王華偉 張宇睿 徐文清

300192天津，中國醫(yī)學科學院北京協(xié)和醫(yī)學院放射醫(yī)學研究所，天津市放射醫(yī)學與分子核醫(yī)學重點實驗室

線粒體靶向藥物的研究進展

王華偉 張宇睿 徐文清

300192天津，中國醫(yī)學科學院北京協(xié)和醫(yī)學院放射醫(yī)學研究所，天津市放射醫(yī)學與分子核醫(yī)學重點實驗室

電離輻射產生的活性氧（ROS）和自由基攻擊DNA、脂質、蛋白質等生物大分子，造成機體細胞和組織的損傷。體內ROS主要來自線粒體，輻射造成線粒體損傷，使細胞內ROS持續(xù)增加。線粒體靶向抗氧化劑由于靶向在線粒體釋放，能夠高效地消除輻射導致的線粒體內過量ROS，保護線粒體，降低電離輻射對細胞的損傷，被認為是一類有前景的輻射損傷防護藥。近年來，文獻報道了多種線粒體靶向給藥系統(tǒng)，筆者主要分析了線粒體靶向給藥系統(tǒng)的方法及其發(fā)展趨勢以及在輻射防護上的應用潛能。

線粒體；靶向治療；給藥系統(tǒng)；線粒體疾??；輻射防護劑

Fund programs:National Natural Science Foundation of China（81273005）；Natural Science Foundation of Tianjin（14JCZDJC36400）；Youth Fund of Peking Union Medical College（33320140124）；Research Fund of Institute of Radiation，Chinese Academy of Medical Sciences（1555）

遺傳學和分子生物學方面的研究表明，線粒體在生理功能的內穩(wěn)態(tài)（包括電子傳遞、凋亡調節(jié)和鈣穩(wěn)態(tài)調節(jié)等）方面發(fā)揮著重要的作用，這些生理功能對人體健康來說至關重要。如果這些生理功能出現了障礙，會引起多種疾病，例如：糖尿病、癌癥及遺傳線粒體疾病分別由能量轉運系統(tǒng)的功能障礙、細胞凋亡調節(jié)的缺失以及線粒體DNA（mitochondrial DNA，mtDNA）的突變引起[1]。線粒體功能障礙會引起多種線粒體疾病，因此，線粒體是一個重要的藥物靶點[2]。研究表明，補充線粒體缺失的功能可以治療線粒體疾病，但是由于缺乏合適的藥物靶向系統(tǒng)，導致藥物進入體內后，分布廣泛，不能有效地濃集在靶點，導致治療效果不佳。因此，發(fā)展針對藥物小分子（電子傳遞系統(tǒng)的輔酶和抗氧化劑，如維生素E）和大分子（包括線粒體蛋白和mtDNA）的靶向藥物是非常必要的[3]。

電離輻射誘發(fā)自由基及活性氧（reactive oxygen species，ROS）的產生，是輻射損傷的主要因素。線粒體呼吸鏈是ROS的主要來源，因此，減少輻射后ROS的產生，以及加快照射后組織細胞內ROS的清除成為輻射防護藥物的研發(fā)重點，線粒體靶向抗氧化劑成為輻射防護藥研究的新方向。Rwigema等[4]通過研究提出了兩條發(fā)展線粒體靶向小分子輻射防護藥的新策略，他們合成了線粒體靶向小分子輻射防護藥JP4-039（氮氧自由基）和P53/ MDM2/MDM4（P53：腫瘤轉化相關蛋白53；MDM2：鼠雙微體2；MDM4：鼠雙微體4，MDM2和MDM4是P53的主要負調控蛋白）等抑制劑，體內、體外實驗均驗證其具有輻射防護作用[4]。Jiang等[5]也報道了一種新型的線粒體靶向輻射防護藥，他們通過三苯基膦和氮氧自由基連接形成新化合物TPEY-Tempo（mitochondria-targeted triphenylphosphonium-conjugated nitroxide），三苯基膦可以把氮氧自由基靶向到線粒體中清除電離輻射產生的自由基，從而保護細胞免受損傷，達到輻射防護的作用。近些年，線粒體靶向技術發(fā)展迅速，線粒體靶向抗氧化劑在輻射防護方面具有自己獨特的優(yōu)勢，因此，筆者綜述最近幾年發(fā)展較為成熟的線粒體靶向技術和方法，著重分析線粒體靶向給藥系統(tǒng)的研究進展，討論各個系統(tǒng)的優(yōu)缺點及線粒體的靶向治療策略。

1 小分子藥物靶向線粒體的研究

1.1 利用親脂陽離子實現線粒體靶向

線粒體具有150～180 mV的膜電勢（外正內負），細胞內帶正電荷的復合物由于電勢能的驅動，可以有效地積累到線粒體中[6]。維生素E和親脂陽離子三苯基膦可以軛合成復合物MitoE，MitoE帶有正電荷，可以靶向到線粒體中。同時體外細胞實驗表明，與單純的維生素E相比，MitoE能夠更有效地通過脂質雙分子層到達線粒體中[7]。此外，MitoQ是輔酶Q和三苯基膦軛合的復合物，進入到線粒體后，MitoQ在線粒體呼吸鏈中被代謝為活性成分輔酶Q，其可以阻止脂質過氧化并清除線粒體內的ROS，保護線粒體使其不受氧化應激損傷[8-9]。除此之外，基于親脂陽離子而形成的線粒體靶向藥物還有MitoF、Mito（CEHC）、TPMP[MitoF：輔酶F和三苯基膦軛合的復合物；Mito（CEHC）：線粒體靶向的2,5,7,8-四甲基-2-（2′-羧基乙基）-6-羥基苯并二氫吡喃；TPMP：三苯基膦磷酸酯]等[10]。

1.2 利用SS肽（Szeto-Schiller peptides）實現線粒體靶向

Zhao等[11]研究表明，可以用細胞滲透性肽靶向抗氧化劑到線粒體中，從而降低細胞內ROS的含量。該研究開發(fā)了一種新方法，即利用SS肽進入到線粒體內膜。SS肽包含有酪氨酸和芳香族陽離子肽，芳香族陽離子肽可以依賴線粒體的膜電勢實現線粒體靶向，酪氨酸可以清除過氧化氫、過氧硝酸鹽，抑制脂質過氧化[12]。這些肽抗氧化劑具有細胞滲透性，可以在線粒體內膜中濃集到1000倍，同時這些肽抗氧化物能顯著降低細胞內的ROS和由叔丁基過氧化氫（tBHP）引起的神經元N2A細胞死亡。Zhao等[11]推測這些線粒體內膜靶向的抗氧化劑可能對線粒體疾病、與年齡相關的氧化應激等有很好的療效。

1.3 選擇性電子接受劑的線粒體靶向

最近Wipf等[13]報道了一種具有線粒體靶向電子接受ROS清除作用的XJB-5-131。它把具有ROS清除活性的有效載荷部分和線粒體靶向部分連接起來，其中，XJB-5-131的有效載荷部分由氮氧自由基組成，氮氧自由基接受一個電子轉變成羥胺，羥胺是很好的ROS清除劑，并且在清除ROS的過程中重新轉變?yōu)榈踝杂苫鵞14]。XJB-5-131的靶向部分由短桿菌肽S的Leu-D-Phe-Pro-Val-Orn片段組成，這是一種具有膜活性的環(huán)肽抗生素[15]。由于這種類型的抗生素對細菌膜有很高的親和力，同時由于細菌和線粒體之間具有緊密的聯(lián)系，所以該片段可以高效地把XJB-5-131靶向到線粒體中[16]。Wipf等[13]已經在大鼠身上證實XJB-5-13可以改善回腸黏膜屏障的功能障礙，XJB-5-133也可以降低這些大鼠回腸黏膜上線粒體磷脂和心磷脂的過氧化，同時也能降低回腸黏膜嚴重的出血性休克誘導的促凋亡酶caspases 3和caspases 7的激活。

2 蛋白質靶向線粒體的治療系統(tǒng)

線粒體蛋白在體內發(fā)揮著重要的生理功能，蛋白質的功能性障礙可以造成許多線粒體疾病。通過線粒體靶向系統(tǒng)導入正常的蛋白質以替代有缺陷的蛋白質來改善和治療這些疾病[17]。

2.1 線粒體靶向信號肽（mitochondrial targeting signal peptide，MTS）介導的線粒體蛋白導入機制

線粒體包含大量蛋白質，其中僅有13種蛋白質是由mtDNA編碼的。99%的線粒體蛋白是由核基因編碼，在細胞質的核糖體上合成，再通過MTS轉運到線粒體中。MTS位于前區(qū)蛋白的N端，包含10～70個氨基酸，MTS一旦轉運到線粒體中，會經過一步或者兩步水解反應完成降解[18-19]?；谝陨线^程可實現線粒體靶向的目標蛋白有超氧化物歧化酶、凋亡誘導蛋白和抗凋亡蛋白。靶向蛋白進入線粒體可以保護mtDNA和核DNA免受ROS和過度凋亡的損傷[20]。應用MTS可以有效地把蛋白質導入到線粒體中，目前已經報道了數例關于靶向限制酶到線粒體的治療方法[21-23]。Tanaka等[24]選擇限制性核酸內切酶SmaI作為目標蛋白，SmaI選擇性酶切由8993T→G突變引起mtDNA突變的疾病。該研究結果顯示，線粒體靶向SmaI具有對突變mtDNA較強的清除能力，由此表明這是一種創(chuàng)新的線粒體疾病治療方法。

盡管MTS呈現了很好的前景，但對于一些特殊情況，這種方法是不適用的。第一種情況是線粒體導入蛋白機制存在缺陷，使得MTS融合蛋白在轉運至線粒體中受到擾動。第二種情況是導入mtDNA編碼的蛋白，由于這些蛋白一般具有疏水性，不能維持展開的構象，而該構象是MTS導入機制所必須的。同時，MTS介導的導入機制對蛋白質的分子大小有嚴格的要求[25]，不能傳送展開的蛋白質和DNA、肽核酸等高分子[26]。

2.2 通過蛋白質轉導結構域（protein transduction domain，PTD）來傳送治療蛋白

最近研究發(fā)現，通過PTD來傳遞蛋白是一種很有前途的方法，可以實現各種類型的生物活性分子的轉運[27-28]。其中一種PTD是由HIV-1反式轉錄激活因子（trans-activator of transcription，TAT）衍生的，它是HIV-1在感染早期產生的一種重要調節(jié)蛋白，PTD由11個氨基酸組成（其中包括6個精氨酸和2個賴氨酸殘基）。體內和體外實驗都表明，這種PTD能快速地透過細胞膜把藥物轉運到細胞中；TAT肽已經作為一種膜滲透肽用來傳送寡核苷酸、多肽、全長蛋白質甚至200nm的脂質體[27-28]。近年來，多種蛋白質通過TAT肽被轉運到細胞內，不僅如此，進一步研究發(fā)現，TAT肽能夠通過核膜來轉運藥物進入線粒體[29]。Del等[30]開發(fā)了一種TAT融合蛋白，其是由線粒體蘋果酸脫氫酶和綠色熒光蛋白（TAT-mMDH-GFP）（mMDH：線粒體蘋果酸脫氫酶；GFP：綠色熒光蛋白）的MTS衍生而來。TAT-mMDH-GFP通過MTS介導的通道轉運藥物進入線粒體，如果TAT是非選擇性的滲透進入線粒體，轉運進入線粒體的治療蛋白將會重新分布，進而影響治療效果，為了避免這種情況，TAT和mMDH的N端連接，這樣在基質集合區(qū)MTS被特異性裂開，實現了GFP和TAT分離，GFP被有效地保留在基質中。Shokolenko等[31]利用PTD和MTS的結合物傳送核酸外切酶Ⅲ（exonuclease，ExoⅢ）進入線粒體，ExoⅢ的N端和C端分別與MTS和TAT結合形成MTS-ExoⅢ-TAT融合蛋白，ExoⅢ的過表達使癌癥細胞對氧化損傷更敏感，癌細胞的存活率下降。在這個實驗中，具有細胞質傳送功能的PTD和具有線粒體靶向活性的MTS的結合可以彌補PTD的非特異性蛋白導入，也就是說，利用這個策略可以把蛋白質有效地導入細胞質和線粒體中。

3 線粒體疾病的基因治療

線粒體疾病與mtDNA的突變和缺失有密切的關系。mtDNA是一個環(huán)狀的含有16 569個堿基對的分子，它編碼了13個與氧化磷酸化有關的蛋白，由于沒有外顯子區(qū)域，相比于核DNA，mtDNA具有更高的信息密度。因此，mtDNA對基因突變更敏感，這導致了更高概率的線粒體疾病的發(fā)生?；蛲蛔円鸶鞣N線粒體疾病，線粒體傳送基因進入線粒體可以修復突變的mtDNA分子或者補償正常的mtDNA，從而有效地治療線粒體疾病[32]。

3.1 靶向寡脫氧核苷酸（oligodeoxynucleotide，ODN）和肽核酸

研究表明，傳送具有治療作用的ODN和肽核酸進入線粒體具有治療由mtDNA突變引起的線粒體疾病的潛力，把MTS分別軛合到ODN、雙鏈DNA或肽核酸上，這些軛合物可以通過蛋白質導入機制，跨過線粒體內膜和外膜進入線粒體[33]。

3.2 環(huán)形DNA

在理想的狀態(tài)下，mtDNA是難突變的，這種情況下的細胞表現為同質體。然而，在特定的情況下，細胞既有突變體也有野生型，這種情況表現為異質體。在線粒體相關疾病中，當突變的mtDNA百分比超過一個特定的閾值時，線粒體功能障礙在臨床表現上比較明顯。相應的，傳送大量野生型mtDNA進入患有線粒體疾病的細胞中，其進入線粒體基質中可以降低突變mtDNA的百分比，從而實現對線粒體疾病的抑制。所以，利用MTS軛合的方法傳送mtDNA和質粒DNA（plasmid DNA，pDNA）這種大分子進入線粒體可以實現線粒體的基因治療[34]。

4 新型的線粒體靶向治療系統(tǒng)

為了實現對線粒體疾病的治療，線粒體靶向給藥系統(tǒng)必須實現突破。包括：設計一種簡單、有效的方法來包裹像化學品、蛋白質、多肽、ODN和環(huán)狀DNA等類型的藥物；建立靶向系統(tǒng)，把這些包合物靶向到特定的細胞，能夠調節(jié)細胞內的轉運，包括從核內體到線粒體中[16]。

4.1 多功能信封式納米裝置（multifunction enveloptype nano device，MEND）

包封藥物和大分子進入藥物載體的效率是發(fā)展線粒體靶向系統(tǒng)的重要因素，眾所周知，抗癌藥阿霉素通過有效包封可以提高藥效，為了治療各種類型的線粒體疾病，許多分子如ODN、pDNA和折疊蛋白質都應該被靶向到肝臟細胞的線粒體中[16]。由于缺乏有效的靶向方法，基因治療和蛋白質治療的發(fā)展受阻。目前，MEND是一種有前途的靶向系統(tǒng)，其由一個濃縮的pDNA和脂質的信封結構組成。MEND有很多優(yōu)勢：①濃縮的pDNA顆粒和脂質通過電子作用能夠有效地結合在一起；②MEND具有各種功能裝置，比如：延長血液循環(huán)的聚乙二醇、起靶向作用的配體和促進核內體逃逸并對pH敏感的融合肽等；③MEND的尺寸大小可以被控制在100～300 nm，這對細胞攝入是有利的。因此，這種包封方法被認為可以解決很多問題（比如：低包封率和緩控釋等）。隨后的研究已經成功開發(fā)出ODN-MEND，其由濃縮的ODN核心和脂質信封結構組成，ODN-MEND通過形成濃縮的ODN顆?？梢燥@著提高脂質對ODN的包封效率，包封率明顯高于其他方法；ODN-MEND的藥效表明，MEND可以有效地包合大分子進入細胞質，因此，可以利用MEND包封具有治療作用的蛋白質和多肽[35-36]。

4.2 脂質體

近年來，許多線粒體靶向脂質體被開發(fā)出來。目前，線粒體靶向脂質體主要用于抗腫瘤研究。線粒體靶向脂質體一般是由脂質體包裹小分子藥物（如抗癌藥），脂質體的表面由線粒體靶向分子修飾，其中大部分的靶向分子是由三苯基膦的衍生物和具有長循環(huán)性質的分子通過酯化或酰化反應連接在一起，三苯基膦作為親脂陽離子可以在線粒體膜電勢的驅動下實現線粒體靶向[37]。線粒體靶向脂質體對耐藥性腫瘤有較好的抑制作用，同時也能提高藥物的細胞攝入，是一種比較有前景的抗腫瘤藥[38]。

5 小結與展望

近年來，線粒體靶向給藥系統(tǒng)的研究取得了很大進展，但仍有很多問題亟待解決。靶向藥物到線粒體后，藥物在線粒體中的轉運被認為是線粒體疾病治療的重要一步。如凋亡誘導藥物和凋亡抑制劑應該被轉運到線粒體的外膜，因為在線粒體的外膜會引發(fā)和凋亡有關的各種反應；而與呼吸鏈相關的蛋白質和輔酶應該被轉運到線粒體的膜間隙和內膜，因為在這兩個地方有與呼吸相關的各種電子傳送系統(tǒng)?；谶@種觀念，目前已經提出了一種新概念“線粒體內的轉運調節(jié)”來實現更精細的藥物傳送[39]。眾所周知，電離輻射產生的ROS是由線粒體呼吸鏈的電子滲漏產生的，所以把抗氧化劑轉運到線粒體的間隙和內膜才能最大限度地發(fā)揮藥物作用。線粒體靶向技術發(fā)展迅速，在腫瘤治療、線粒體疾病、中樞退行性疾病等方面有較多的研究，但在輻射防護方面研究較少，基于線粒體靶向抗氧化劑在輻射防護方面有自己獨特的優(yōu)勢，我們堅信將來會有越來越多關于線粒體靶向輻射防護藥的研究。所以，隨著精細的線粒體內轉運調節(jié)技術的發(fā)展，線粒體靶向抗氧化劑將會成為一種有前途的輻射防護藥。

利益沖突 本研究由署名作者按以下貢獻聲明獨立開展，不涉及任何利益沖突。

作者貢獻聲明 王華偉負責論文撰寫；張宇睿負責文獻檢索和整理；徐文清負責論文審閱和修訂。

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Progress in mitochondrial targeting drug delivery systems

Wang Huawei， Zhang Yurui， Xu Wenqing
Key Laboratory of Radiation Medicine and Molecular Nuclear Medicine,Institute of Radiation Medicine, Chinese Academy of Medical Sciences and Peking Union Medical College,Tianjin 300192,China

Xu Wenqing,Email：xuwenqing@irm-cams.ac.cn

Free radicals and reactive oxygen species（ROS）generated by ionizing radiation attack vitalmacromolecules,suchasDNA,lipidsandProteins,thuscausingcellandtissuedamage.Themajorsource of radiation-induced ROS production is believed to be associated with mitochondria.Removal of excessive mitochondrial reactive oxygen species by electron scavengers and antioxidants is a promising therapeutic strategy to reduce the detrimental effects of radiation exposure.Mitochondrial targeting antioxidants and electron scavengers have been suggested as promising radioprotectors due to their well ability to remove of excessive mitochondrial reactive oxygen species.Papers about mitochondrial targeting drug delivery systems have been publicated in recent years.Technique of mitochondrial targeting drug delivery system,potential application in radiation protection and its development trend are discussed in this review.

Mitochondria;Targeted therapy;Medication system;Mitochondrial diseases；Radiationprotective agents

徐文清，Email：xuwenqing@irm-cams.ac.cn

10.3760/cma.j.issn.1673-4114.2016.04.015

國家自然科學基金（81273005）；天津市應用基礎與前沿技術研究重點項目（14JCZDJC36400）；北京協(xié)和醫(yī)學院青年基金（33320140124）；中國醫(yī)學科學院放射醫(yī)學研究所探索基金（1555）

2016-01-13）