章黎華，李貞，江岑，萬(wàn)穎蕾，彭奕冰

上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬瑞金醫(yī)院檢驗(yàn)科，上海 200025

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3種檢測(cè)艱難梭菌方法的臨床應(yīng)用評(píng)估

章黎華，李貞，江岑，萬(wàn)穎蕾，彭奕冰

上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬瑞金醫(yī)院檢驗(yàn)科，上海 200025

摘要：本研究旨在對(duì)3種檢測(cè)糞便樣本中艱難梭菌的方法進(jìn)行臨床應(yīng)用評(píng)估，為艱難梭菌的實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)提供參考。采用艱難梭菌毒素A/B(Clostridiumdifficiletoxins A and B，CDAB)酶聯(lián)免疫熒光檢測(cè)法、環(huán)絲氨酸-頭孢西丁-果糖瓊脂(cycloserin-cefoxitin-fructose agar,CCFA)常規(guī)培養(yǎng)法和顯色培養(yǎng)法(chromIDTM)同步檢測(cè)糞便樣本中的艱難梭菌，并對(duì)培養(yǎng)所得菌株進(jìn)行tcdB基因擴(kuò)增以驗(yàn)證其產(chǎn)毒性。以艱難梭菌培養(yǎng)聯(lián)合tcdB基因擴(kuò)增為參考方法，分別計(jì)算上述3種方法的靈敏度、特異度、陽(yáng)性預(yù)測(cè)值和陰性預(yù)測(cè)值等參數(shù)，分析其與參考方法的一致性。研究共收集臨床糞便樣本164份，參考方法檢測(cè)結(jié)果為58份陽(yáng)性，106份陰性。經(jīng)統(tǒng)計(jì)分析，艱難梭菌毒素A/B法的靈敏度、特異度、陽(yáng)性預(yù)測(cè)值和陰性預(yù)測(cè)值分別為51.7%、95.3%、85.7%和78.3%，CCFA常規(guī)培養(yǎng)法分別為72.4%、98.1%、95.5%和86.7%，而艱難梭菌顯色培養(yǎng)法分別為94.8%、92.5%、87.3%和97.0%。3種方法中，艱難梭菌顯色培養(yǎng)法與參考方法的一致性最高(Kappa=0.856)。采用該方法檢測(cè)糞便樣本中的艱難梭菌操作簡(jiǎn)便，成本經(jīng)濟(jì)，結(jié)果判斷直觀、準(zhǔn)確，具有較好的臨床應(yīng)用價(jià)值。

關(guān)鍵詞：艱難梭菌；檢測(cè)方法；靈敏度；特異度

艱難梭菌(Clostridiumdifficile，C.difficile)屬專(zhuān)性厭氧菌，是抗生素相關(guān)性腹瀉和偽膜性腸炎的主要病原體[1]。由于抗菌藥物頻繁使用，艱難梭菌感染已逐漸成為國(guó)內(nèi)外關(guān)注的醫(yī)療衛(wèi)生問(wèn)題[2-5]。腸道菌群失調(diào)與艱難梭菌感染密切相關(guān)，艱難梭菌通過(guò)產(chǎn)生毒素引起腸道炎癥、腸壁組織損傷而致病[6]，其主要致病毒素包括毒素A和毒素B。產(chǎn)毒株的毒素型別有A+B+型和A-B+型，A+B-型未見(jiàn)報(bào)道[7]。研究表明，毒素B在艱難梭菌致病過(guò)程中起主要作用[4]。

艱難梭菌的實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)是臨床診斷艱難梭菌感染的重要依據(jù)，但目前國(guó)內(nèi)尚缺乏標(biāo)準(zhǔn)的艱難梭菌檢測(cè)方案。本研究對(duì)艱難梭菌毒素A/B(C.difficiletoxins A and B，CDAB)酶聯(lián)免疫熒光檢測(cè)、艱難梭菌環(huán)絲氨酸-頭孢西丁-果糖瓊脂(cycloserine-cefoxitin-fructose agar，CCFA)常規(guī)培養(yǎng)和艱難梭菌顯色培養(yǎng)(chromogenic medium，chromIDTM)的檢測(cè)能力進(jìn)行評(píng)估，以期為艱難梭菌感染實(shí)驗(yàn)室診斷方法的建立提供有力參考和基礎(chǔ)。

1材料與方法

1.1樣本來(lái)源

收集2015年1月—2015年3月上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬瑞金醫(yī)院臨床送檢的疑似艱難梭菌感染患者的糞便樣本共164份。

1.2主要儀器與試劑

VIDAS全自動(dòng)免疫分析儀購(gòu)自法國(guó)生物梅里埃公司，GNP-9270型隔水式恒溫培養(yǎng)箱購(gòu)自上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司，ProFlexTMPCR系統(tǒng)購(gòu)自美國(guó)Life Technologies公司，Bio-Rad PowerPac 1000電泳儀購(gòu)自Bio-Rad公司，Tanon-4100全自動(dòng)數(shù)碼凝膠圖像分析系統(tǒng)購(gòu)自上海天能科技有限公司，艱難梭菌毒素A/B檢測(cè)試劑盒、chromIDTM艱難梭菌鑒定培養(yǎng)基和厭氧產(chǎn)氣袋購(gòu)自法國(guó)生物梅里埃公司，無(wú)水乙醇、CCFA培養(yǎng)基及添加試劑購(gòu)自英國(guó)Oxoid公司，聚合酶鏈反應(yīng)(polymerase chain reaction，PCR)試劑購(gòu)自生工生物工程(上海)股份有限公司，引物合成和測(cè)序由上海英駿生物技術(shù)有限公司完成。

1.3方法

1.3.1艱難梭菌毒素A/B檢測(cè)按艱難梭菌毒素A/B檢測(cè)試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作，用VIDAS全自動(dòng)免疫分析儀通過(guò)酶聯(lián)免疫熒光法檢測(cè)糞便樣本中的艱難梭菌毒素蛋白A和B，根據(jù)試劑盒給定的cut-off值判讀結(jié)果。

1.3.2艱難梭菌常規(guī)培養(yǎng)取約300 mg或300 μL糞便樣本與等體積無(wú)水乙醇振蕩混勻，室溫靜置1 h；用無(wú)菌棉簽蘸取上述預(yù)處理的樣本上清液，密涂法接種于CCFA艱難梭菌選擇培養(yǎng)基，37 ℃厭氧培養(yǎng)48 h。典型的艱難梭菌菌落特點(diǎn)為顏色灰白、扁平干燥、邊緣粗糙，并伴有馬臭味。

1.3.3艱難梭菌顯色培養(yǎng)將糞便樣本用無(wú)水乙醇預(yù)處理后，立即接種于chromIDTM艱難梭菌鑒定培養(yǎng)基，37 ℃厭氧培養(yǎng)24 h。艱難梭菌能產(chǎn)β葡萄糖苷酶，與培養(yǎng)基中的顯色底物作用可呈現(xiàn)灰黑色菌落，并具備常規(guī)培養(yǎng)法的其他菌落特點(diǎn)，據(jù)此可進(jìn)行檢測(cè)和鑒定。

1.3.4艱難梭菌tcdB基因擴(kuò)增對(duì)上述兩種方法培養(yǎng)所得的菌株，采用簡(jiǎn)化堿裂解法抽提細(xì)菌DNA，并進(jìn)行艱難梭菌毒素B編碼基因tcdB的PCR擴(kuò)增。引物序列為NK104(5′-GTGTAG-CAATGAAAGTCCAAGTTTACGC-3′)和NK105 (5′-CACTTAGCTCTTTGATTGCTGCACCT-3′)，反應(yīng)體系和條件參考本課題組曾用方法[8]。tcdB基因擴(kuò)增產(chǎn)物長(zhǎng)度為204 bp，產(chǎn)物經(jīng)1.5%瓊脂糖凝膠電泳后，進(jìn)行測(cè)序驗(yàn)證。由于艱難梭菌產(chǎn)毒株均能分泌毒素B，故可利用tcdB基因擴(kuò)增對(duì)菌株的產(chǎn)毒性進(jìn)行檢測(cè)。

1.4數(shù)據(jù)分析

本研究采用3種方法同步檢測(cè)每份糞便樣本中的艱難梭菌，并對(duì)培養(yǎng)所得菌株進(jìn)行tcdB基因擴(kuò)增。以艱難梭菌培養(yǎng)聯(lián)合tcdB基因擴(kuò)增為參考方法，若同一份樣本用艱難梭菌CCFA培養(yǎng)基或顯色培養(yǎng)基檢出tcdB基因陽(yáng)性菌株，則判為艱難梭菌感染(陽(yáng)性)；若兩種培養(yǎng)法均無(wú)細(xì)菌生長(zhǎng)或培養(yǎng)所得細(xì)菌未檢出tcdB基因，則判為非艱難梭菌感染(陰性)。采用SPSS 16.0軟件對(duì)測(cè)試方法與參考方法的一致性進(jìn)行Kappa分析，并計(jì)算靈敏度、特異度、陽(yáng)性預(yù)測(cè)值和陰性預(yù)測(cè)值等參數(shù)，評(píng)估3種方法的正確率。

2結(jié)果

本研究收集的164份糞便樣本中，用參考方法檢出58份陽(yáng)性，106份陰性。而采用艱難梭菌毒素A/B檢測(cè)法、CCFA常規(guī)培養(yǎng)法和艱難梭菌顯色培養(yǎng)法分別檢出陽(yáng)性35、44和63份，其中對(duì)應(yīng)的真陽(yáng)性(參考方法結(jié)果也為陽(yáng)性)分別為30、42和55份。3種方法與參考方法對(duì)艱難梭菌的檢測(cè)結(jié)果比較見(jiàn)表1。經(jīng)Kappa檢驗(yàn)分析3種方法與參考方法的一致性，得Kappa值分別為0.516、0.746和0.856，表明艱難梭菌顯色培養(yǎng)法與參考方法的一致性最高，其次是CCFA常規(guī)培養(yǎng)法，而艱難梭菌毒素A/B檢測(cè)法與參考方法的一致性較低。

計(jì)算3種方法的靈敏度、特異度、陽(yáng)性預(yù)測(cè)值、陰性預(yù)測(cè)值、陽(yáng)性似然比、陰性似然比和約登指數(shù)，結(jié)果詳見(jiàn)表2。

表13種測(cè)試方法與參考方法檢測(cè)艱難梭菌的結(jié)果比較

Tab.1Comparison of three test methods with the reference method in detection ofC.difficile

(a)CDABReferencemethodPositiveNegativeTotalPositive30535Negative28101129Total58106164(b)CCFAReferencemethodPositiveNegativeTotalPositive42244Negative16104120Total58106164(c)chromIDTMReferencemethodPositiveNegativeTotalPositive55863Negative398101Total58106164

表23種艱難梭菌測(cè)試方法的診斷學(xué)參數(shù)

Tab.2Diagnostic parameters of three test methods forC.difficile

ParameterTestmethodCDABCCFAchromIDTMSensitivity0.5170.7240.948Specificity0.9530.9810.925Positivepredictivevalue0.8570.9550.873Negativepredictivevalue0.7830.8670.970Positivelikelihoodratio10.96638.37912.565Negativelikelihoodratio0.5070.2810.056Youdenindex0.4700.7050.873

3討論

近年來(lái)，艱難梭菌已成為醫(yī)院內(nèi)感染的主要病原體之一，其實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)對(duì)臨床診斷具有重要價(jià)值。經(jīng)2010年美國(guó)醫(yī)療保健流行病學(xué)學(xué)會(huì)和感染性疾病學(xué)會(huì)的臨床實(shí)踐指南推薦，艱難梭菌感染的實(shí)驗(yàn)室診斷標(biāo)準(zhǔn)為：糞便中檢出產(chǎn)毒型艱難梭菌或其毒素，或組織病理學(xué)證實(shí)為假膜性腸炎[9]。歐美國(guó)家對(duì)艱難梭菌感染的實(shí)驗(yàn)室診斷已日漸成熟，但目前國(guó)內(nèi)開(kāi)展艱難梭菌常規(guī)檢測(cè)的臨床實(shí)驗(yàn)室還不多，且尚未建立起公認(rèn)的較權(quán)威的參考方法和診斷標(biāo)準(zhǔn)。

常見(jiàn)的艱難梭菌實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)方法包括細(xì)菌培養(yǎng)法、免疫法、分子生物學(xué)方法等[10-13]。細(xì)菌培養(yǎng)法利用傳統(tǒng)微生物學(xué)技術(shù)，可直接培養(yǎng)獲得病原體；但無(wú)法判斷菌株的產(chǎn)毒性，且耗時(shí)較長(zhǎng)，厭氧培養(yǎng)條件相對(duì)嚴(yán)格。免疫法主要有酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA)或酶免疫分析法(enzyme immunoassay，EIA)，通過(guò)檢測(cè)艱難梭菌分泌的谷氨酸脫氫酶(glutamate dehydrogenase，GDH)或毒素蛋白來(lái)判斷樣本中艱難梭菌的存在，操作方便，能在幾小時(shí)內(nèi)得到結(jié)果；但免疫反應(yīng)的影響因素較多，存在假陽(yáng)性和假陰性。PCR則是從基因水平進(jìn)行檢測(cè)，靈敏度和特異度較高；但需特定的儀器和配套試劑，如Cepheid公司研發(fā)的GeneXpert實(shí)時(shí)熒光定量PCR法[14]?？紤]到成本問(wèn)題及操作上的技術(shù)要求，PCR目前尚未成為臨床常用的艱難梭菌檢測(cè)方法。此外，也有報(bào)道表明多種方法聯(lián)合使用可提高對(duì)艱難梭菌的檢測(cè)效能[15]。

本研究將細(xì)菌培養(yǎng)聯(lián)合tcdB基因擴(kuò)增作為艱難梭菌檢測(cè)的參考方法，通過(guò)同步接種兩種培養(yǎng)基以提高檢出率，進(jìn)一步用PCR擴(kuò)增tcdB基因?qū)ζD難梭菌的產(chǎn)毒性進(jìn)行驗(yàn)證，同時(shí)提高檢測(cè)的特異度，故該參考方法具有較好的檢驗(yàn)效能。經(jīng)過(guò)與參考方法比對(duì)，發(fā)現(xiàn)3種方法中艱難梭菌顯色培養(yǎng)法靈敏度最高，為94.8%，其次為CCFA常規(guī)培養(yǎng)法，而艱難梭菌毒素A/B檢測(cè)法靈敏度較低。這可能是因?yàn)槠D難梭菌毒素A/B檢測(cè)法與另外兩種細(xì)菌培養(yǎng)法不同，檢測(cè)的是毒素蛋白，由于樣本的保存與運(yùn)送條件不當(dāng)?shù)仍斐傻鞍捉到饣蚩乖儺?，從而影響免疫反?yīng)結(jié)果；當(dāng)然也不排除存在非產(chǎn)毒型艱難梭菌，其能通過(guò)培養(yǎng)法檢出，但不產(chǎn)生毒素蛋白。另一方面，3種方法均顯示出較高的特異度(>90%)，其中CCFA常規(guī)培養(yǎng)法特異度高達(dá)98.1%，陽(yáng)性預(yù)測(cè)值為95.5%，表明其對(duì)艱難梭菌陽(yáng)性樣本的檢測(cè)能力較強(qiáng)，且誤診率相對(duì)較低，但其陰性預(yù)測(cè)值低于艱難梭菌顯色培養(yǎng)法，存在一定的漏診率。

由于測(cè)試方法的陽(yáng)性和陰性預(yù)測(cè)值受檢測(cè)人群患病率的影響，進(jìn)一步比較3種方法的似然比。結(jié)果顯示，三者的陽(yáng)性似然比均較高，即其用于診斷艱難梭菌感染的正確率較高。而3種方法的陰性似然比差異較大，艱難梭菌顯色培養(yǎng)法僅為0.056，而艱難梭菌毒素A/B檢測(cè)法和CCFA常規(guī)培養(yǎng)法均為其5倍以上。陰性似然比越小，表明該實(shí)驗(yàn)排除患病的正確率越高。故相比之下，艱難梭菌顯色培養(yǎng)法對(duì)排除艱難梭菌感染具有較高的篩選價(jià)值，而另外兩種方法不適用于艱難梭菌感染的篩選。綜合3種測(cè)試方法的診斷學(xué)參數(shù)，艱難梭菌顯色培養(yǎng)法的靈敏度和特異度均較高，約登指數(shù)為0.873，具有較好的疾病診斷和篩選能力。

隨著臨床艱難梭菌感染率逐步升高，實(shí)驗(yàn)室快速準(zhǔn)確檢測(cè)艱難梭菌顯得尤為關(guān)鍵。采用艱難梭菌顯色培養(yǎng)法檢測(cè)艱難梭菌操作方法較簡(jiǎn)便，結(jié)果判斷直觀，雖然具有一定的局限性，但比艱難梭菌常規(guī)培養(yǎng)法耗時(shí)短，較免疫法和PCR成本低，且準(zhǔn)確率高，在臨床輔助診斷艱難梭菌感染中具有良好的應(yīng)用價(jià)值。

參考文獻(xiàn)

[1]Cristina ML, Spagnolo AM, Sartini M, Panatto D, Perdelli F. Clostridium difficile infections: an emerging problem in healthcare facilities [J/OL]. Rev Med Microbiol, 2012, 23(4): 67-75. http://journals.lww.com/revmedmicrobiol/Abstract/2012/10000/Clostridium_difficile_infections_an_emerging.2.aspx.

[2]Burke KE, Lamont JT. Clostridium difficile infection: a worldwide disease [J]. Gut Liver, 2014, 8(1): 1-6.

[3]Dong D, Zhang L, Chen X, Jiang C, Yu B, Wang X, Peng Y. Antimicrobial susceptibility and resistance mechanisms of clinical Clostridium difficile from a Chinese tertiary hospital [J]. Int J Antimicrob Agents, 2013, 41(1): 80-84.

[4]Madan R, Petri WA Jr. Immune responses to Clostridium difficile infection [J]. Trends Mol Med, 2012, 18(11): 658-666.

[5]Di Bella S, Capone A, Musso M, Giannella M, Tarasi A, Johnson E, Taglietti F, Campoli C, Petrosillo N. Clostridium difficile infection in the elderly [J]. Infez Med, 2013, 21(2): 93-102.

[6]Voth DE, Ballard JD. Clostridium difficile toxins: mechanism of action and role in disease [J]. Clin Microbiol Rev, 2005, 18(2): 247-263.

[7]Carter GP, Rood JI, Lyras D. The role of toxin A and toxin B in the virulence of Clostridium difficile [J]. Trends Microbiol, 2012, 20(1): 21-29.

[8]章黎華，董丹鳳，江岑，彭奕冰.院內(nèi)感染艱難梭菌的毒素檢測(cè)及核糖體分型研究 [J].上海交通大學(xué)學(xué)報(bào)(醫(yī)學(xué)版)，2012，32(11)：1436-1439.

[9]Cohen SH, Gerding DN, Johnson S, Kelly CP, Loo VG, McDonald LC, Pepin J, Wilcox MH; Society for Healthcare Epidemiology of America; Infectious Diseases Society of America. Clinical practice guidelines for Clostridium difficile infection in adults: 2010 update by the Society for Healthcare Epidemiology of America (SHEA) and the Infectious Diseases Society of America (IDSA) [J]. Infect Control Hosp Epidemiol, 2010, 31(5): 431-455.

[10]Swindells J, Brenwald N, Reading N, Oppenheim B. Evaluation of diagnostic tests for Clostridium difficile infection [J]. J Clin Microbiol, 2010, 48(2): 606-608.

[11]de Jong E, de Jong AS, Bartels CJM, van der Rijt-van den Biggelaar C, Melchers WJG, Sturm PDJ. Clinical and laboratory evaluation of a real-time PCR for Clostridium difficile toxin A and B genes [J]. Eur J Clin Microbiol Infect Dis, 2012, 31(9): 2219-2225.

[12]Wang YH, Atreja A, Wu XR, Lashner BA, Brzezinski A, Shen B. Similar outcomes of IBD inpatients with Clostridium difficile infection detected by ELISA or PCR assay [J]. Dig Dis Sci, 2013, 58(8): 2308-2313.

[13]Han SB, Chang J, Shin SH, Park KG, Lee GD, Park YG, Park YJ. Performance of chromID Clostridium difficile agar compared with BBL C. difficile selective agar for detection of C. difficile in stool specimens [J]. Ann Lab Med, 2014, 34(5): 376-379.

[14]陳旭，董丹鳳，韓立中，倪語(yǔ)星.GeneXpert實(shí)時(shí)熒光定量PCR快速檢測(cè)艱難梭菌的臨床評(píng)估 [J].檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)，2014(6)：590-592, 580.

[15]Novak-Weekley SM, Marlowe EM, Miller JM, Cumpio J, Nomura JH, Vance PH, Weissfeld A. Clostridium difficile testing in the clinical laboratory by use of multiple testing algorithms [J]. J Clin Microbiol, 2010, 48(3): 889-893.

Corresponding author. WAN Yinglei, E-mail: 178085200@qq.com

·論著·

Clinical evaluation of three methods in detection ofClostridiumdifficilein stool

ZHANG Lihua, LI Zhen, JIANG Cen, WAN Yinglei, PENG Yibing

Department of Laboratory Medicine, Ruijin Hospital, Shanghai Jiao Tong University School of Medicine, Shanghai 200025, China

Abstract:This study aims to evaluate the clinical performance of three methods in the detection ofClostridiumdifficile(C.difficile) in stool samples. Clinical samples were subjected to enzyme-linked fluorescence assay forC.difficiletoxins A and B (CDAB), conventional bacterial cultivation using cycloserine-cefoxitin-fructose agar (CCFA) and cultivation by chromogenicC.difficileidentification medium (chromIDTM), respectively. A combination of bacterial culture and amplification of thetcdBgene was selected as the standard reference method for the evaluation. A total of 164 clinical stool samples were collected, of which 58 had positive results by the reference method whilst the rest 106 were negative. The CDAB method showed a sensitivity, specificity, positive predictive value and negative predictive value of 51.7%, 95.3%, 85.7% and 78.3%, respectively, while the corresponding values of the CCFA method turned out to be 72.4%, 98.1%, 95.5% and 86.7%, respectively. The chromIDTMmethod gave corresponding values of 94.8%, 92.5%, 87.3% and 97.0%, respectively. Among the three methods, chromIDTMmethod had the best consistency with the reference method (Kappa=0.856). It is concluded that chromIDTMis a simple and cost-effective method for the detection ofC.difficilein stool samples, which can present easy-to-judge results and has a preferable value in clinical application.

Key words:Clostridiumdifficile; Detection method; Sensitivity; Specificity

收稿日期：(2015-07-16)

通信作者：萬(wàn)穎蕾

基金項(xiàng)目：國(guó)家自然科學(xué)基金(81371873), 上海市科學(xué)技術(shù)委員會(huì)基礎(chǔ)研究重大項(xiàng)目(12JC1406100)