董麗輝， 李佳葉

(浙江醫(yī)藥高等?？茖W(xué)校，浙江寧波 315100)

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延齡草愈傷組織的誘導(dǎo)及植株再生

董麗輝， 李佳葉

(浙江醫(yī)藥高等?？茖W(xué)校，浙江寧波 315100)

摘要[目的]建立延齡草愈傷組織誘導(dǎo)、增殖和分化再生體系。[方法]以延齡草塊根、根尖為外植體，應(yīng)用正交試驗方法設(shè)計植物生長調(diào)節(jié)劑組合和質(zhì)量濃度配比，研究植物生長調(diào)節(jié)劑對延齡草愈傷組織形成、增殖和分化的影響。[結(jié)果]1/2MS是最適合延齡草塊根、根尖誘導(dǎo)愈傷的培養(yǎng)基，添加6-BA 1.2 mg/L和IAA 0.6 mg/L的1/2MS培養(yǎng)基最適合于愈傷組織的誘導(dǎo)，其中以根尖愈傷組織的誘導(dǎo)效果最好，在添加6-BA 0.5 mg/L、IAA 0.6 mg/L的培養(yǎng)基中，愈傷組織的分化率最高，附加6-BA 1.2 mg/L、IAA 1.0 mg/L的1/2MS培養(yǎng)基為生根適宜培養(yǎng)基。[結(jié)論]延齡草的塊莖和根尖外植體在適宜的激素組合中均可通過愈傷組織途徑分化出不定芽，繼而得到正常生長、發(fā)育的再生植株。

關(guān)鍵詞延齡草；愈傷組織；誘導(dǎo)；植株再生

延齡草 (TrilliumtschonoskiiMaxim.)別名頭頂一顆珠、芋兒七，是百合科多年生草本植物，是神農(nóng)架的四大名藥之一[1]，生于海拔1 000~3 200 m陰濕處, 在我國主要產(chǎn)地是湖北省的神農(nóng)架、恩施和宜昌等地。 延齡草根莖含薯蕷皂素、葉片含黃酮類化合物[2]等有效成分, 具殺菌、止血、解毒等功效, 主治頭暈?zāi)垦?、高血壓、神?jīng)衰弱癥, 是傳統(tǒng)名貴中藥之一。延齡草的種子休眠期長,自然繁殖系數(shù)低, 由于多年的掠奪式采挖，森林采伐過度, 破壞了林下延齡草生長的環(huán)境，使得野生的數(shù)量急劇減少，瀕臨滅絕邊緣，已被國家列為三級保護植物[3]。延齡草種群生態(tài)位寬度非常狹小, 種群生境獨特[4-5], 異地栽培繁殖非常困難, 只能采取就地保護措施。對于延齡草的組織培養(yǎng)從20世紀(jì)90年代就已有報道，但成效甚微，并未成規(guī)?；囵B(yǎng)，該研究試圖探索延齡草的組織培養(yǎng)繁殖技術(shù),以期為延齡草繁殖方法的改良及該藥用植物的保護和利用提供科學(xué)依據(jù)。

1材料與方法

1.1試驗材料2012年9月,以延齡草(TrilliumtschonoskiiMaxim.)的塊根及根尖為材料進行愈傷組織誘導(dǎo)試驗。延齡草整株采自浙江省西天目山海拔1 220 m的山坡上，帶土挖取,置于塑料營養(yǎng)缽內(nèi)帶回實驗室。

1.2儀器與試劑SW-CJ-2FD潔凈工作臺(蘇凈集團蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司)；GXZ型智能培養(yǎng)箱(寧波東南儀器有限公司)；MLS-3780高壓蒸汽滅菌器(三洋電機株式會社)。植物生長調(diào)節(jié)劑萘乙酸(NAA)、6-芐氨基嘌呤(6-BA)、吲哚乙酸(IAA)、激動素(KT)等試驗所用試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.3試驗方法

1.3.1外植體消毒。將采集的健康延齡草塊根先用流水沖掉表面浮土, 再用洗潔精浸泡15 min, 流水沖洗3 h后, 用吸水紙吸取所帶的水分轉(zhuǎn)入無菌燒杯，移入超凈工作臺，用9種不同的滅菌方法處理(表1)。取出材料，無菌水震蕩沖洗7次。在無菌條件下，將消毒處理好的外植體塊根和根尖切成0.5 cm×0.5 cm左右，每個處理5瓶，每瓶接種3個外植體，重復(fù)3次，分別接種于1/2MS培養(yǎng)基上。培養(yǎng)溫度為(20±2)℃，光照強度3 100~3 400 lx，光照時間12 h/d，相對濕度控制在80%。每天觀察，記錄染菌情況。對試驗中成活率和污染率的結(jié)果進行直觀分析，確定延齡草外植體最佳滅菌方案。

1.3.2愈傷組織誘導(dǎo)。以1/2MS為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，附加不同激素6-BA、NAA、IAA，按不同的質(zhì)量濃度組合添加6-BA(1.0、1.2、4.0 mg/L)、NAA(0、0.5、1.0 mg/L)、 IAA(0.6、1.0、2.0 mg/L)(表2)。滅菌前將培養(yǎng)基pH調(diào)至6.0，常規(guī)法滅菌。將消毒好的外植體置于超凈工作臺上，每個處理5瓶，每瓶接種3個外植體，重復(fù)處理3次。外植體置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，培養(yǎng)溫度為(20±2)℃，光照強度3 100~3 400 lx，光照時間12 h/d，相對濕度控制在80%。每天觀察誘導(dǎo)愈傷組織的情況。愈傷組織誘導(dǎo)率= 誘導(dǎo)出愈傷組織的外植體數(shù)/接種外植體數(shù)×100%。

1.3.3愈傷組織繼代與增殖。采用L9(34)正交試驗設(shè)計，考慮到影響增殖的因素主要有細(xì)胞分裂素6-BA和KT,生長素為IAA。試驗設(shè)計中以1/2MS為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，外加30 g/L蔗糖,pH為6.0。因素水平安排如表3所示，每個處理10瓶，每瓶接種3個樣，重復(fù)3次。以22 d為周期，統(tǒng)計增殖系數(shù)及生長狀況等。增殖系數(shù)=增殖后重量/接種時重量。

1.3.4愈傷組織分化不定芽及生長。以MS(1、1/2、1/4)、6-BA(0.5、1.2、4.0 mg/L) 、IAA(0.6、1.0、2.0 mg/L)進行3因素3水平試驗。每個處理10瓶，每瓶接種3個樣，重復(fù)3次。以22 d為周期，觀察并統(tǒng)計其分化生長狀況。

1.3.5壯苗生根培養(yǎng)。以1/2MS為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，附加不同激素6-BA、IAA，按不同的質(zhì)量濃度組合添加6-BA(1.2、1.0、4.0 mg/L)、IAA(0.6、1.0、2.0 mg/L)。每個處理5瓶，每瓶接種3個外植體，重復(fù)處理3次，分別接種于目標(biāo)培養(yǎng)基上。定期觀測材料的生長情況，30 d后觀察生根率。

2結(jié)果與分析

2.1外植體無菌培養(yǎng)體系的建立延齡草塊根和根尖在培養(yǎng)基中培養(yǎng)2周后，記錄試驗結(jié)果并統(tǒng)計數(shù)據(jù)。從表1可看出，延齡草塊根及根尖滅菌效果最好的依次是方案3、6，塊根污染率分別為2.7%、10.9%，根尖污染率分別為11.7%、9.8%；成活率最高的依次是方案3、6，塊根成活率分別為97.3%、89.1%；根尖成活率分別為88.3%、95.2%。綜合污染率、成活率兩方面因素，方案3即用30%次氯酸鈉浸泡2 min ，再用0.1%HgCl2浸泡12 min對延齡草塊根的滅菌效果最好；方案6即用30%次氯酸鈉浸泡4 min，再用0.1%HgCl2浸泡12 min對延齡草根尖的滅菌效果最好。

表1　外植體的表面消毒

2.2不同培養(yǎng)基對愈傷組織誘導(dǎo)率的影響以延齡草塊根和根尖為外植體，研究生長調(diào)節(jié)劑對延齡草愈傷組織誘導(dǎo)率的影響。由表2可知，不同的激素水平組合對誘導(dǎo)率的影響差異較大，延齡草的塊莖和根尖均能誘導(dǎo)出愈傷組織，對不同激素誘導(dǎo)產(chǎn)生的愈傷組織的數(shù)量、顏色和質(zhì)地進行觀測發(fā)現(xiàn)，根尖、塊根在1/2MS+6-BA 1.2 mg/L+IAA 0.6 mg/L+蔗糖30 g/L+瓊脂6.5 g/L培養(yǎng)基上愈傷組織產(chǎn)量最高，其中塊根誘導(dǎo)率為95.66%，根尖誘導(dǎo)率為94.44%，愈傷組織顏色為黃青色，質(zhì)地致密，質(zhì)量較好(圖1)。根據(jù)延齡草的愈傷誘導(dǎo)率極差分析發(fā)現(xiàn)，IAA、NAA 和6-BA 3因素對延齡草愈傷組織誘導(dǎo)的影響均不顯著，但影響程度略有差異，影響最大的是6-BA 因素，其次是IAA因素，影響最小的為NAA因素。

表2　不同培養(yǎng)基對愈傷組織誘導(dǎo)率的影響

圖1　延齡草的愈傷組織誘導(dǎo)Fig.1　The callus induction of Trilliumts chonoskii Maxim.

2.3愈傷組織繼代與增殖培養(yǎng)從表3可以看出，不同生長調(diào)節(jié)劑對增殖的影響，在6-BA濃度為0.5 mg/L的培養(yǎng)基上，延齡草愈傷組織增殖倍數(shù)普遍較低，基本不增殖，大部分愈傷組織逐漸變白并死亡，6-BA濃度在2.0 mg/L時，延齡草愈傷組織增殖倍數(shù)平均為2.34，但愈傷組織培養(yǎng)到20 d左右也會出現(xiàn)逐漸變白并死亡的現(xiàn)象，可見6-BA的濃度對延齡草愈傷組織繼代培養(yǎng)影響顯著。

根據(jù)延齡草愈傷繼代培養(yǎng)的極差分析(表3)發(fā)現(xiàn)，愈傷組織在1/2MS+1.0 mg/L 6-BA+1.0 mg/L IAA+7.0 g/L瓊脂的培養(yǎng)基上的增殖效果最好，增殖數(shù)達(dá)3.99。極差值R分析結(jié)果表明，6-BA、IAA、KT對增殖數(shù)的影響主次為6-BA > IAA>KT。篩選出延齡草愈傷組織增殖與繼代培養(yǎng)的配方為1/2MS+1.0 mg/L 6-BA+1.0 mg/L IAA+蔗糖30 g/L+7.0 g/L瓊脂。

表3不同培養(yǎng)基對延齡草愈傷組織增殖的影響

Table 3Effects of culture medium on callus proliferation ofTrilliumtschonoskiiMaxim.

試驗號TestNo.6-BAmg/LIAAmg/LKTmg/L增殖倍數(shù)Proliferationrate12.00.602.3422.01.00.52.5832.01.01.02.1240.50.60.50.9850.51.01.01.1460.51.000.8771.00.61.02.5681.01.003.9991.01.00.51.87均值1Meanvalue12.3471.9602.400均值2Meanvalue20.9972.5701.810均值3Meanvalue32.8071.6201.940極差RangeR1.8100.9500.590

2.4不同激素對愈傷組織分化不定芽及生長的影響 將生長狀況良好且基本一致的愈傷組織轉(zhuǎn)移到分化培養(yǎng)基上，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在分化培養(yǎng)基中培養(yǎng)15 d 后，愈傷組織表面出現(xiàn)黃青色突起；20 d 產(chǎn)生芽點，30 d 長芽(圖2)，50 d 芽長有2～3 片葉。60 d后統(tǒng)計結(jié)果(表4)可見，對延齡草愈傷組織分化的最優(yōu)培養(yǎng)基是1/2MS+IAA 0.6 mg/L+6-BA 0.5 mg/L,分化率高達(dá)88.95%。極差值R分析結(jié)果表明，MS、IAA、6-BA 3個因素對延齡草愈傷組織分化的影響率大小為MS基本培養(yǎng)基>6-BA>IAA。綜合分化不定芽的長勢和健壯度，篩選出最佳分化培養(yǎng)基為1/2MS+ IAA 0.6 mg/L +6-BA 0.5 mg/L +6.5 g/L瓊脂+蔗糖30 g/L。

圖2　延齡草愈傷組織分化Fig.2　The callus differentiation of Trilliumts chonoskii Maxim.

試驗號TestNo.MS6-BAmg/LIAAmg/L分化率Differentiationrate∥%110.51.023.45211.20.624.78314.02.033.4741/20.50.688.9551/21.22.067.5661/24.01.076.4571/40.52.013.1181/41.21.019.8791/44.00.67.89均值1Meanvalue127.23341.83739.923均值2Meanvalue277.65337.40340.540均值3Meanvalue313.62339.27038.047極差RangeR64.0304.4342.493

2.5不同因素對延齡草生根培養(yǎng)的影響將分化不定芽接種到6種不同培養(yǎng)基上，30 d后統(tǒng)計結(jié)果得出1/2MS為最好的壯苗生根培養(yǎng)基(圖3)。以1/2MS為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，對IAA、6-BA 2種生長調(diào)節(jié)劑進行正交試驗，結(jié)果(表5)發(fā)現(xiàn)，苗健壯和生根率高的培養(yǎng)基為1/2MS+IAA 1.0 mg/L+6-BA 1.2 mg/L+瓊脂6.8 g/L+蔗糖30 g/L。

圖3　延齡草叢生苗Fig.3　The plantlets of Trilliumts chonoskii Maxim.

編號TestNo.培養(yǎng)基Culturemedium生根率Rootingrate∥%11/2MS+IAA0.5mg/L+6-BA1.2mg/L75.5421/2MS+IAA1.0mg/L+6-BA1.2mg/L98.4931/2MS+IAA0.5mg/L+6-BA2.0mg/L57.6641/2MS+IAA1.0mg/L+6-BA2.0mg/L66.7051/2MS+IAA1.0mg/L23.3361/2MS+IAA1.0mg/L45.59

3結(jié)論與討論

該試驗以優(yōu)良延齡草野生植株塊根和根尖為外植體，從外植體滅菌開始，到愈傷組織誘導(dǎo)、分化不定芽，再到生根培養(yǎng)，成功地完成了延齡草再生體系的建立，篩選出最適合的愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基為1/2MS+6-BA 1.2 mg/L+IAA 0.6 mg/L+蔗糖30 g/L+瓊脂6.5 g/L，且愈傷的誘導(dǎo)率可達(dá)95.66%。另外該研究從延齡草愈傷組織的增殖、分化、叢生苗的生根等方面對延齡草再生體系各個環(huán)節(jié)進行了較系統(tǒng)的研究，結(jié)果表明，延齡草的塊根和根尖均可以誘導(dǎo)出愈傷組織，且能分化成叢生苗，但從愈傷的增殖培養(yǎng)過程中發(fā)現(xiàn)延齡草的愈傷組織培養(yǎng)到30 d左右會出現(xiàn)褐化嚴(yán)重的現(xiàn)象，愈傷組織的增殖倍數(shù)僅有3.99，對延齡草愈傷組織的增殖培養(yǎng)還有待進一步的研究。該研究證明組織培養(yǎng)是延齡草繁殖的一個有效途徑，可以使延齡草野生資源得到有效保護。

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Callus Induction and Plant Regeneration ofTrilliumtschonoskiiMaxim.

DONG Li-hui ,LI Jia-ye(Zhejiang Pharmaceutical College,Ningbo,Zhejiang 315100)

Abstract[Objective]To establish the regeneration system of callus induction, proliferation and differentiation ofTrilliumtschonoskiiMaxim.. [Method]Tuber and root tip ofTrilliumtschonoskiiMaxim. were used as the explants,the composition and quality concentration ratio of plant growth regulators were designed by orthogonal experiment,the effects of plant growth regulators on callus formation, proliferation and differentiation ofTrilliumtschonoskiiMaxim. were studied.[Result]1/2MS was a suitable culture medium of tuber and root tip ofTrilliumtschonoskiiMaxim..1/2MS Medium added with 6-BA 1.2 mg/L and IAA 0.6 mg/L was suitable for callus induction,the optimal examples were root tip.In medium added with 6-BA 0.5 mg/L and IAA 0.6 mg/L, the differentiation rate of callus was the highest.1/2MS Medium added with 6-BA 1.2 mg /L, IAA 1.0 mg /L was suitable for rooting.[Conclusion]Tubers and root tip explants ofTrilliumtschonoskiiMaxim.could be differentiated adventitious buds by callus pathway in suitable hormone combination,and then get the normal growth and development of plant regeneration.

Key wordsTrilliumtschonoskiiMaxim.; Callus;Induction;Plant Regeneration

收稿日期2015-12-14

作者簡介董麗輝(1978- )，女，浙江衢州人，副教授，碩士，從事生物技術(shù)制藥研究。

基金項目浙江省大學(xué)生科技創(chuàng)新項目(2013R433004)。

中圖分類號S 567.23+9

文獻(xiàn)標(biāo)識碼A

文章編號0517-6611(2016)02-135-04