聶麗敏　王琳琳　劉　杰　高　薇　林文俐　喬　麗　孫玉萍

(泰山醫(yī)學(xué)院，山東　泰安　271016)

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FOXC1蛋白在食管鱗狀細(xì)胞癌中的表達(dá)及臨床意義

聶麗敏王琳琳劉杰高薇林文俐喬麗1孫玉萍

(泰山醫(yī)學(xué)院，山東泰安271016)

〔摘要〕目的探討FOXC1蛋白在食管鱗狀細(xì)胞癌(ESCC)中的表達(dá)及其與腫瘤的病理類型、分化程度、TNM分期和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移等臨床病理特征之間的相關(guān)性。方法采用免疫組化法分別檢測FOXC1在94例ESCC組織及47例癌旁正常組織中的表達(dá)，并結(jié)合臨床病理學(xué)參數(shù)進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析。結(jié)果FOXC1蛋白陽性表達(dá)主要定位于ESCC細(xì)胞的胞質(zhì),少數(shù)同時定位于胞核；ESCC及癌旁正常組織中Foxc1陽性表達(dá)率有顯著差異(P=0.000)；FOXC1在ESCC低分化組(96.7%)、T3+T4期組(90.3%)及淋巴結(jié)陽性組(95.0%)的陽性表達(dá)率均明顯高于相應(yīng)的中高分化組(75.0%)、T1+T2組(71.4%)和淋巴結(jié)陰性組(72.2%)，P值分別為0.011、0.018和0.005；而與性別、年齡等無明顯相關(guān)性(P均>0.05)。結(jié)論FOXC1的高表達(dá)可能在ESCC的發(fā)生發(fā)展及侵襲轉(zhuǎn)移過程中發(fā)揮重要作用。

〔關(guān)鍵詞〕FOXC1；食管鱗狀細(xì)胞癌；上皮間充質(zhì)轉(zhuǎn)化

1山東大學(xué)附屬濟(jì)南市中心醫(yī)院腫瘤科

第一作者：聶麗敏(1984-)，女，碩士在讀，主要從事腫瘤基礎(chǔ)研究。

我國是世界上食管癌的高發(fā)國家，食管癌校正死亡率居世界首位〔1〕。然而，大部分食管鱗狀細(xì)胞癌(ESCC)患者對現(xiàn)有的治療手段不敏感，疾病控制率低，患者難以獲得滿意的生活質(zhì)量，總體生存期短。以往研究表明，F(xiàn)OXC1從上皮間充質(zhì)轉(zhuǎn)化(EMT)、細(xì)胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)和血管內(nèi)皮細(xì)胞形成等多方面影響腫瘤細(xì)胞的分裂、增殖和侵襲轉(zhuǎn)移能力，其高表達(dá)和腫瘤的發(fā)生發(fā)展及侵襲轉(zhuǎn)移關(guān)系密切〔2~6〕，但有關(guān)FOXC1在ESCC中表達(dá)的研究國內(nèi)外仍尚未有報道。本研究探討FOXC1的表達(dá)在食管鱗癌發(fā)生發(fā)展過程中可能的作用機制及臨床意義。

1材料與方法

1.1標(biāo)本的采集 收集濟(jì)南市中心醫(yī)院病理科2008年1月至2012年12月術(shù)后病理均診斷為ESCC的存檔組織蠟塊94例，患者均為首次手術(shù),術(shù)前均未接受任何的化療、放療及生物靶向治療等治療，均有詳細(xì)的臨床資料。同時選取47例癌旁正常組織(距離癌組織5 cm 以上)，經(jīng)病理證實均未見癌細(xì)胞。94例ESCC患者，男81例，女13例；年齡44~81歲，中位年齡為62歲；伴有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者40例；TNM分期按2009年國際抗癌聯(lián)盟(UICC)修訂的標(biāo)準(zhǔn)：T1+T2期42例，T3+T4期52例；Ⅰ+Ⅱ期57例，Ⅲ+Ⅳ期37例；依據(jù)病理分化程度分為：高分化鱗癌15例，中分化鱗癌49例，低分化鱗癌30例。本研究獲得醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn)，并遵循患者知情同意的原則。

1.2試劑試劑：羊抗兔FOXC1多克隆抗體購自英國Abcam公司，Max Vision兔抗羊多克隆抗體及DAB顯色試劑盒均購自福建邁新生物技術(shù)有限公司。其余常用免疫組化試劑略。

1.3檢測方法采用免疫組織化學(xué)法進(jìn)行石蠟?zāi)[瘤組織抗原檢測。所有腫瘤組織標(biāo)本均經(jīng)10%甲醛固定，石蠟包埋，連續(xù)3~4 μm切片。切片烤片后常規(guī)脫蠟至水?？乖贓DTA中高壓修復(fù)2 min，磷酸鹽緩沖液(PBS)沖洗3次，每次3 min，采用3%過氧化氫10 min阻斷內(nèi)源性過氧化物酶，蒸餾水沖洗1次，3 min，PBS沖洗2次，每次3 min，滴加一抗(50 μl/張)，4℃孵育過夜，37℃復(fù)溫30 min，PBS沖洗3次，每次5 min，滴加Max Vision二抗室溫孵育15 min，DAB顯色，蘇木素復(fù)染，梯度酒精脫水，二甲苯透明，中性樹膠封片。用已知的陽性組織作陽性對照，用PBS代替一抗作陰性對照。

1.4結(jié)果判斷具有正高職稱的病理科醫(yī)師3名雙盲閱片，光鏡下每張切片隨機取20個高倍鏡(400倍)，記錄每個視野下1 000個細(xì)胞中陽性著色細(xì)胞數(shù)，計算陽性百分率后取其平均值。FOXC1蛋白陽性表現(xiàn)為胞質(zhì)或胞核黃色或棕黃色顆粒，記錄陽性細(xì)胞比率：陽性細(xì)胞1%~30%計1分，30%~60%計2分，>60%計3分，細(xì)胞染色強度：0分為未著色，淺黃色為1分，黃色至棕黃色為2分，棕黃色為3分。然后記錄二者的乘積，<3分為低表達(dá)，≥3分為高表達(dá)，即陽性表達(dá)。

1.5統(tǒng)計學(xué)方法采用SPSS18.0軟件進(jìn)行χ2檢驗。

2結(jié)果

2.1ESCC組織和癌旁正常組織FOXC1的表達(dá)情況ESCC組織中FOXC1蛋白表達(dá)主要位于腫瘤細(xì)胞質(zhì)和部分細(xì)胞核，呈黃色或棕黃色顆粒；癌旁正常對照組織中幾乎無FOXC1的表達(dá)，或僅在少數(shù)細(xì)胞核中有低水平的表達(dá)，呈淺黃色顆粒。見圖1。ESCC組織中FOXC1陽性表達(dá)率顯著高于正常對照組〔89.1%(77/94) vs 25.5%(12/47),χ2=42.791,P=0.000〕。

ESCC胞質(zhì)陽性表達(dá)

ESCC胞質(zhì)及胞核陽性表達(dá)

癌旁正常組織陽性表達(dá)

2.2FOXC1蛋白的表達(dá)與臨床病理參數(shù)間的相關(guān)性FOXC1在ESCC低分化組、T3+T4期組及淋巴結(jié)陽性組的陽性表達(dá)率均明顯高于相應(yīng)的中高分化組、T1+T2組和淋巴結(jié)陰性組(P=0.011、0.018、0.005)；而與性別、年齡等無明顯相關(guān)性(P均>0.05)。見表1。

表1　FOXC1蛋白陽性表達(dá)與臨床病理參數(shù)的關(guān)系〔n(%)〕

3討論

轉(zhuǎn)錄因子是一類通過調(diào)控靶基因表達(dá)從而影響細(xì)胞、組織或器官的生長、發(fā)育、分化、代謝等一系列的生物學(xué)過程的關(guān)鍵性蛋白。叉頭框(FOX)轉(zhuǎn)錄因子是一類從酵母等低等生物到人類等高等真核生物中普遍存在的一種重要的轉(zhuǎn)錄因子，目前FOX轉(zhuǎn)錄因子超家族根據(jù)DNA結(jié)合區(qū)的同源性差異從A到S共分為19個亞族，100多個FOX家族成員。FOX轉(zhuǎn)錄因子的DNA結(jié)合區(qū)稱之為“叉頭區(qū)”由100個氨基酸組成，核心部分由3個α螺旋排列構(gòu)成，兩側(cè)通過β鏈連接了兩個環(huán)狀結(jié)構(gòu)。由于其空間結(jié)構(gòu)特點，又被稱為翼狀螺旋蛋白〔7〕。FOX轉(zhuǎn)錄因子在生物體胚胎的生長發(fā)育、生物代謝、免疫調(diào)節(jié)等方面都發(fā)揮重要作用，其突變或表達(dá)異常與發(fā)育畸形、代謝性疾病、腫瘤、免疫異常等密切相關(guān)〔7〕。

FOXC1為FOX轉(zhuǎn)錄因子家族的一員，它的編碼基因位于人染色體6p25基因編碼區(qū)〔8〕，其基因突變或表達(dá)異常與動物胚胎發(fā)育異常、人類Axenfeld-Rieger 綜合征的發(fā)生密切相關(guān)〔9,10〕。在多種惡性腫瘤組織中，如乳腺癌、子宮內(nèi)膜癌、原發(fā)性肝癌等，F(xiàn)OXC1的異常表達(dá)也被報道與腫瘤細(xì)胞的增殖、侵襲轉(zhuǎn)移密切相關(guān)，是腫瘤患者預(yù)后差的標(biāo)志〔2~6〕。本研究首次檢測分析了FOXC1在ESCC中的表達(dá)情況，結(jié)果發(fā)現(xiàn)FOXC1在ESCC組織中的表達(dá)明顯高于正常組織，并且與ESCC的分化程度、T分期及區(qū)域淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移關(guān)系密切相關(guān)，分化程度越低、腫瘤負(fù)荷越大和有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者表達(dá)更高，提示FOXC1高表達(dá)在ESCC的發(fā)生發(fā)展及侵襲轉(zhuǎn)移中可能發(fā)揮重要作用。

FOXC1被發(fā)現(xiàn)是腫瘤細(xì)胞EMT的重要調(diào)節(jié)因子〔4,11~13〕。EMT是指在轉(zhuǎn)錄因子Snail，Slug，Twist，Zeb1等作用下，細(xì)胞間黏附分子E-Cadherin丟失，基質(zhì)金屬蛋白酶(MMPs)等表達(dá)增加，上皮性腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)變?yōu)橛巫哌w徙能力更強的間充質(zhì)性細(xì)胞，從而使腫瘤細(xì)胞獲得更高的侵襲轉(zhuǎn)移能力。有研究發(fā)現(xiàn)：FOXC1在原發(fā)性肝細(xì)胞肝癌(HCC)中過表達(dá)不僅誘導(dǎo)轉(zhuǎn)錄因子Snail的表達(dá)上調(diào)促進(jìn)EMT，而且誘導(dǎo)E-cadherin的表達(dá)下調(diào)，從而增強HCC的侵襲及遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移；敲除FOXC1后，EMT會部分逆轉(zhuǎn)，細(xì)胞骨架發(fā)生重構(gòu)，MMP1,MMP2,MMP7,MMP9和血管內(nèi)皮生長因子-A(VEGF-A)的表達(dá)也隨之下調(diào)，最終導(dǎo)致HCC的增殖、侵襲及轉(zhuǎn)移能力均降低〔4,12〕。此外，研究證實緊密連接蛋白claudin呈低表達(dá)的乳腺癌中，F(xiàn)OXC1蛋白的過表達(dá)不但可獨立作為EMT的誘導(dǎo)劑，而且也可以上調(diào)EMT的轉(zhuǎn)錄因子Snail,Twist，TGF-β1等共同完成EMT的過程。由此可見，F(xiàn)OXC1的表達(dá)與Snail、MMPs等EMT促進(jìn)因子的表達(dá)呈正相關(guān)而與E-cadherin等EMT抑制因子的表達(dá)呈負(fù)相關(guān)，F(xiàn)OXC1也因此被視為腫瘤細(xì)胞發(fā)生EMT的正性調(diào)控分子。在ESCC中，多項研究證實存在 EMT轉(zhuǎn)錄因子Slug,Twist,Snail的過表達(dá)，同時E-cadherin的表達(dá)降低，是患者的預(yù)后不佳的提示〔14，15〕。而MMPs的過表達(dá)也被發(fā)現(xiàn)與ESCC的EMT及血管生成密切相關(guān)，在ESCC發(fā)生發(fā)展及侵襲轉(zhuǎn)移過程中也發(fā)揮了重要作用〔16〕。推測FOXC1在ESCC中的表達(dá)也可能通過調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄因子Snail、Slug、Twist，E-cadherin，MMPs或VEGF的表達(dá)而參與EMT,進(jìn)而促進(jìn)ESCC的發(fā)生發(fā)展及侵襲轉(zhuǎn)移，但是其中具體分子調(diào)節(jié)機制尚需研究進(jìn)一步證實。

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〔2014-05-19修回〕

(編輯安冉冉/曹夢園)

通訊作者：劉杰(1981-)，女，博士，主治醫(yī)師，主要從事腫瘤內(nèi)科及腫瘤基礎(chǔ)研究。

基金項目：濟(jì)南市青年科技明星計劃資助課題(No.20110321)

〔中圖分類號〕R735.1

〔文獻(xiàn)標(biāo)識碼〕A

〔文章編號〕1005-9202(2016)04-0796-03；doi：10.3969/j.issn.1005-9202.2016.04.011