顏 兵， 江 月， 梁若楠， 吳軒德， 周世水

(華南理工大學(xué)生物科學(xué)與工程學(xué)院，廣東廣州 510006)

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釀酒酵母和異常漢遜酵母在釀酒過(guò)程中的相互作用

顏 兵， 江 月， 梁若楠， 吳軒德， 周世水*

(華南理工大學(xué)生物科學(xué)與工程學(xué)院，廣東廣州 510006)

摘要[目的]探究釀酒酵母與異常漢遜酵母在半固態(tài)白酒釀造過(guò)程中的相互作用。[方法]在白酒釀造過(guò)程中，通過(guò)對(duì)微生物純培養(yǎng)和混合培養(yǎng)過(guò)程中微生物數(shù)目變化、理化指標(biāo)變化來(lái)探究釀酒酵母與異常漢遜酵母間的相互作用。[結(jié)果]在釀酒酵母、異常漢遜酵母共培養(yǎng)過(guò)程中，異常漢遜酵母經(jīng)過(guò)24 h短暫生長(zhǎng)后迅速衰亡；對(duì)可能引起異常漢遜酵母衰亡的因子包括碳源、酒精度、pH、酵母無(wú)細(xì)胞濾液的初步研究，發(fā)現(xiàn)在釀酒酵母無(wú)細(xì)胞濾液和混合酵母無(wú)細(xì)胞濾液中，異常漢遜酵母生長(zhǎng)受到明顯抑制而釀酒酵母生長(zhǎng)正常。[結(jié)論]異常漢遜酵母和釀酒酵母共培養(yǎng)時(shí)，異常漢遜酵母的生長(zhǎng)受到明顯抑制，釀酒酵母的代謝產(chǎn)物是抑制其生長(zhǎng)的主要原因。

關(guān)鍵詞釀酒酵母；異常漢遜酵母；釀酒；相互作用

酵母是白酒釀造過(guò)程中的主要功能微生物，根據(jù)其在發(fā)酵過(guò)程中的作用，主要分為兩大類：一類是釀酒酵母，在白酒釀造中主要起產(chǎn)酒精的作用，一般具有高的酒精發(fā)酵力[1]；另一類是非釀酒酵母，主要為產(chǎn)酯酵母，它的產(chǎn)酒精能力較弱，但是在白酒釀造中可以將發(fā)酵中的原料前提物質(zhì)轉(zhuǎn)化為白酒的重要風(fēng)味物質(zhì)如醛、酯、高級(jí)醇等[2]。因此，釀酒酵母和非釀酒酵母常一起用于白酒的釀造。有研究表明，葡萄酒釀造過(guò)程中，在發(fā)酵初期非釀酒酵母發(fā)揮主要作用，但在發(fā)酵1~3 d后，釀酒酵母逐漸取代非釀酒酵母而成為優(yōu)勢(shì)菌株。出現(xiàn)這種情況的原因可能是釀酒酵母與非釀酒酵母對(duì)外界環(huán)境的抵抗力差異造成的，如營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的消耗、酒精度的提高、有機(jī)酸的增加、代謝物的產(chǎn)生都可能會(huì)抑制非釀酒酵母的生長(zhǎng)[3-5]。

目前，對(duì)釀酒酵母與非釀酒酵母的研究主要集中在葡萄酒釀造過(guò)程中，而白酒釀造過(guò)程中研究的比較少。因此，筆者通過(guò)對(duì)共培養(yǎng)過(guò)程中的碳源、酒精度、有機(jī)酸和酵母代謝物的研究，確定白酒釀造過(guò)程中影響異常漢遜酵母生長(zhǎng)的主要因子，為白酒的生產(chǎn)釀造提供借鑒和依據(jù)。

1材料與方法

1.1材料

1.1.1菌種 。釀酒酵母，華南理工大學(xué)生物科學(xué)與工程學(xué)院保藏；異常漢遜酵母(GIM2.18)，廣東微生物菌種保藏中心保藏。

1.1.2培養(yǎng)基。麥芽汁培養(yǎng)基(固體)：加入15 g/L瓊脂的麥芽汁(10°p)。米酒發(fā)酵培養(yǎng)基：按粉碎大米∶水=1∶8的比例混合均勻，93 ℃糊化30 min，冷卻至60 ℃加入糖化酶(3‰，以大米計(jì))糖化2 h，冷卻后雙層紗布過(guò)濾，煮沸15 min，121 ℃滅菌20 min。

1.2方法

1.2.1釀酒酵母和異常漢遜酵母的耐酒精試驗(yàn)。配制酒精濃度為0%vol、6%vol、8%vol、10%vol、12%vol、14%vol的滅菌米酒發(fā)酵培養(yǎng)基。接入菌株后在30 ℃靜置培養(yǎng)24 h，測(cè)定菌體濃度，使OD600nm在0.20~0.80。

1.2.2釀酒酵母與異常漢遜酵母相互作用研究。

1.2.2.1發(fā)酵過(guò)程微生物數(shù)量的變化。釀酒酵母和異常漢遜酵母純培養(yǎng): 將異常漢遜酵母、釀酒酵母分別接種到50 mL米酒發(fā)酵培養(yǎng)基中，接種量2.5×106CFU/mL，32 ℃條件下靜置培養(yǎng)8 d。每隔24 h取樣，稀釋平板法測(cè)定異常漢遜酵母、釀酒酵母的數(shù)量。

異常漢遜酵母和釀酒酵母共培養(yǎng)：接種異常漢遜酵母和釀酒酵母到50 mL米酒發(fā)酵培養(yǎng)基，接種量2.5×106CFU/mL，32 ℃條件下，靜置培養(yǎng)8 d。每隔24 h取樣，用稀釋平板法測(cè)定異常漢遜酵母、釀酒酵母的數(shù)量。

1.2.2.2發(fā)酵過(guò)程的理化指標(biāo)。酵母培養(yǎng)方法同“1.2.2.1”，還原糖采用DNS法測(cè)定，酒精度采用酒精計(jì)測(cè)定。

1.2.2.3無(wú)細(xì)胞濾液對(duì)酵母生長(zhǎng)的抑制作用。分別將釀酒酵母、異常漢遜酵母及兩者混合液接種于米酒發(fā)酵培養(yǎng)基中培養(yǎng)2 d，離心后超濾得到無(wú)細(xì)胞濾液。在無(wú)細(xì)胞濾液中添加等體積米酒發(fā)酵培養(yǎng)基，按2.5×106CFU/mL 接種，30 ℃靜置培養(yǎng)24 h后測(cè)OD600nm值。對(duì)照組為米酒發(fā)酵培養(yǎng)基。

2結(jié)果與分析

2.1釀酒酵母和異常漢遜酵母的耐酒精試驗(yàn)結(jié)果酵母的耐酒精能力在白酒釀造中具有重要作用。每株酵母都有其最大的耐酒精度，當(dāng)達(dá)到最大耐酒精度時(shí)，酵母就會(huì)停止生長(zhǎng)。

從圖1可知，隨著培養(yǎng)基中酒精含量的增大，2株酵母的相對(duì)生長(zhǎng)速率均逐漸減小，當(dāng)酒精含量在12%vol時(shí)，2株酵母均幾乎不生長(zhǎng)，故釀酒酵母的耐酒精度為10%vol、異常漢遜酵母為8%vol。一般來(lái)說(shuō)，非釀酒酵母耐酒精能力較低，而該研究中異常漢遜酵母具有較強(qiáng)耐酒精能力，能在混合發(fā)酵體系中生長(zhǎng)。

圖1　釀酒酵母與異常漢遜酵母耐酒精度試驗(yàn)結(jié)果Fig. 1　Alcohol tolerance test of Saccharomyces cerevisiae and Hansenula anomala

2.22種酵母培養(yǎng)過(guò)程中微生物數(shù)量變化結(jié)果釀酒酵母和異常漢遜酵母純培養(yǎng)的微生物數(shù)目變化見(jiàn)圖2，釀酒酵母和異常漢遜酵母共培養(yǎng)的微生物數(shù)目變化見(jiàn)圖3。

圖2　釀酒酵母和異常漢遜酵母純培養(yǎng)過(guò)程數(shù)目變化Fig. 2　Quantitive changes of Saccharomyces cerevisiae and Hansenula anomala during pure culture process

從圖2可知，釀酒酵母和異常漢遜酵母純培養(yǎng)過(guò)程中，在前48 h 2種酵母均處于快速生長(zhǎng)階段，而后在48~120 h維持較高的數(shù)目基本不變，在120 h后兩者均開(kāi)始衰亡，微生物數(shù)目都開(kāi)始減少。釀酒酵母和異常漢遜酵母在培養(yǎng)過(guò)程可達(dá)到的最大細(xì)胞量分別為2.8×108和2.4×108CFU/mL。

圖3　釀酒酵母和異常漢遜酵母混合培養(yǎng)過(guò)程數(shù)目變化Fig. 3　Quantitive changes of Saccharomyces cerevisiae and Hansenula anomala during mixed culture

由圖3可知，在釀酒酵母和異常漢遜酵母共培養(yǎng)過(guò)程中，釀酒酵母在前48 h處于生長(zhǎng)階段，而后緩慢減少。這可能由于釀酒酵母和異常漢遜酵母混菌發(fā)酵，兩者競(jìng)爭(zhēng)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)而導(dǎo)致釀酒酵母經(jīng)過(guò)短暫的對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，而后馬上進(jìn)入衰亡期。異常漢遜酵母經(jīng)過(guò)24 h的迅速增長(zhǎng)后迅速衰亡，這可能由于受釀酒酵母競(jìng)爭(zhēng)抑制使其迅速減少。

2.3釀酒酵母和異常漢遜酵母的相互作用研究

2.3.1營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的限制。釀酒酵母與非釀酒酵母對(duì)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的競(jìng)爭(zhēng)主要是對(duì)碳源的競(jìng)爭(zhēng)。從圖4可知，2種酵母純培養(yǎng)和共培養(yǎng)時(shí)，隨著發(fā)酵的進(jìn)行，發(fā)酵液中的還原糖含量逐漸降低，發(fā)酵8 d后，釀酒酵母、異常漢遜酵母、二者混合培養(yǎng)的發(fā)酵液中的還原糖含量分別為22.54、20.75、20.14 g/L?；炀l(fā)酵終了時(shí)，其發(fā)酵液中的還原糖濃度與異常漢遜酵母純發(fā)酵時(shí)還原糖濃度基本相同，再結(jié)合圖2和圖3酵母純培養(yǎng)與共培養(yǎng)時(shí)微生物數(shù)目的變化結(jié)果，可見(jiàn)碳源不是導(dǎo)致異常漢遜酵母在共培養(yǎng)時(shí)受抑制的主要原因。

圖4　酵母發(fā)酵過(guò)程中還原糖的含量變化Fig. 4　Changes of reducing sugar content during yeast fermentation

2.3.2酒精度對(duì)異常漢遜酵母生長(zhǎng)抑制作用。從圖5可知，在發(fā)酵1~6 d，發(fā)酵液中的酒精含量不斷增大，6 d后酒精含量基本不變。由于釀酒酵母的產(chǎn)酒精能力高于異常漢遜酵母的產(chǎn)酒精能力，所以在整個(gè)發(fā)酵過(guò)程中，釀酒酵母發(fā)酵液中的酒精含量>共培養(yǎng)發(fā)酵液酒精含量>異常漢遜酵母發(fā)酵液酒精含量。發(fā)酵6 d后異常漢遜酵母培養(yǎng)液、釀酒酵母培養(yǎng)液、共培養(yǎng)發(fā)酵液的酒精度依次為3.4%vol、4.7% vol、4.1%vol。結(jié)合圖1異常漢遜酵母耐酒精試驗(yàn)結(jié)果可知，異常漢遜酵母能夠耐受8%vol的酒精度。因此，在異常漢遜酵母與釀酒酵母共培養(yǎng)過(guò)程中，酒精度不是抑制異常漢遜酵母生長(zhǎng)的原因。

圖5　酵母發(fā)酵過(guò)程中酒精度的含量變化Fig. 5　Changes of alcohol content during yeast fermentation

2.3.3pH對(duì)異常漢遜酵母抑制作用。從圖6可知，酵母發(fā)酵液在發(fā)酵1 d后，其pH迅速降低，由初始pH 5.6降至pH 3.7左右，而后出現(xiàn)先逐漸減少再稍微上升的趨勢(shì)。整個(gè)發(fā)酵過(guò)程中，異常漢遜酵母純培養(yǎng)發(fā)酵液的pH均低于混菌發(fā)酵培養(yǎng)液中的pH。由此可知，異常漢遜酵母發(fā)酵產(chǎn)酸要高于異常漢遜酵母與釀酒酵母混菌發(fā)酵產(chǎn)酸。因此，pH不是抑制異常漢遜酵母的主要原因。

圖6　 酵母發(fā)酵過(guò)程中pH的變化Fig. 6　Changes of pH value during yeast fermentation

2.3.4酵母發(fā)酵代謝物對(duì)異常漢遜酵母的抑制作用。由表1可知，對(duì)于釀酒酵母而言，無(wú)論是在釀酒酵母濾液、異常漢遜酵母濾液還是混菌發(fā)酵的濾液當(dāng)中，其生長(zhǎng)未表現(xiàn)出抑制作用。說(shuō)明酵母代謝物對(duì)釀酒酵母的生長(zhǎng)沒(méi)有明顯的抑制作用。異常漢遜酵母在釀酒酵母和混菌發(fā)酵濾液中，其生長(zhǎng)都出現(xiàn)了比較明顯的抑制作用。因此，釀酒酵母代謝物是抑制異常漢遜酵母生長(zhǎng)的重要原因，且混菌發(fā)酵濾液中的抑制作用要高于酵母純培養(yǎng)濾液。

表1　無(wú)細(xì)胞濾液對(duì)酵母生長(zhǎng)抑制作用結(jié)果

3結(jié)論與討論

該試驗(yàn)采用共培養(yǎng)的方法，通過(guò)對(duì)純培養(yǎng)及混合培養(yǎng)過(guò)程中2種酵母的數(shù)目變化進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)異常漢遜酵母在混合培養(yǎng)過(guò)程中受到明顯的抑制作用。對(duì)可能影響異常漢遜酵母生長(zhǎng)的因子，如碳源、pH、酒精度及無(wú)細(xì)胞濾液等的研究發(fā)現(xiàn)，無(wú)論在釀酒酵母無(wú)細(xì)胞濾液還是在混合酵母無(wú)細(xì)胞濾液中，異常漢遜酵母生長(zhǎng)均受到明顯抑制而釀酒酵母生長(zhǎng)正常，這說(shuō)明抑制異常漢遜酵母生長(zhǎng)的物質(zhì)主要是釀酒酵母的代謝物，而非營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)、酒精度和有機(jī)酸。但是具體哪些釀酒酵母的代謝產(chǎn)物起主要作用及如何起作用，目前尚不清楚。因此，如果能夠通過(guò)進(jìn)一步的研究確定何種代謝產(chǎn)物起主要抑制作用，并弄清其具體的作用機(jī)制，則不僅對(duì)于進(jìn)一步闡明米酒中酵母間的相互作用機(jī)制具有重要意義，也可為米酒的釀造生產(chǎn)提供一定的理論依據(jù)。

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Interaction betweenSaccharomycescerevisiaeandHansenulaanomaladuring Brewing

YAN Bing, JIANG Yue, LIANG Ruo-nan, ZHOU Shi-shui*et al (College of Biological Science and Engineering, South China University of Technology,Guangzhou,Guangdong 510006)

Abstract[Objective] To research the interaction betweenSaccharomycescerevisiaeandHansenulaanomalain semi-solid brewing. [Method]The interaction betweenSaccharomycescerevisiaeandHansenulaanomalawas studied by detecting the numbers of yeasts and analyzing the physical and chemical indexes during the single fermentation and mix fermentation. [Result]Hansenulaanomaladied rapidly after 24 hours during the mix fermentation ofSaccharomycescerevisiaeandHansenulaanomala. Through analyzing the influence factors such as carbon source, alcohol, pH and cell-free system of yeasts, we found out thatHansenulaanomalagrew very slowly in the cell-free solutions ofSaccharomycescerevisiaeand mix yeasts compared withSaccharomycescerevisiae. [Conclusion] During the mix fermentation ofSaccharomycescerevisiaeandHansenulaanomala,Hansenulaanomala is inhibited obviously mainly by the metabolites ofSaccharomycescerevisiae.

Key wordsSaccharomycescerevisiae;Hansenulaanomala; Brewing; Interaction

收稿日期2015-12-21

作者簡(jiǎn)介顏兵(1989- )，男，湖南永州人，碩士研究生，研究方向：生物工程。*通訊作者，副教授，博士，從事發(fā)酵工程與釀酒研究。

中圖分類號(hào)S 609.9

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼A

文章編號(hào)0517-6611(2016)02-107-03