王雨辰， 練青平， 李 倩， 劉士力， 宓國強， 胡廷尖

(浙江省淡水水產(chǎn)研究所， 浙江 湖州 313001)

泥鰍二倍體和四倍體及其正反交F1的胚胎發(fā)育特征觀察

王雨辰， 練青平， 李 倩， 劉士力， 宓國強， 胡廷尖*

(浙江省淡水水產(chǎn)研究所， 浙江 湖州 313001)

為泥鰍多倍體育種及新品種的培育提供參考，在水溫為(26±0.5)℃條件下，對泥鰍(Misgurnusanguillicaudatus)二倍體、四倍體及其正反交F1的胚胎發(fā)育過程及發(fā)育特征進行觀察比較。結(jié)果表明:二倍體、四倍體、正交F1和反交F1受精卵分別經(jīng)過26.18 h、25.78 h、26.52 h和26.72 h孵化出膜，其發(fā)育過程和發(fā)育時序基本相同，受精發(fā)育經(jīng)過卵裂前期、卵裂期、囊胚期、原腸胚期、神經(jīng)胚期、器官形成期、孵化出膜期等階段，各發(fā)育分期除發(fā)育時間不同外，其發(fā)育特征和發(fā)育分期沒有明顯差異。二倍體、四倍體初孵仔魚體長分別為(2.56±0.121)mm和(3.145±0.277)mm,仔魚形態(tài)差別不大；正交F1仔魚和二倍體仔魚的形態(tài)特征基本相同，反交F1和四倍體仔魚基本相同。

泥鰍； 二倍體； 四倍體； 正反交； 胚胎發(fā)育

泥鰍(Misgurnusanguillicaudatus)隸屬于鯉形目(Cypriniformes)、鰍科(Cobitidae)、花鰍亞科(Cobitinae)、泥鰍屬(Misgurnus)[1]，其廣泛分布于我國各水系及附屬水域，棲息于稻田、河溝和池塘的底層，體型小，數(shù)量多，其肉質(zhì)細嫩，味道鮮美，營養(yǎng)豐富，具有一定的經(jīng)濟價值，素有“水中人參”的美譽[2]。近年來，由于捕撈強度過大和自然環(huán)境的惡化，泥鰍自然野生資源不斷減少，在全國掀起了養(yǎng)殖泥鰍熱潮，雖然商品泥鰍的養(yǎng)殖取得了一定成功，但是泥鰍的苗種培育技術一直難以達到泥鰍產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)要求。目前，有關泥鰍的研究主要在生物學特性、早期胚胎發(fā)育、人工繁殖技術、養(yǎng)殖技術、多倍體育種和遺傳基因等方面[3-18]，而有關泥鰍多倍體雜交育種及胚胎發(fā)育方面的研究鮮見報道。為探明泥鰍多倍體育種技術的可行性，筆者進行了泥鰍正常二倍體和四倍體的雜交研究，同時對二倍體、四倍體和正反交F1的胚胎發(fā)育進行觀察，比較其胚胎發(fā)育差異，以期為泥鰍的多倍體育種及新品種的培育提供參考。

1 材料與方法

1.1 親魚培育

二倍體泥鰍為購自浙江德清鐘管鎮(zhèn)附近河道的野生泥鰍，規(guī)格為15～20 g/尾；四倍體泥鰍為采集自湖北長湖荊州段的野生泥鰍，規(guī)格為15～20 g/尾，均為2齡以上。

1.2 受精卵的獲得及孵化條件

2014年6月5—6日選取性腺成熟度好，黏液較多，健壯、體表無傷的試驗泥鰍，采用絨毛膜促性腺激素(HCG)、促黃體素釋放激素類似物(LHRH-A2)和地歐酮(DOM)在濃度為7‰的生理鹽水中混合溶解制成催產(chǎn)試劑，進行人工催情。雌鰍每尾一次性注射0.5 mL，雄鰍劑量減半，后放入聚乙烯網(wǎng)箱中，用微流水進行刺激。待效應時間到達后，采用常規(guī)人工干法授精分別獲得二倍體、四倍體及二倍體和四倍體正反交F1的受精卵，分別將受精卵放入孵化桶中孵化，利用加熱棒控制水溫在(26.5±0.5)℃。

1.3 胚胎發(fā)育觀察

受精卵受精后在體視顯微鏡下對胚胎發(fā)育過程進行連續(xù)觀察，每次取50粒受精卵，以50%以上受精卵進入某個期記作該期的發(fā)育時間，并用CCD進行拍照。同時，胚胎每進入一個新的發(fā)育時期，取部分受精卵并用5%甲醛溶液進行固定，以便日后復查。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同時序胚胎發(fā)育特征

水溫在(26.5±0.5)℃條件下，二倍體、四倍體、正交F1和反交F1受精卵分別經(jīng)過26.18 h、25.78 h、26.52 h和26.72 h孵化出膜(表1)。根據(jù)胚胎發(fā)育特征，將泥鰍二倍體、四倍體和正反交F1的受精卵胚胎發(fā)育分為7個發(fā)育階段和26個發(fā)育分期，其發(fā)育分期的基本形態(tài)相似。

表 試驗泥鰍的胚胎發(fā)育時序

2.1.1 卵裂前期 二倍體和四倍體泥鰍受精卵為球形，卵膜透明，金黃色，微粘性(圖版-1、2)。正交F1和二倍體的受精卵大小一致，為(1.023±0.411)mm(圖版-3)。反交F1和四倍體的受精卵大小一致，為(1.35±0.037)mm(圖版-4)。受精卵的原生質(zhì)由植物極向動物極流動，并在動物極形成隆起，形狀似盤，此時進入胚盤期(圖版-5)。該階段各組胚胎發(fā)育形態(tài)相似，但是其發(fā)育速度不同，發(fā)育速度次序為四倍體>二倍體>反交F1>正交F1。

2.1.2 卵裂期 四倍體泥鰍受精卵受精后29 min開始卵裂，胚盤分裂成2個大小相等的分裂球，此后繼續(xù)分裂進入4細胞期、8細胞期、16細胞期、32細胞期、64細胞期(圖版-6～10)，隨著細胞繼續(xù)分裂，分裂球分裂越來越小，細胞分裂形狀似桑椹狀，此時進入桑椹期(圖版-11)。在此發(fā)育期內(nèi)，胚胎發(fā)育形態(tài)上差異不大，但時間有所區(qū)別，二倍體發(fā)育速度相對快，發(fā)育速度次序為二倍體>反交F1>正交F1>四倍體。

2.1.3 囊胚期 隨著細胞分裂繼續(xù)進行，細胞界線不清晰，在動物極形成囊胚層被高高舉起，形似帽狀，此時進入高囊胚期(圖版-12)。后囊胚層的高度下降，細胞分裂進一步變小，此時進入低囊胚期(圖版-13)。此期形態(tài)相似，發(fā)育時間不同，發(fā)育速度次序為二倍體>四倍體>反交F1>正交F1。

2.1.4 原腸胚期 按胚層下包的狀態(tài)分為早、中、晚3期。當囊胚層下包1/3～1/2時，出現(xiàn)胚環(huán)，此時進入原腸早期(圖版-14、15)。當囊胚層下包達2/3時，出現(xiàn)胚盾，即進入原腸中期(圖版-16、17)。當囊胚層下包達3/4時，此時進入原腸晚期(圖版-18)。此期發(fā)育速度次序為二倍體>四倍體>正交F1>反交F1。

2.1.5 神經(jīng)胚期 當囊胚層下包達4/5時，神經(jīng)板形成，胚環(huán)一端膨大為頭部，即進入神經(jīng)胚期(圖版-19)。當胚層幾乎包裹住整個卵黃時，胚孔關閉，胚體雛形形成，胚體側(cè)臥，此時進入胚孔封閉期(圖版-20)。此期發(fā)育速度次序為正交F1>二倍體>四倍體>反交F1。

2.1.6 器官形成期 在胚體中部出現(xiàn)肌節(jié)3～4對，同時頭部稍隆起，此時進入肌節(jié)出現(xiàn)期(圖版-21、22)。在胚體前端出現(xiàn)1對腎形突起(眼原基)，肌節(jié)出現(xiàn)6～7對，此時進入眼基出現(xiàn)期(圖版-23)。在胚體前端，出現(xiàn)長橢圓形且透明的眼囊，肌節(jié)出現(xiàn)8～9對，腦可分為前中后3部分，此時進入眼囊期(圖版-24)。胚體尾部變圓，呈圓錐狀，出現(xiàn)雛形尾芽，肌節(jié)出現(xiàn)12～15對，此時進入尾芽期(圖版-25、26)。在后腦部出現(xiàn)泡狀耳囊，此時進入耳囊出現(xiàn)期(圖版-27)。隨著胚體的不斷發(fā)育，在胚體尾部出現(xiàn)尾鰭雛形，卵黃出現(xiàn)內(nèi)凹，胚體發(fā)育達卵黃囊5/6周，此時進入尾鰭出現(xiàn)期(圖版-28)。在胚體眼囊內(nèi)出現(xiàn)圓形晶體，肌節(jié)為20～21對，即進入晶體出現(xiàn)期(圖版-29)。胚體出現(xiàn)微弱的肌肉收縮，胚體扭動次數(shù)為3～4次/min，卵黃囊內(nèi)凹更加明顯，此時進入肌肉效應期(圖版-30、31)。在耳囊內(nèi)出現(xiàn)兩粒黑色耳石，此時胚體發(fā)育伸長，約繞卵黃囊達1周以上，尾鰭較明顯，此時進入耳石出現(xiàn)期(圖版-32、33)。此期發(fā)育速度次序為四倍體>二倍體>正交F1>反交F1。

2.1.7 孵化出膜期 胚體發(fā)育繼續(xù)伸長，胚體在膜內(nèi)扭動次數(shù)增加，胚體扭動次數(shù)為7次/min，眼晶體明顯，此時進入出膜前期(圖版-34)。隨著胚胎的扭動次數(shù)逐漸增加，處在此階段的胚胎隨時可能出膜，以尾部先沖破卵膜或者頭部沖破卵膜的形式出膜，此時進入出膜期。此期發(fā)育速度次序為四倍體>二倍體>正交F1>反交F1。

注:1為二倍體受精卵，2、3分別為正交和反交F1受精卵，4為四倍體受精卵，5～10分別為正交F1的胚盤期、2細胞期、4細胞期、8細胞期、16細胞期和32細胞期，11～13分別為二倍體桑椹期、高囊胚期和低囊胚期，14、15分別為正交和反交F1原腸早期，16、17分別為反交和正交F1原腸中期，18為反交F1原腸晚期，19、20分別為四倍體神經(jīng)胚期和胚孔封閉期，21、22分別為正交和反交F1肌節(jié)出現(xiàn)期，23～25分別為正交F1眼基出現(xiàn)期、眼囊期和尾芽期，26～28分別為反交F1尾芽期、耳囊出現(xiàn)期和尾鰭出現(xiàn)期，29為四倍體晶體出現(xiàn)期，30為反交F1肌肉效應期，31為四倍體肌肉效應期，32、33分別為正交和反交F1耳石出現(xiàn)期，34為正交F1出膜前期，35為二倍體初孵仔魚，36、37分別為正交和反交F1初孵仔魚，38為四倍體初孵仔魚。

Note:1,fertilized egg of diploid; 2 and 3.fertilized eggs of F1in reciprocal crosses; 4, fertilized egg; 5～10, blastoderm, 2-cell stage, 4-cell stage, 8-cell stage, 16-cell stage and 32-cell stage of F1in reciprocal crosses; 11～13, morula stage, early blastula stage and late blastula stage of diploid; 14 and 15, early gastrula stage of F1in positive and reciprocal crosses; 16 and 17, mid gastrula stage of F1in positive and reciprocal crosses; 18, late gastrula stage of F1in reciprocal cross; 19 and 20, neurula stage and blastopore closing stage of tetraploid; 21 and 22, myomere formation stage of F1in reciprocal crosses; 23～25, optic rudiment stage, eyesac formation stage and tail bud stage of F1in positive cross; 26～28, tail bud stage, oyocyst stage and rudiment of tail stage of F1in reciprocal crosses; 29, eye lens formation stage of tetraploid; 30, muscular contraction stage of F1in reciprocal cross; 31, muscular contraction stage of tetraploid; 32 and 33, otolithes formation stage of F1in reciprocal crosses; 34, pre-hatching stage of F1in positive cross; 35, newly hatched larvae of diploid; 36 and 37, newly hatched larvae of F1in reciprocal crosses; 38, newly hatched larvae of tetraploid.

圖版 二倍體、四倍體及其正反交F1的胚胎發(fā)育過程

Fig The embryonic development process of diploid, tetraploid and their F1in reciprocal crosses inM.anguillicaudatus

2.2 初孵仔魚形態(tài)特征及活動情況

二倍體初孵仔魚體透明且無色素，全長(2.528±0.195)mm，體長(2.56±0.121)mm，卵黃囊前部為橢圓形，后部為棒狀，無油球。仔魚(圖版-35)游泳能力不強，偶爾作間隙扭動或者向前串動，大部分時間為貼壁休息或者靜臥水底，很少游動。四倍體初孵仔魚(圖版-38)與二倍體仔魚形態(tài)上差別不大，魚體透明無色素，全長為(3.188±0.248)mm，體長為(3.145±0.277)mm，卵黃囊同二倍體初孵仔魚，但是大小有差別。正交F1仔魚(圖版-36)和二倍體仔魚的形態(tài)特征基本相同，反交F1(圖版-37)和四倍體仔魚的形態(tài)特征基本相同。

3 結(jié)論與討論

有研究表明，在一定溫度范圍內(nèi)魚類胚胎發(fā)育的時間與孵化溫度呈負相關[19]；泥鰍胚胎在水溫24.5～27.5℃條件下，經(jīng)過31 h仔魚出膜[6]；在水溫19.5～23℃條件下，泥鰍多數(shù)受精卵經(jīng)26.67 h孵化出膜[7]，泥鰍胚胎在19～23℃條件下，經(jīng)過34 h發(fā)育出膜[8]。研究結(jié)果表明，孵化水溫在(26.5±0.5)℃條件下，泥鰍二倍體、四倍體、正交F1和反交F1受精卵分別經(jīng)過26.18 h、25.78 h、26.52 h和26.72 h孵化出膜。表明，泥鰍在不同溫度下的胚胎發(fā)育時間呈現(xiàn)一定差異，與上述溫度相比符合孵化溫度與胚胎發(fā)育時間呈負相關的關系。

有研究表明，母本的遺傳物質(zhì)對后代影響力比較大，雜交后代性狀一般偏向于母本，而胚胎發(fā)育方面也所體現(xiàn)。如翹嘴鱖和斑鱖雜交子一代[20-21]、花魚骨和唇魚骨雜交子一代[22-23]的胚胎發(fā)育形態(tài)和時序都偏向于母本。唇魚骨和花魚骨雜交F1的形態(tài)偏向于作為母本的唇魚骨[24]，翹嘴鱖和斑鱖雜交后代的胚胎發(fā)育時序以母本為基準[25]。本研究結(jié)果與上述研究結(jié)果吻合，即正反交F1的胚胎發(fā)育時序偏向于母本。

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(責任編輯： 馮 衛(wèi))

Observation of Embryonic Development Characteristics of Diploid, Tetraploid and Their F1in Reciprocal Crosses inMisgurnusanguillicaudatus

WANG Yuchen, LIAN Qingping, LI Qian, LIU Shili, MI Guoqiang, HU Tingjian*

(ZhejiangInstituteofFreshwaterFisheries,Huzhou,Zhejiang313001,China)

The embryonic development process and characteristics of diploid, tetraploid and their F1in reciprocal crosses inM.anguillicaudatuswere observed and compared at water temperature of (26 0.5)℃ to provide a reference for polyploidy breeding and new variety breeding ofM.anguillicaudatus. Results: The hatching time of fertilized eggs of diploid, tetraploid, positive cross F1and reciprocal cross F1is 26.18 h, 25.78 h, 26.52 h and 26.72 h respectively and their development process and development time sequence are the same basically. The fertilization and embryonic development process of diploid, tetraploid, positive cross F1and reciprocal cross F1includes early cleavage stage, cleavage stage, blastula stage, gastrula stage, neurula stage, organ formulation stage and hatching stage and there are no obvious differences in the development characteristics and stages among diploid, tetraploid, positive cross F1and reciprocal cross F1except different time in development stages. The body length of diploid and tetraploid newly hatched larvae is (2.56 0.121) mm and (3.145 0.277) mm respectively, which indicates that there is no obvious difference in newly hatched larvae between diploid and tetraploid.The morphological characteristics of larva fish of positive cross F1is similar to diploid larva fish but the morphological characteristics of larva fish of reciprocal cross F1is similar to tetraploid larva fish.

Misgurnusanguillicaudatus; diploid; tetraploid; reciprocal cross; embryonic development

2015-07-20； 2015-12-24修回

浙江省公益技術研究農(nóng)業(yè)項目(2012C22059，2010C32033)

王雨辰(1982-)，男，工程師，從事魚類遺傳育種和養(yǎng)殖技術研究。E-mail：faywallace@163.com

*通迅作者：胡廷尖 (1961-)，男，教授級高級工程師，從事魚類遺傳育種與生態(tài)養(yǎng)殖研究。E-mail：zjscmz@163.com

1001-3601(2016)01-0032-0121-04

S917

A