何新舟，查東風(fēng)， 黃漢峰， 楊雪霞，常忠義， 高紅亮*

(1.華東師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，上海 200241；2.河南省商丘市農(nóng)業(yè)局經(jīng)作中心，河南商丘 476000；3.東華大學(xué)化學(xué)化工與生物工程學(xué)院，上海 201620)

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亞硝基胍誘變丙酸桿菌選育高產(chǎn)抑菌物質(zhì)菌株

何新舟1，查東風(fēng)2， 黃漢峰2， 楊雪霞3，常忠義1， 高紅亮1*

(1.華東師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，上海 200241；2.河南省商丘市農(nóng)業(yè)局經(jīng)作中心，河南商丘 476000；3.東華大學(xué)化學(xué)化工與生物工程學(xué)院，上海 201620)

摘要[目的]提高丙酸桿菌代謝物的抑菌活性，為薛氏丙酸桿菌代謝物的工業(yè)化生產(chǎn)奠定基礎(chǔ)。[方法]以實(shí)驗(yàn)室保藏的薛氏丙酸桿菌H1310為出發(fā)菌株，采用亞硝基胍(NTG)進(jìn)行誘變處理，待突變菌株長(zhǎng)出后采用雙層平板篩選法進(jìn)行篩選，而后通過深層液體發(fā)酵對(duì)篩選到的菌株進(jìn)行復(fù)篩。[結(jié)果]當(dāng)最優(yōu)的NTG誘變濃度為0.3 mg/mL時(shí)，致死率為90.69%。采用雙層平板法，從3 564株菌落中挑選出87株突變株，進(jìn)一步進(jìn)行復(fù)篩，獲得一株突變菌株，其代謝物抑菌活性達(dá)(28.30±2.47) AU/mL，比出發(fā)菌株提高43.87%。[結(jié)論]確定了丙酸桿菌NTG誘變選育的試驗(yàn)方法，獲得一株抑菌活性高的遺傳性能穩(wěn)定的菌株。

關(guān)鍵詞亞硝基胍誘變；薛氏丙酸桿菌；雙層平板篩選法；抑菌活性

丙酸桿菌是一種厭氧或兼性厭氧的革蘭氏陽性細(xì)菌，廣泛存在于土壤、奶酪、牛奶、奶制品以及青貯飼料中[1]。一部分經(jīng)典丙酸桿菌在生長(zhǎng)代謝過程中可產(chǎn)生乙酸、丙酸、二乙酰、過氧化氫及丙酸桿菌素等物質(zhì)。這些物質(zhì)的協(xié)同作用可以抑制部分微生物的生長(zhǎng)[2]。最為常見的丙酸桿菌代謝物MicrogardTM系列產(chǎn)品由薛氏丙酸桿菌在脫脂乳中發(fā)酵而成，可抑制部分革蘭氏陰性細(xì)菌、霉菌和酵母[3]。此外，美國(guó)食品藥品監(jiān)督總局已批準(zhǔn)丙酸桿菌代謝物MicrogardTM作為防腐劑應(yīng)用于奶酪和酸奶制品中。據(jù)悉，在美國(guó)約30%的奶酪中含有MicrogardTM[4]。在實(shí)際工業(yè)生產(chǎn)中，丙酸桿菌代謝物抑菌活性較低。

在微生物發(fā)酵過程中，提高代謝物產(chǎn)量較常見的方法有優(yōu)化發(fā)酵條件[5]、優(yōu)化發(fā)酵培養(yǎng)基[6]、菌株誘變選育、基因定點(diǎn)突變等[7-8]。孫帥等[9]在丙酸桿菌發(fā)酵第4天起每24 h補(bǔ)加一次復(fù)合碳源和酵母粉，發(fā)現(xiàn)試驗(yàn)組發(fā)酵液抑菌活性顯著高于對(duì)照組。Gollop等[10]發(fā)現(xiàn)在丙酸桿菌P-127生長(zhǎng)過程中，培養(yǎng)基中碳源、乳酸鈉、瓊脂的初始濃度以及培養(yǎng)基的初始pH都是丙酸桿菌素PLG-1生產(chǎn)的影響因素。劉靖等[11]采用紫外和亞硝基胍誘變最終選育出丙酸桿菌素高產(chǎn)菌株。Zhang等[12]采用基因重排提高薛氏丙酸桿菌產(chǎn)VB12的能力，最終突變菌株產(chǎn)量與親本菌株相比提高了60%。目前，國(guó)內(nèi)關(guān)于丙酸桿菌的菌株選育工作還處于實(shí)驗(yàn)室研究階段，并不能滿足丙酸桿菌代謝物工業(yè)化生產(chǎn)的需求。自1928年Fleming發(fā)現(xiàn)野生青霉菌以來，經(jīng)過反復(fù)多次誘變育種，青霉素產(chǎn)量近100 000 U/mL，與野生菌株相比提升了上萬倍[13-15]。在工業(yè)微生物育種中，誘變選育目的菌株作為一種常見的實(shí)驗(yàn)方法被廣泛地應(yīng)用于改善菌種特性、提高工業(yè)菌株代謝物產(chǎn)量[16]。根據(jù)所使用的誘變劑類別，誘變育種可分為物理誘變、化學(xué)誘變、生物誘變[17]。大部分的誘變方式都可導(dǎo)致基因堿基位點(diǎn)的缺失、增加、轉(zhuǎn)移、替代或DNA鏈的斷裂。其中，最有效的誘變方法包括亞硝基胍誘變、甲基甲硫磺酸鹽誘變、紫外誘變等。2007年付學(xué)琴等[18]對(duì)產(chǎn)南昌霉素菌株進(jìn)行NTG誘變，發(fā)現(xiàn)篩選得到的突變株產(chǎn)量比出發(fā)菌株提高116.7%。

亞硝基胍(NTG)是一種烷基化物，在高pH環(huán)境下裂解產(chǎn)生重氮甲烷。一些研究表明，NTG介導(dǎo)的誘變引起細(xì)胞內(nèi)DNA分子中堿基對(duì)G/C轉(zhuǎn)換成A/T。此外，NTG還會(huì)引發(fā)堿基對(duì)A/T轉(zhuǎn)換成C/G[19]。影響NTG誘變的因素包括緩沖液的pH、NTG濃度等。一些研究表明，在菌株誘變選育過程中，當(dāng)致死率為80.0%~90.0%時(shí)正突變菌株較多，當(dāng)致死率在90.0%~99.9%時(shí)負(fù)突變菌株較多[20]。

筆者以NTG作為誘變劑，對(duì)出發(fā)菌株——薛氏丙酸桿菌進(jìn)行誘變育種，以期得到一株代謝物抑菌活性更高的突變株，為丙酸桿菌育種及其代謝物工業(yè)化生產(chǎn)奠定基礎(chǔ)。

1材料與方法

1.1試驗(yàn)材料

1.1.1菌株。薛氏丙酸桿菌H1310(PropionibacteriumshermaniiH1310)和指示菌惡臭假單胞菌(Pseudomonasputida)均為實(shí)驗(yàn)室保藏菌種。

1.1.2培養(yǎng)基。丙酸桿菌種子培養(yǎng)基(SLB)組成為：胰蛋白胨10 g/L、酵母膏10 g/L、乳酸鈉10 g/L、KH2PO40.25 g/L、MnSO40.005 g/L，將pH調(diào)至7.0。丙酸桿菌發(fā)酵培養(yǎng)基組成為：葡萄糖15 g/L、酵母膏15 g/L、乳酸鈉6 mL/L、KH2PO40.25 g/L、MnSO40.005 g/L，將pH調(diào)至7.0。LB培養(yǎng)基組成為：胰蛋白胨10 g/L、酵母膏5 g/L、氯化鈉10 g/L，將pH調(diào)至7.0。以上3種培養(yǎng)基均在121 ℃下滅菌20 min。

1.1.3主要試劑。亞硝基胍，購(gòu)自生工生物有限公司。其他試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.2試驗(yàn)方法

1.2.1出發(fā)菌株活化。取含有丙酸桿菌菌粉的安碚管，在無菌條件下敲碎安碚管，用少量SLB培養(yǎng)基溶解菌粉，轉(zhuǎn)入新鮮SLB培養(yǎng)基中，在30 ℃靜置培養(yǎng)48 h后制備終濃度為20%的甘油管，-80 ℃保存。

1.2.2出發(fā)菌株生長(zhǎng)曲線的測(cè)定。將活化后的薛氏丙酸桿菌以1%接種量轉(zhuǎn)入SLB培養(yǎng)基中，每組3個(gè)平行，30 ℃靜置培養(yǎng)，每12 h取樣測(cè)定OD600nm，繪制丙酸桿菌生長(zhǎng)曲線。

1.2.3菌懸液的制備。丙酸桿菌于30 ℃靜置培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期(OD600nm=1.2~1.5)，8 000 r/min離心10 min，去除上清，用濃度0.85%無菌生理鹽水洗滌3次，最后菌體用TM緩沖液(pH8.0)重懸，且將菌體濃度調(diào)整為108CFU/mL，備用。

1.2.4NTG誘變。以丙酮作為助溶劑，用pH 8.0的Tris-順丁烯二酸(TM)緩沖液配制成終濃度為1.0 mg/mL的NTG母液。各取500 μl菌懸液分裝于6個(gè)EP管中，分別添加不同體積的NTG母液和TM緩沖液使得各EP管反應(yīng)液總體積為1 mL，且每管中NTG濃度分別為0、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6 mg/mL，在30 ℃下200 r/min振蕩反應(yīng)30 min后加入大量生理鹽水以終止反應(yīng)。將誘變后的菌液10倍梯度稀釋并涂布，每組設(shè)置3個(gè)平行，30 ℃下厭氧培養(yǎng)7 d[13]。

1.2.5致死率的測(cè)定。將經(jīng)涂布的平板培養(yǎng)7 d后進(jìn)行菌落計(jì)數(shù)，并且計(jì)算致死率。

1.2.6突變菌株初篩。采用雙層平板初篩法測(cè)定。取過夜培養(yǎng)的惡臭假單胞菌菌液，并且稀釋至OD600nm為0.2，備用。在3 mL pH為5.3的LB軟瓊脂培養(yǎng)基(瓊脂含量0.75%)中加入0.1 mL上述菌液，迅速混勻后倒在長(zhǎng)有丙酸桿菌單菌落的平板上，鋪平。在30 ℃靜置培養(yǎng)12 h，待指示菌菌膜形成后，比較不同菌落產(chǎn)生抑菌圈的大小。

1.2.7突變菌株復(fù)篩。將抑菌圈較明顯的菌落接入種子培養(yǎng)基中，30 ℃靜置培養(yǎng)2 d后按5%接種量接入發(fā)酵培養(yǎng)基中，最后30 ℃靜置培養(yǎng)4 d后測(cè)定抑菌活性。

1.2.8突變菌株與出發(fā)菌株的比較。分別取突變菌株和出發(fā)菌株的甘油管，連續(xù)傳代穩(wěn)定后，以5%接種量接入發(fā)酵培養(yǎng)基中，每隔24 h取樣，測(cè)定生物量、抑菌活性。

1.2.9抑菌活性測(cè)定。采用改良的臨界稀釋法[14]測(cè)定。向96孔板每孔中加入20 μL不同稀釋濃度的丙酸桿菌代謝物和180 μL稀釋指示菌菌液。以180 μL稀釋菌液和20 μL無菌LB培養(yǎng)基為陽性對(duì)照，以200 μL LB培養(yǎng)基為空白對(duì)照。每個(gè)稀釋度的樣品做3個(gè)平行。在37 ℃培養(yǎng)箱中靜置培養(yǎng)3~5 h， 在波長(zhǎng)600 nm處測(cè)吸光值。吸光值為陽性對(duì)照一半的發(fā)酵液的稀釋倍數(shù)記為抑菌活性，單位AU/mL。

2結(jié)果與分析

2.1種子生長(zhǎng)曲線由圖1可知，在出發(fā)菌株接種后0~12 h內(nèi)OD600nm幾乎無變化，在接種后36~48 h內(nèi)丙酸桿菌種子液OD600nm急劇增加，菌體代謝旺盛，處于對(duì)數(shù)期，此時(shí)對(duì)丙酸桿菌進(jìn)行誘變處理效果較好。

圖1　丙酸桿菌生長(zhǎng)曲線Fig.1　The growth curve of Propionibacterium shermaii H1310

2.2NTG濃度對(duì)丙酸桿菌致死率的影響由圖2可知，丙酸桿菌對(duì)NTG比較敏感，當(dāng)NTG濃度為0.1 mg/mL時(shí)致死率已達(dá)到62.20%，隨著NTG添加量的增大，致死率不斷增加，當(dāng)體系中NTG濃度為0.4 mg/mL時(shí)致死率達(dá)98.07%。

圖2　NTG濃度對(duì)致死率的影響Fig.2　Effects of different NTG concentrations on lethality rate

2.3突變菌株篩選方法的建立采用“1.2.6”的雙層平板法進(jìn)行菌株篩選。圖3中菌落A在菌膜覆蓋后四周出現(xiàn)抑菌圈，菌落B在菌膜覆蓋后四周沒有出現(xiàn)抑菌圈。抑菌圈的出現(xiàn)表明單菌落抑菌活性的增加。NTG誘變后通過菌膜覆蓋初篩的方法就可能迅速找到提高抑菌活性的單菌落。這是一個(gè)簡(jiǎn)單、快速的初篩方法。

2.4雙層平板篩選方法的驗(yàn)證NTG誘變后篩選出38株有明顯抑菌圈的菌株，進(jìn)行進(jìn)一步的發(fā)酵。經(jīng)測(cè)定，出發(fā)菌株抑菌活性平均值為(19.90±0.97)AU/mL，復(fù)篩菌株抑菌活性平均值為(23.27±3.62)AU/mL，可見復(fù)篩菌株抑菌活性在0.05水平顯著高于出發(fā)菌株。同時(shí)，對(duì)突變菌株進(jìn)行統(tǒng)計(jì)。由表1可知，與出發(fā)菌株相比，有22株菌的抑菌活性提高10%以上，為正突變，有5株菌的抑菌活性降低10%以上，為負(fù)突變，有11株菌的抑菌活性與出發(fā)菌株相差小于±10%。在篩選到的菌株中，正突變占57.89%，負(fù)突變占13.16%，而且通過初篩篩選的菌株抑菌活性確實(shí)高于對(duì)照，表明這一初篩方法是快速、有效的。

注：A.出現(xiàn)抑菌圈的情況;B.沒有出現(xiàn)抑菌圈的情況。Note:A.The appearance of inhibition zone; B.None of inhibition zone.圖3　初篩結(jié)果Fig.3　The results of first screening

表1　突變菌株統(tǒng)計(jì)結(jié)果

注：紅線為出發(fā)菌株抑菌活性的均值。Note:The red line stands for mean of the original strains’ antibacterial activities.圖4　 雙層平板法篩選結(jié)果Fig.4 The screening results of the double-layers plate method

圖5　 NTG110605與出發(fā)菌株抑菌活性的比較Fig.5　The comparison of antibacterial activities between NTG110605 and the original strain

2.5丙酸桿菌篩選結(jié)果從3 564個(gè)單菌落中挑出87株突變菌，進(jìn)行抑菌活力的檢測(cè)。由圖4可知，突變菌株中抑菌活性高于出發(fā)菌株的共有59株，其中代謝物抑菌活性高于30 AU/mL的菌株有5株，抑菌活性分別達(dá)到31.28、30.38、31.68、32.43、32.43 AU/mL，分別比出發(fā)菌株提高了56.87%、52.35%、58.87%、62.63%、62.63%。

2.6突變菌株與出發(fā)菌株的比較由圖5可知，發(fā)酵進(jìn)行至第6天突變菌株NTG110605代謝物抑菌活性明顯高于出發(fā)菌株，抑菌活性最高達(dá)(28.30±2.47)AU/mL，比出發(fā)菌株提高43.87%，差異在0.05水平顯著。

圖6　NTG110605遺傳穩(wěn)定性試驗(yàn)結(jié)果Fig.6　The experimental results of genetic stability of the mutant NTG110605

2.7突變菌株遺傳穩(wěn)定性菌株NTG110605連續(xù)傳代5次，檢測(cè)每代菌株發(fā)酵上清液的抑菌活性。由圖6可知，經(jīng)過5次傳代后的菌株NTG110605發(fā)酵上清液的抑菌活性變化不大，維持在30 AU/mL左右?？梢?，菌株NTG110605的

此，人們對(duì)這些根瘤菌的基因組學(xué)進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)這些根瘤菌基因組之間的差異是非常有必要的。野生大豆(Glycinesoja)含有很好的遺傳物質(zhì)，可以用于抗病或抗環(huán)境壓力型大豆的育種。研究野生大豆和費(fèi)氏中華根瘤菌菌株之間的共生關(guān)系可以促進(jìn)大豆種植的可持續(xù)發(fā)展。

費(fèi)氏菌株是一種宿主范圍非常廣泛的根瘤菌，能夠與不同的豆科植物形成定型和非定型根瘤菌。HH103作為費(fèi)氏菌株的模式菌株，為研究快生型根瘤菌的不同基因?qū)采饔卯a(chǎn)生的影響提供便利手段，為微生物肥料產(chǎn)業(yè)的發(fā)展提供科學(xué)依據(jù)。

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Screening ofPropionibacteriumshermaniiStrains with High Production Antibacterial Metabolites by NTG Mutation

HE Xin-zhou1,ZHA Dong-feng2,HUANG Han-feng2,GAO Hong-liang1*et al (1.School of Life Sciences,East China Normal University,Shanghai 200241; 2.Economic Crops Center of Shangqiu Agriculture Bureau,Shangqiu,Henan 476000)

Abstract[Objective] To improve the antibacterial activity of the metabolite ofPropionibacteriumshermaniiand lay a foundation for the industrial production of the metabolite.[Method] This research usedPropionibacteriumshermaniiH1310 as the original strain,through nitrosoguanidine(NTG) mutagenesis,using the double-layer plate screening method to screen the mutant strains.The strains which were surrounded by clear inhibition zone were cultivated and measured the antibacterial activity.[Result] The optimal concentration of NTG was 0.3 mg/mL,for the lethality rate was 90.69%.87 strains chosen from 3 564 strains were fermented again.A high antibacterial metabolites stain NTG110605 was selected and its antibacterial activity reached (28.30±2.47) AU/ mL,which was 43.87% higher than the original strain.[Conclusion] The experimental methods of mutation breeding ofPropionibacteriumshermaniiis confirmed and a strain which produced more antibacterial substances is obtained.

Key wordsNitrosoguanidine mutation;Propionibacteriumshermanii; Double-layers plate screening method; Antibacterial activity

收稿日期2015-12-18

作者簡(jiǎn)介何新舟(1990- )，女，河南信陽人，碩士研究生，研究方向：微生物育種。* 通訊作者，副教授，碩士生導(dǎo)師，從事食品及發(fā)酵方面的研究。

基金項(xiàng)目質(zhì)檢公益性項(xiàng)目(201310255)。

中圖分類號(hào)S 188+.4

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼A

文章編號(hào)0517-6611(2016)02-018-03