李晶 劉玉蘭

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第細(xì)胞水平的肝臟纖維化力學(xué)研究

李晶 劉玉蘭

疾病情況下肝臟的物理特性與患者的照護(hù)和處置方式有著密切的聯(lián)系。通?？赏ㄟ^觸診來評價肝臟的硬度(肝臟纖維化程度的代表指標(biāo))，這也是我們教會醫(yī)學(xué)生評估肝臟情況體格檢查的重要一課。臨床實踐中有很多用于評估肝臟硬度的影像學(xué)手段，眾多研究也表明，肝臟的硬度和臨床表現(xiàn)有明確的相關(guān)性，肝臟越硬，肝臟發(fā)生硬化和肝細(xì)胞功能異常以及肝細(xì)胞癌的可能性就越大[1-2]。盡管在臨床上已經(jīng)有這樣的認(rèn)識，在基礎(chǔ)研究層面，肝臟硬度和其病理學(xué)之間的聯(lián)系尚無系統(tǒng)的探討?，F(xiàn)有研究發(fā)現(xiàn)，當(dāng)肝臟基質(zhì)增加時可以激活肝臟的星狀細(xì)胞(HSC)分化，但對于肝臟基質(zhì)硬度增加與肝細(xì)胞功能障礙之間的關(guān)系知之甚少。Desai等[3]的研究明確提示，基質(zhì)的硬度而非其濃度、結(jié)構(gòu)或成分造成肝細(xì)胞的去分化從而影響了其生理功能。更重要的是，這項研究同時也填補(bǔ)了目前關(guān)于肝臟硬度如何影響肝細(xì)胞功能這一知識領(lǐng)域的空白，即肝臟硬度的增加可以直接減少肝核因子4α(HNF4α)這一在肝臟細(xì)胞分化過程中至關(guān)重要的轉(zhuǎn)錄因子的表達(dá)。這項研究有著非常重要的臨床意義：即肝臟硬度的增加的過程中發(fā)生了肝細(xì)胞的去分化，這在一定程度上揭示了肝硬化時肝功能異常及腫瘤形成的潛在機(jī)制。此外，粘著斑激酶(FAK)和Rho/Rho激酶(ROCK)信號通路參與了此過程，提示針對FAK和ROCK的抑制劑有可能改善纖維化狀態(tài)的肝臟功能。

Desai等的研究也有助于我們理解肝臟的物理特性。通過影像學(xué)檢查以及針對移植物和體外動物肝臟的研究，總結(jié)了“大體”肝臟的物理特點——肝臟硬度是上述所有組織總和的硬度[4]，而Desai等在小鼠的肝臟中進(jìn)行了微米級別的精細(xì)研究。使用原子力顯微鏡(AFM)詳細(xì)描繪了正常和纖維化小鼠肝臟中央靜脈、匯管區(qū)、兩區(qū)之間水平和垂直的纖維間隔等的力學(xué)特點。這種研究手段既往已用于證實小鼠肺纖維化硬度大于正常肺，而且通常表現(xiàn)為局部硬度顯著增加。

Desai等發(fā)現(xiàn)，正常的肝臟在力學(xué)上呈現(xiàn)異質(zhì)性的特點，肝臟實質(zhì)異質(zhì)性與其解剖學(xué)的相關(guān)性目前尚不清楚，其力學(xué)特性在一定程度上反應(yīng)了肝細(xì)胞索、Disse間隙和單層內(nèi)皮細(xì)胞等存在硬度的差別。與預(yù)想一致的是，門脈區(qū)比中央靜脈區(qū)硬度高。這些硬度差異很輕微且并沒有達(dá)到明顯的統(tǒng)計學(xué)差異，但Desai等的研究提示，即使是非常輕微的硬度差別，也有可能對肝細(xì)胞等細(xì)胞的生物學(xué)行為和功能產(chǎn)生巨大影響。細(xì)胞本身是問題的關(guān)鍵。本研究強(qiáng)調(diào)了細(xì)胞對環(huán)境硬度變化的壓力感受，并強(qiáng)調(diào)了肝臟不同區(qū)域的肝細(xì)胞暴露在具有不同力學(xué)特性的基質(zhì)微環(huán)境中。對于基質(zhì)力學(xué)特點的異質(zhì)性如何影響正常生理情況下肝細(xì)胞的生物學(xué)行為目前尚有待于進(jìn)一步的研究，肝臟不同分區(qū)中基質(zhì)力學(xué)的差別可以部分解釋不同分區(qū)中肝細(xì)胞功能、可溶物的表達(dá)以及對損傷易感性的差別。本研究指出，在理解肝細(xì)胞功能分區(qū)時應(yīng)將肝臟不同分區(qū)的基質(zhì)力學(xué)特性納入考慮之中。

當(dāng)發(fā)生了肝臟纖維化之后，不同分區(qū)的肝臟實質(zhì)細(xì)胞環(huán)境的力學(xué)異質(zhì)性更加突出[3]。本研究使用AFM和高分辨率光學(xué)顯微鏡觀察了發(fā)生了纖維化的肝臟硬化局部的特殊結(jié)構(gòu)。引起研究者興趣的問題是：竇周毛細(xì)血管化，代表了早期纖維化過程，是否可以影響局部力學(xué)特性并通過力學(xué)特性的改變影響局部肝細(xì)胞和新生基底膜上血竇內(nèi)皮細(xì)胞的功能。

發(fā)生膽管纖維化時，肝臟整體的硬度增加最為明顯。與這一觀點類似，通過AFM手段研究發(fā)現(xiàn)，盡管兩種動物模型的肝臟間質(zhì)中均有纖維間隔形成，3,5-二乙氧基羰基-1,4-二氫-2,4,6-三甲基吡啶(DDC)誘導(dǎo)的伴有膽管損傷的小鼠肝硬化模型的肝臟硬度是CCl4模型的兩倍。除了早期纖維化階段外，上述模型對肝細(xì)胞的影響并不大，這兩種動物模型肝臟中幾乎纖維瘢痕形成的全部區(qū)域內(nèi)壓力均超過了1 kPa，這種肝細(xì)胞所處環(huán)境的硬度的改變對肝細(xì)胞功能的影響趨于平穩(wěn)狀態(tài)。而肝星狀細(xì)胞，至少在培養(yǎng)環(huán)境下，對環(huán)境硬度感受比肝細(xì)胞更敏感，可發(fā)生纖維化、凋亡等，這也意味著不同區(qū)域的HSC表達(dá)了不同的蛋白酶。這對于纖維化的逆轉(zhuǎn)有重要的意義，也解釋了為什么會出現(xiàn)部分纖維間隔周圍細(xì)胞缺失，相對于其他非膽管瘢痕結(jié)構(gòu)而言，膽管瘢痕硬度更高、更難降解。是否在纖維化進(jìn)程中存在纖維間隔力學(xué)層面的“不可逆點”？這個問題的答案將對于我們在將來定義人類肝硬化的特定“硬度”具有重大意義并有助于我們理解肌成纖維細(xì)胞可產(chǎn)生蛋白酶和最易誘導(dǎo)凋亡的硬度范圍。部分學(xué)者認(rèn)為，纖維化進(jìn)程中膠原的含量變化不大，但膠原的組分發(fā)生變化使其更加分散，大的纖維變?yōu)樾∑尾⒉迦敫渭?xì)胞之間[5]。這一過程中局部的力學(xué)改變是怎樣的？肝細(xì)胞在此過程中又將發(fā)生怎樣的反應(yīng)？

Desai等使用AFM對上述問題的解答有部分提示。首先他們的工作為肝臟不同狀態(tài)下精確的力學(xué)特性提供了大量的信息。在小鼠模型中描繪了終末期硬化時、病毒性、膽源性以及脂肪性等不同基質(zhì)組分狀態(tài)下肝臟不同分區(qū)的硬度特點，這為我們理解纖維化如何形成、肝細(xì)胞功能異常以及潛在的可逆過程提供了關(guān)鍵信息。他們的工作也為我們理解硬化基礎(chǔ)上肝細(xì)胞癌(HCC)的發(fā)生提供了部分線索。若與Desai等觀察到的一致，即在肝臟基質(zhì)硬度增加時肝細(xì)胞的增殖增加，則提示在肝臟中存在特定的硬度區(qū)域或特殊的力學(xué)/結(jié)構(gòu)區(qū)域，這將為HCC的形成提供一個合適的微環(huán)境或一次亦或二次打擊。最后，通過分析不同時間點肝臟的高分辨硬度變化將有可能揭示肝臟早期修復(fù)的力學(xué)變化，同時也可能幫助我們理解肝臟結(jié)構(gòu)例如橋接纖維化形成中的力學(xué)變化。Desai等這項研究在回答了許多科學(xué)問題的同時也揭開了肝臟的力學(xué)特性這一新的研究領(lǐng)域的全新篇章。

[1] Tatsumi A, Maekawa S, Sato M, et al. Liver stiffness measurement for risk assessment of hepatocellular carcinoma. Hepatol Res, 2015,45:523-532.

[2] Singh S, Fujii LL, Murad MH, et al. Liver stiffness is associated with risk of decompensation,liver cancer, and death in patients with chronic liver diseases: a systematic review and meta-analysis. Clin Gastroenterol Hepatol, 2013,11:1573-1584.e1-2; quiz, e88-89.

[3] Desai SS, Tung JC, Zhou VX, et al. Physiological ranges of matrix rigidity modulate primary mouse hepatocyte function in part through hepatocyte nuclear factor 4 alpha. Hepatology,2016,64:261-275.

[4] Perepelyuk M, Chin L, Cao X, et al. Normal and fibrotic rat livers demonstrate shear strain softening and compression stiffening: a model for soft tissue mechanics. PLoS One,2016,11:e0146588.

[5] Popov Y, Sverdlov DY, Sharma AK, et al. Tissue transglutaminase does not affect fibrotic matrix stability or regression of liver fibrosis in mice. Gastroenterology， 2011,140:1642-1652.

(本文編輯：張苗)

100000 北京大學(xué)人民醫(yī)院消化內(nèi)科

2016-09-24)