓環(huán)病毒2型(PCV2)引起的豬傳染性疾病,該病的主要特征為患豬體質下降、消瘦、貧血、黃疸、生長發(fā)育不良、腹瀉、呼吸困難和母豬繁殖障礙。豬圓環(huán)病毒是目前發(fā)現的一種最小的哺乳動物病毒,包括兩個血清型,即PCV1和PCV2,其中PCV2有致病性。
現有6份臨床癥狀疑似PCVD的病毒料,需要分離病毒,建立PCR及ELISA方法進行檢測。
(1)試驗材料。試驗病料來自不同地區(qū)疑似被PCV2感染豬的肺、淋巴結和肝等器官的組織病料。試驗試劑及主要儀器有胰酶、D-hanks液PCR擴增儀、低溫高速離心機、臺式離心機、電泳儀和凝膠成像系統(tǒng)。
(2)試驗方法。細胞培養(yǎng)于37℃、5%CO2的環(huán)境中。細胞生長液為含8%血清的DMEM培養(yǎng)液,維持液為含4%的DMEM培養(yǎng)液。2天傳代1次。將病料組織剪碎,用Hanks液研磨并制成5~10倍乳懸液反復凍融,離心 0.22μm微孔過濾后-20℃保存。當細胞長滿50%~70%左右,將處理好的病毒上清液滴入細胞瓶內,在37℃、5%CO2培養(yǎng)半小時,倒掉病毒液,然后加入4%DMEM維持液。當細胞長滿單層后,細胞傳代方法操作換8%DMEM維持液,盲傳3代,未出現細胞病變。含有病毒液的細胞瓶存放于-20℃冰柜中,凍融3次后,收取病毒液密封凍存于-20℃?zhèn)溆谩牟《疽荷锨逯刑崛NA,加入PCR反應體系中。體系為25μl。上游引物P1:5’-TTCGGTACCAGCTATGACGTATCCAAG-3’;下游引物P2:5’-GCCAAGCTTTCACTTCGTAATGGTTTT-3’;片段751bp。94℃ 3分鐘,94℃ 30秒,55℃ 30秒,72℃ 1分鐘,循環(huán)35次。72℃最后延伸10分鐘。
本實驗按照參考文獻的方法介紹,處理待測樣品。用酶標儀在450nm處測OD值。
樣品在1%瓊脂糖凝膠電泳后,得到750bp左右的特異性核苷酸片段,與實驗預期結果一致。實驗病毒料的OD值與陰性樣本的OD值之比為2∶7,實驗結果為陽性,與實驗預期結果一致。
仔豬斷奶后多系統(tǒng)衰竭綜合征(PMWS)和多種疫病都與PCV2相關聯(lián)?,F在主要應用PCR等分子生物學方法診斷PCV2,因此對不同地區(qū)來源的PCV2毒株基因組序列確定其基因序列變異程度,可以為建立有效的PCV研究方法提供依據。
PCV2單獨感染時的癥狀和病變并無特征性,必須借助實驗室手段才能進行確診。目前研究較多的實驗室檢測技術有間接免疫熒光(IFA)、間接酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)、免疫過氧化物酶單層細胞試驗(IPMA)、單克隆抗體以及多種聚合酶鏈式反應(PCR)技術等。與傳統(tǒng)方法相比,PCR具有較高的敏感性和特異性,而且操作簡便,是最常見的診斷方法。本實驗的檢測結果為陽性,初步鑒定該病毒為豬圓環(huán)病毒。但有關該病毒料的其他一些生物學特性尚待進一步鑒定。