劉玉鳳，劉丹陽，高青，劉國元，曾文姣

復(fù)旦大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院病理系，上海 200032

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PA-MSHA引起注射局部急性炎癥及白細胞介素17、腫瘤壞死因子α和Toll樣受體4的表達改變

劉玉鳳，劉丹陽，高青，劉國元，曾文姣

復(fù)旦大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院病理系，上海 200032

摘要：為研究皮下注射銅綠假單胞菌甘露糖敏感血凝菌毛株(Pseudomonasaeruginosamannose sensitive hemagglutinin，PA-MSHA)注射液后局部組織的病理學(xué)改變及白細胞介素17(interleukin 17，IL-17)、腫瘤壞死因子α(tumor necrosis factor α，TNF-α)和Toll樣受體4(Toll-like receptor 4，TLR4)表達情況，將30只小鼠隨機分為兩組，分別皮下注射PA-MSHA和生理鹽水，在注射后6、12、24、48及72 h取注射局部組織，蘇木精-伊紅(hematoxylin-eosin，HE)染色后觀察病理形態(tài)改變，并用免疫組化染色和圖像分析檢測IL-17、TNF-α和TLR4表達水平。結(jié)果顯示，小鼠皮下注射PA-MSHA后，在給藥部位引起以中性粒細胞浸潤為主的急性炎癥；局部炎癥灶中IL-17、TNF-α和TLR4表達在注射后6 h升高，24 h達到高峰，然后逐漸減低，至72 h實驗組與對照組無差異；3種炎癥因子的表達與炎癥反應(yīng)程度相平行。結(jié)果表明，皮下注射PA-MSHA能引起局部組織急性炎癥反應(yīng)，且能改變局部免疫狀態(tài)。

關(guān)鍵詞：銅綠假單胞菌甘露糖敏感血凝菌毛株；白細胞介素17；腫瘤壞死因子α；Toll樣受體4

銅綠假單胞菌甘露糖敏感血凝菌毛株(Pseudomonasaeruginosamannose sensitive hemagglutinin, PA-MSHA)是一種生物工程技術(shù)制備的新型銅綠假單胞菌滅活制劑，該菌株周身密布MSHA型菌毛[1-2]。銅綠假單胞菌又稱綠膿桿菌，在自然界中分布廣泛，存在于水、土壤、空氣、人和動物機體皮膚及腸道中[3]。菌毛是微生物表面所帶的纖細而短小的發(fā)樣微絲，具有多種成分和功能，參與致病性微生物黏附感染過程，有很強的免疫原性。MSHA型菌毛能引起人或動物紅細胞發(fā)生血凝，且該血凝現(xiàn)象能被D-甘露糖抑制。MSHA型菌毛具有較其他型菌毛恒定的遺傳編碼、蛋白組成、氨基酸序列，以及分子大小不等的菌毛素亞單位，廣泛存在于多個不同種屬的細菌[4]。我國微生物學(xué)者牟希亞借鑒銅綠假單胞菌菌體毒性低、有誘導(dǎo)生成干擾素和分裂原及抗癌活性、能刺激多克隆B細胞和Th細胞的特征，首次于1984年從臨床標本中篩選出一株MSHA陽性銅綠假單胞菌，經(jīng)過一年多的傳代，增強并保持其MSHA性質(zhì)，建成一株新型“PA-MSHA菌毛株”。由此菌株制成的疫苗，對多種能形成MSHA菌毛株的細菌感染有顯著的交叉保護作用及交叉血清學(xué)反應(yīng)[5-6]。 PA-MSHA還能作為免疫調(diào)節(jié)劑，調(diào)節(jié)機體細胞免疫和體液免疫，增強機體抗感染和抗腫瘤能力[7-10]。

目前PA-MSHA作為臨床藥物，用于包括乳腺癌、膀胱癌、肺癌等多種惡性腫瘤的輔助治療。體內(nèi)外實驗證實PA-MSHA能抑制腫瘤生長、抗腫瘤轉(zhuǎn)移和延長生存期[11-14]，對其作用機制的研究方興未艾。目前對該藥物引起的注射部位局部組織病理學(xué)改變及免疫因子表達水平報道甚少。本研究旨在探討皮下注射PA-MSHA后引起局部組織的病理學(xué)改變及白細胞介素17(interleukin 17，IL-17)、腫瘤壞死因子α(tumor necrosis factor α，TNF-α)和Toll樣受體4(Toll-like receptor 4，TLR4)的表達情況，闡明其對局部組織的影響，為評估局部用藥安全提供實驗依據(jù)。

1材料與方法

1.1動物實驗

6~8周齡雄性BALB/c小鼠30只(上海斯萊克實驗動物有限公司)，體重30~35 g，隨機分為兩組，分別在頸背部皮膚注射1 mL生理鹽水或PA-MSHA(北京萬特爾生物制藥有限公司)。注射后6、12、24、48及72 h每組各處死3只小鼠。

1.2取材、制片及染色

取注射點半徑0.5 cm左右的皮膚及皮下組織，固定于10%甲醛溶液。常規(guī)制作石蠟組織塊，4 μm連續(xù)切片，蘇木精-伊紅(hematoxylin-eosin，HE)染色。

1.3免疫組化染色

切片脫蠟后，去內(nèi)源性過氧化物酶(0.9% H2O2-甲醇溶液)，抗原修復(fù)(0.01 mol/L檸檬酸緩沖液，pH 6.0，微波8 min)，正常羊血清(1∶20)封閉。加1∶50稀釋第一抗體(兔抗小鼠IL-17、兔抗TLR4和兔抗鼠TNF-α，均購自Abcam公司，貨號分別為ab24674、ab47093和ab34674)，37 ℃孵育1 h，4 ℃過夜。次日，加即用型第二抗體(羊抗兔IgG-HRP，Santa Cruze公司，sc-2004；或羊抗鼠/抗兔IgG-HRP，Invitrogen公司，Lot1573394)，37 ℃孵育0.5 h。二甲氨基偶氮苯(dimethylaminoazobenzene，DAB)顯色(Dako公司)，蘇木精襯染。Tris-HCl緩沖液(Tris-HCl buffered saline, TBS)做空白對照。

1.4圖像分析及統(tǒng)計分析

每張切片選取5個陽性染色最強的400倍視野，用i-Solution軟件(IMT i-Solution Inc.)進行圖像分析，計算陽性平均光密度×陽性面積%。統(tǒng)計各組陽性平均光密度×陽性面積%，計算平均值及標準差。運用SPSS10.0軟件進行統(tǒng)計分析，組間差異采用t檢驗。

2結(jié)果

2.1局部病理變化

生理鹽水注射后，在各時間點皮下組織中均未見炎癥細胞浸潤。PA-MSHA皮下注射后6 h，即可見局部以中性粒細胞為主的炎癥細胞浸潤。注射后12、24 h炎癥反應(yīng)達高峰，大量中性粒細胞浸潤，形成較寬的炎癥細胞聚集帶。48 h炎癥反應(yīng)有所減輕，炎癥細胞聚集帶變窄。72 h炎癥細胞聚集帶消失，但皮下組織中有較多散在分布的炎癥細胞(圖1)。

A: No inflammation in subcutaneous tissue 24 h after normal saline injection; B-F: Representative photographs of subcutaneous tissue 6 h, 12 h, 24 h, 48 h and 72 h after PA-MSHA injection, respectively. A neutrophil-dominated inflammation appeared 6 h after PA-MSHA injection (arrows) (B); 12 h and 24 h after PA-MSHA injection, a large amount of neutrophil infiltration formed wide inflammatory cell accumulation zones (arrows) (C, D). 48 h after PA-MSHA injection, the inflammatory cell accumulation zones narrowed (arrows), and the peripheral inflammatory cells reduced (arrows) (E). 72 h after PA-MSHA injection, the inflammatory cell accumulation zones disappeared, and a small number of inflammatory cells scattered in subcutaneous tissue (arrows) (F).

圖1皮下注射后局部病理學(xué)改變

Fig.1Pathological changes of local tissues after administration of PA-MSHA

2.2IL-17、TNF-α和TLR4表達情況

對照組注射點皮下組織在各時間點均未有IL-17、TNF-α和TLR4陽性細胞。實驗組IL-17陽性細胞出現(xiàn)在PA-MSHA注射后6 h的炎癥病灶內(nèi)，注射后12、24 h的炎癥聚集帶內(nèi)有較多陽性細胞，48 h后陽性細胞減少，72 h后僅可見散在分布的陽性細胞表達。實驗組TNF-α陽性細胞分布范圍和變化趨勢類似于IL-17，但染色更強，陽性細胞數(shù)量更多。TLR4陽性細胞在注射PA-MSHA后6 h的皮下組織內(nèi)即可見；注射后12、24、48 h陽性細胞數(shù)增多，分布于炎癥聚集帶及周圍區(qū)域；72 h后有散在陽性細胞分布于皮下組織內(nèi)(圖2)。

圖像定量分析結(jié)果顯示，與對照組比較，PA-MSHA注射后6 h局部組織中IL-17、TNF-α和TLR4表達升高(P<0.01)；12、24 h后繼續(xù)升高，3種炎癥因子表達水平高峰均在注射后24 h；48 h后表達水平有所下降，但依然高于對照組(P<0.01)；注射后72 h，3種炎癥因子的表達在實驗組與對照組之間的差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.01)(圖3~5)。3種炎癥因子表達水平的變化與炎癥反應(yīng)程度相一致。

3討論

PA-MSHA的有效物質(zhì)基礎(chǔ)是MSHA菌毛上的甘露糖結(jié)合蛋白，能特異性地結(jié)合高甘露糖表達型的腫瘤細胞，具有直接殺傷腫瘤、抑制腫瘤侵襲和轉(zhuǎn)移的作用[1-2]。PA-MSHA還具有廣譜高效價跨越菌屬的免疫原性，能誘導(dǎo)機體免疫，提高機體免疫應(yīng)答水平，起到免疫監(jiān)視、抑制和殺傷癌細胞的作用[7-10]。

PA-MSHA用于腫瘤輔助治療時，傳統(tǒng)給藥方式為皮下注射，此外還有術(shù)中局部噴灑、胸/腹腔注射及針對膀胱腫瘤的膀胱灌注等給藥方式[11-13]。相較于其他化療藥物，患者對PA-MSHA的耐受性較好。但也有文獻報道PA-MSHA皮下注射可導(dǎo)致注射局部皮膚的紅腫熱痛及硬結(jié)(發(fā)生率100%)，其次是高熱、寒戰(zhàn)(發(fā)生率43.3%)[14]。因此，對藥物接觸區(qū)域局部病理變化和免疫相關(guān)細胞因子的研究，有助于評估藥物的安全性。

First row, representative photographs of subcutaneous tissue 24 h after normal saline (NS) injection. Second to sixth row, representative photographs of subcutaneous tissue 6 h, 12 h, 24 h, 48 h and 72 h after PA-MSHA injection, respectively. Arrows show positive cells (brown in color).

圖2IL-17、TNF-α和TLR4免疫組化染色

Fig.2Immunohistochemical staining of IL-17, TNF-α and TLR4

Expression levels of IL-17 in local tissues at 6 h, 12 h, 24 h, 48 h and 72 h after injection of normal saline(□) and PA-MSHA(■), determined by image analysis of IL-17 stained sections.*P<0.01 compared with the control group.

圖3皮下注射后IL-17表達水平

Fig.3Expression levels of IL-17 after subcutaneous injection

Expression levels of TNF-α in local tissues at 6 h, 12 h, 24 h, 48 h and 72 h after injection of normal saline(□) and PA-MSHA(■), determined by image analysis of TNF-α stained sections.*P<0.01 compared with the control group.

圖4皮下注射后TNF-α表達水平

Fig.4Expression levels of TNF-α after subcutaneous injection

本實驗顯示，皮下注射PA-MSHA后，注射部位局部組織出現(xiàn)以中性粒細胞浸潤為主的急性炎癥，急性炎癥因子IL-17、TNF-α表達明顯提高。IL-17可由多種細胞分泌〔包括CD4+T細胞、中性粒細胞、自然殺傷細胞(natural killer，NK細胞)〕，具有強大的招募中性粒細胞和促進多種細胞進一步釋放炎癥因子的作用[15]。TNF-α是由激活的巨噬細胞產(chǎn)生的細胞因子，是機體受病毒、內(nèi)毒素脂多糖、細菌胞壁酰二肽及非特異性佐劑 (如卡介苗) 等

Expression levels of TLR4 in local tissues at 6 h, 12 h, 24 h, 48 h and 72 h after injection of normal saline(□) and PA-MSHA(■), determined by image analysis of TLR4 stained sections.*P<0.01 compared with the control group.

圖5皮下注射后TLR4表達水平

Fig.5Expression levels of TLR4 after subcutaneous injection

作用后產(chǎn)生最快且達峰最早的炎癥介質(zhì)[16]。這可以解釋臨床上藥物注射后造成局部皮膚紅腫熱痛及硬結(jié)的原因。但這種反應(yīng)在藥物注射后72 h消失，對機體的影響有限。

TLR家族是感受病原體入侵的一類模式識別受體，在已發(fā)現(xiàn)的11種TLR中，TLR4與革蘭陰性細菌及其內(nèi)毒素的識別和激活作用有關(guān)，在機體天然免疫過程中發(fā)揮重要作用[17]。本研究發(fā)現(xiàn)，PA-MSHA作為銅綠假單胞菌(革蘭陰性菌)減毒制劑，引起注射局部組織炎癥區(qū)TLR4表達升高，進一步佐證了PA-MSHA可通過TLR4發(fā)揮作用。

TLR4主要表達于骨髓來源的細胞，如巨噬細胞、樹突細胞、淋巴細胞及NK細胞等免疫細胞表面。TLR4與配體如內(nèi)毒素(外源性)、高遷移率族蛋白1(high mobility group box-1 protein，HMGB1)(內(nèi)源性)等的結(jié)合可活化下游多條信號通路(如MyD88、絲裂原相關(guān)蛋白)，誘導(dǎo)免疫反應(yīng)發(fā)生[18]。在抗腫瘤研究中，PA-MSHA能有效促進小鼠骨髓來源的樹突細胞成熟，由此樹突細胞誘導(dǎo)的活化T細胞對腫瘤細胞的殺傷效應(yīng)顯著增強[19]。進一步研究顯示，PA-MSHA通過TLR4介導(dǎo)樹突細胞促進T細胞反應(yīng)，減緩荷瘤(Lewis肺癌)小鼠腫瘤進展；PA-MSHA治療后，腫瘤部位T細胞數(shù)量增多、成熟樹突細胞增多[20]。作為機體屏障的皮膚組織內(nèi)亦含有樹突細胞[21]，但由于本研究未做特異性免疫組化染色標記樹突細胞，故目前還不能判斷局部TLR4陽性細胞是否包括皮膚內(nèi)的樹突細胞。

綜上所述，本研究顯示PA-MSHA引起皮下注射位點局部組織急性炎癥及IL-17、TNF-α表達升高，解釋了該藥物在臨床應(yīng)用中常見不良反應(yīng)的原因；而注射后72 h炎癥消失及這兩種炎癥因子表達下降，表明其對機體注射局部影響有限，用藥是安全的。同時，PA-MSHA引起局部給藥區(qū)域TLR4表達升高，顯示其作為免疫佐劑能改變局部免疫狀態(tài)。

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Corresponding author. ZENG Wenjiao, E-mail: wjzeng@fudan.edu.cn

·論著·

Pseudomonasaeruginosamannose sensitive hemagglutinin induced local acute inflammation in injected tissues

LIU Yufeng, LIU Danyang, GAO Qing, LIU Guoyuan, ZENG Wenjiao

Department of Pathology, School of Basic Medical Sciences, Fudan University, Shanghai 200032, China

Abstract:To study the pathological changes and expressions of interleukin 17 (IL-17), tumor necrosis factor α (TNF-α) and Toll-like receptor 4 (TLR4) in local tissues with administration ofPseudomonasaeruginosamannose sensitive hemagglutinin (PA-MSHA), 30 mice were randomly divided into two groups, and received subcutaneous injection of PA-MSHA and normal saline respectively. The local injection tissues were sectioned at 6, 12, 24, 48 and 72 h after injection, and the pathological changes and expressions of IL-17, TNF-α and TLR4 were detected by hematoxylin-eosin (HE) and immunohistochemical staining, and measured by image analysis. The results revealed that PA-MSHA caused acute inflammation with predominant neutrophil infiltration in the local injection tissues. In the inflammation lesions, the expression levels of IL-17, TNF-α and TLR4 were elevated at 6 h after injection, peaked at 24 h, then decreased gradually, and were comparable to the control group at 72 h. The expression levels of these three cytokines were consistent with the degree of inflammation. The data suggest that subcutaneous injection of PA-MSHA induces acute inflammation and changes the immunity state of local injection tissues.

Key words:Pseudomonasaeruginosamannose sensitive hemagglutinin; Interleukin 17; Tumor necrosis factor α; Toll-like receptor 4

收稿日期：(2015-12-17)

通信作者：曾文姣