冉雙飛， 陳 云， 姜于蘭*， 劉 洪

(1.貴州大學， 農(nóng)學院植物保護系， 貴州， 貴陽550025； 2.沿河自治縣泉壩鄉(xiāng)人民政府， 貴州 沿河 565313)

朱頂紅赤斑病病原菌鑒定

冉雙飛1， 陳 云1， 姜于蘭1*， 劉 洪2

(1.貴州大學， 農(nóng)學院植物保護系， 貴州， 貴陽550025； 2.沿河自治縣泉壩鄉(xiāng)人民政府， 貴州 沿河 565313)

為了對防治朱頂紅赤斑病提供理論基礎，結(jié)合形態(tài)學與分子生物學的方法，對觀賞性朱頂紅赤斑病進行病原菌鑒定。結(jié)果表明：葉片接種赤斑病菌2 d后開始發(fā)病，5 d后葉片上產(chǎn)生赤色小點，后逐漸擴大為圓形或橢圓形病斑，發(fā)病癥狀與田間癥狀相似，從發(fā)病葉片上分離得到的病原菌分生抱子形態(tài)及大小均與初種菌株相同；病原菌ITS測序所得序列與NCBI對比，該病原菌菌株與ColletotrichumgloeosporioidesstrainHT31菌株的同源性為99%；LSU測序所得序列與NCBI對比，該病原菌菌株與ColletotrichumgloeosporioidesstrainCZ043C菌株的同源性為99%。結(jié)論：引起朱頂紅赤斑病的病原菌為炭疽菌屬膠孢炭疽菌(Colletotrichumgloeosporioides)。

朱頂紅赤斑??； 病原菌鑒定

朱頂紅是極具觀賞和收藏價值的一種花卉，以稀奇高雅而倍受人們的青睞。近年來快速發(fā)展的朱頂紅產(chǎn)業(yè)已成為中國花卉業(yè)的重要組成部分，但由于病害的嚴重發(fā)生大大制約了朱頂紅產(chǎn)業(yè)的發(fā)展[1-3]。因此，了解朱頂紅病害的致病源對朱頂紅病害的防治有著極其重要的意義。危害朱頂紅的病害主要有葉枯病、紅斑病、病毒病、葉斑病、紫斑病、花葉病、線蟲病、細菌性軟腐病、鐮刀菌枯萎病等[4-5]。病原菌的鑒定方面前人多以形態(tài)學作為主要研究手段對病害進行描述，存在很大的局限性。因此，筆者等結(jié)合形態(tài)學與分子生物學的方法，對朱頂紅赤斑病的病原菌進行鑒定，為防治朱頂紅赤斑病提供理論基礎。

1 材料與方法

1.1 病原菌的采集、分離與回接

從盆栽的朱頂紅上采集病害標本，帶回實驗室進行處理與保存。

病原物的分離采用組織分離法[6]：于病健交界處剪下0.5 cm×0.5 cm的葉片若干，經(jīng)75%酒精消毒2～3 s，0.1%升汞消毒20～30 s，再經(jīng)無菌水漂洗3次，接于PDA平板培養(yǎng)基上，25℃培養(yǎng)2 d后純化。將純化后的菌株保存于裝有滅菌水的小管中，于4℃冰箱保存。

回接菌株按柯赫氏法則：摘取健康的朱頂紅葉片，用75%的酒精對其進行表面消毒，無菌水沖洗2～3次，用滅菌的接種針將葉片正面刺傷。用滅菌的打孔器沿培養(yǎng)5 d后的菌株周緣取直徑為0.5 cm的菌餅，菌絲面朝下接于葉片刺傷處，以刺傷不接菌餅的葉片作對照。將處理后的葉片置于滅菌的培養(yǎng)皿中，25℃光照培養(yǎng)箱中培養(yǎng)20 d，每天補充水分并觀察葉片發(fā)病情況。

1.2 病原的鑒定

病原的鑒定結(jié)合病原的形態(tài)學鑒定和分子鑒定進行。

形態(tài)學鑒定：將病原物接種于新鮮PDA平板上，置于25℃培養(yǎng)箱中光照培養(yǎng)20 d左右，其間觀察菌落生長情況，待產(chǎn)孢后挑取產(chǎn)孢結(jié)構(gòu)制片，于顯微鏡下觀察產(chǎn)孢器和孢子形態(tài)特征，測量產(chǎn)孢結(jié)構(gòu)和孢子大小。

分子鑒定：采用Biomiga公司生產(chǎn)的DNA提取試劑盒提取DNA。采用多聚核苷酸鏈式反應(PCR)的方法擴增核糖體RNA內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)(ITS)基因，ITS基因擴增使用的引物為ITS4和ITS5，由北京諾賽生物技術有限公司合成。參照Damm等[7]的研究，另選用引物LSU擴增DNA序列。所用引物由北京諾賽生物技術有限公司合成，擴增反應均在25 μL體系中進行，該體系含有如下成分：9.5 μL ddH2O，12.5 μL mix試劑，Primer-1和Primer-2各1 μL，DNA模板1 μL。PCR產(chǎn)物送北京諾賽公司測序。將得到的基因序列與NCBI基因庫中的序列進行對比，確定菌株分類地位。

2 結(jié)果與分析

2.1 病害癥狀及病原回接癥狀

朱頂紅赤斑病病菌混在病殘體中的菌核于土表越冬或越夏，主要侵害葉、莖及花部，葉片染病初期生赤色小點，后逐漸擴大為圓形或橢圓形斑，中央赤褐色略凹陷， 濃褐色稍隆起，病健部交界明顯，病斑布于葉兩面(圖1a)；莖或葉柄染病開始也現(xiàn)赤色小點，后擴展為邊緣深赤褐色條斑。葉片接種赤斑病菌2 d后開始發(fā)病，發(fā)病癥狀與田間癥狀相似，回接5 d后，葉片上產(chǎn)生赤色小點，后逐漸擴大為圓形或橢圓形斑(圖1b)。從發(fā)病葉片上可重新分離得到該病原菌,重新分離得到的病原菌的培養(yǎng)性狀，分生抱子形態(tài)及大小均與當初種菌株相同。確定該菌株即為病原。

圖1 朱頂紅赤斑病葉片自然發(fā)病癥狀(a)和 病原菌回接癥狀(b)

Fig.1 Symptoms of natural infection(a) and artificial infection(b) of amaryllis red spot disease

2.2 病原菌特征

炭疽菌屬(Colletotrichumgloeosporioides)病原經(jīng)PDA培養(yǎng)后，菌落呈圓形，初生菌絲為白色絨毛狀，隨時間推移逐漸變?yōu)椴灰?guī)則圓形菌落，菌絲底部逐漸變?yōu)榈S色，并產(chǎn)生黑色的小點(圖2a、b)。1周后產(chǎn)生分生孢子，分生抱子梗短線狀,單根無色，頂生1個分生孢子，分生抱子圓筒形或長橢圓形，兩端圓或一端略粗，直或稍彎，單孢無色，大小為3.7～6.2 μm×1.2～2.2 μm(圖2c)。

圖2 炭疽屬病原菌正面(a)、背面(b)及病原菌孢子(c)

2.3 病原菌測序結(jié)果

炭疽菌屬的ITS測序結(jié)果：

A，將所得序列與NCBI進行對比，該病原菌菌株與Colletotrichumgloeosporioidesstrain HT31菌株的同源性為99%，其登錄號為FJ455525。

炭疽菌屬的LSU測序結(jié)果：

AG，將所得序列與NCBI進行對比，該病原菌菌株與Colletotrichumgloeosporioidesstrain CZ043C菌株的同源性為99%，其登錄號為FJ755268。

3 結(jié)論與討論

朱頂紅赤斑病是花卉的病害之一，由于各種病害的制約，全球的花卉市場始終難以得到更大的發(fā)展。在已有報告中，花卉上病原菌的鑒定僅限于形態(tài)學，鑒定結(jié)果可能導致一定程度的誤差。目前國際上利用形態(tài)學與分子生物學相結(jié)合鑒定病原菌已成為一種趨勢[8]。綜合病原形態(tài)特征、ITS序列和LSU序列比對結(jié)果，將引起朱頂紅赤斑病的病原菌為炭疽屬膠孢炭疽菌(Colletotrichumgloeosporioides)。出現(xiàn)鑒定結(jié)果不一致的原因主要有兩方面：一是在此之前病原菌僅依據(jù)形態(tài)學進行鑒定不準確；二是該病害受各種因素的影響，病原菌發(fā)生了變異。而解決問題的方法可以通過多年的調(diào)查來判斷該病害是否屬于偶發(fā)病害，并結(jié)合形態(tài)學和分子生物學的手段對我國朱頂紅赤斑病的病原進行重新鑒定。

[1] 郭麗霞,莫 饒.朱頂紅育種研究現(xiàn)狀及進展[J].廣西農(nóng)業(yè)科學,2007(3):303-309.

[2] 李振堅,王 雁,彭鎮(zhèn)華,等.朱頂紅在全球花卉貿(mào)易中的地位及發(fā)展動態(tài)[J].中國農(nóng)學通報,2008(5):154-159.

[3] 于 玲.花卉病害診斷專家系統(tǒng)[D].武漢：華中農(nóng)業(yè)大學,2006.

[4] 王 賢,熊 敏,衛(wèi)尊征,等.朱頂紅研究綜述[J].農(nóng)業(yè)科技與信息(現(xiàn)代園林),2014(8):49-54.

[5] 陳少萍.朱頂紅栽培與病蟲害防治[J].中國花卉園藝,2014(16):32-34.

[6] 譚舒心.蜘蛛蘭褐斑病及其病原菌鑒定與病害的藥劑控制試驗[D].重慶：西南大學,2009.

[7] Damm U，Cannon P F，Woudenberg J H C，et al. The Colletotrichum boninense species complex [J].Studies in Mycology,2012,73:1-36.

[8] 賁海燕.我國北方主要花卉新病害及病原鑒定[D].哈爾濱：東北農(nóng)業(yè)大學,2008.

(責任編輯： 聶克艷)

Pathogenic Identification of Amaryllis Red Spot Disease

RAN shuangfei1， CHEN yun1， JIANG yulan1*， LIU hong2

(1.DepartmentofPlantPathology,AgricultureCollege,GuizhouUniversity,Guiyang,Guizhou550025; 2.People’sGovernmentofQuanbaTown,Yanhe,Guizhou565313,China)

Toprovide theoretical basis for prevention and control of amaryllis red spot disease, the methods of morphology and molecular biology were employed to identify the pathogenic bacteria. Results: After 2ndday of inoculation pathogen produced red leaf spot which changed into red spots after 5thday of inoculation and they regularly expanded to oval spots, these symptoms were similar to that in the fileds. The obtained pathogen conidia had shape and size similar to previous pathogen conidia; the obtained ITS sequence of concern pathogen had 99% similarity with the sequence obtained from NCBI and it was identical toColletotrichumgloeosporioidesstrain HT31.LSU sequence was also compared with NCBI sequences, and the pathogen strains were related toC.gloeosporioidesstrain CZ043C with 99% similarity. Conclusion: Amaryllis red spot disease was caused byC.gloeosporioides.

amaryllis red spot disease; pathogenic identification

2015-03-19； 2015-12-24修回

國家自然科學基金(31560489)

冉雙飛(1990-)，男，在讀碩士，研究方向：真菌分類及病害綜合防治。E-mail：520ranshuangfei@sina.com

*通訊作者：姜于蘭(1974-)，女，教授，博士，從事植物病害綜合防治，暗色絲孢真菌分類、分子系統(tǒng)學及真菌資源利用研究。 E-mail：yljchsd@163.com

1001-3601(2016)01-0020-0072-03

S436.8； S682.2+5

A