江羅佳，秦曉華，黃 翀，房向東，涂衛(wèi)平

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·論著·

重組人促紅細(xì)胞生成素治療腎間質(zhì)纖維化的作用機(jī)制研究

江羅佳，秦曉華，黃 翀，房向東，涂衛(wèi)平

【摘要】目的探討重組人促紅細(xì)胞生成素(rHuEPO)治療腎間質(zhì)纖維化(RIF)的作用機(jī)制。方法2014年7月—2015年6月，將人腎小管上皮細(xì)胞(HK-2細(xì)胞)隨機(jī)分為7組：空白對(duì)照組(E1組)：未加任何刺激物；rHuEPO對(duì)照組(E2組)：rHuEPO終濃度為20 U/ml；人純化清蛋白誘導(dǎo)組(E3組)：人純化清蛋白終濃度為5 mg/ml；E4組：加人純化清蛋白(5 mg/ml)和rHuEPO(5 U/ml)；E5組：加人純化清蛋白(5 mg/ml)和rHuEPO(10 U/ml)；E6組：加人純化清蛋白(5 mg/ml)和rHuEPO(20 U/ml)；Rho相關(guān)卷曲螺旋形成的蛋白激酶(ROCK)抑制劑Y27632組(E7組)：加ROCK抑制劑Y27632(10 μmol/L)，30 min后加人純化清蛋白(5 mg/ml)。采用細(xì)胞增殖試驗(yàn)檢測(cè)刺激16、24、48、72 h時(shí)各組細(xì)胞增殖數(shù)，反轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(RT-PCR)法檢測(cè)RhoA、ROCK mRNA表達(dá)水平，細(xì)胞免疫熒光法檢測(cè)α-平滑肌肌動(dòng)蛋白(α-SMA)、E-鈣黏蛋白(E-cadherin)表達(dá)水平，酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)法檢測(cè)纖維連接蛋白(FN)表達(dá)水平。結(jié)果16 h時(shí)，各組細(xì)胞增殖數(shù)比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。24、48、72 h時(shí)，各組細(xì)胞增殖數(shù)比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；其中E3～E6組高于E1組、E2組，E4～E6組高于E3組，E7組低于E3組，E5組、E6組高于E4組，E6組高于E5組(P<0.05)。各組RhoA mRNA表達(dá)水平比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；其中E3～E6組高于E1組、E2組，E4～E6組低于E3組，E5組、E6組低于E4組，E6組低于E5組(P<0.05)。各組ROCK mRNA表達(dá)水平比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；其中E3～E6組高于E1組、E2組，E4～E7組低于E3組，E5組、E6組低于E4組，E6組低于E5組(P<0.05)。各組α-SMA表達(dá)水平比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；其中E3～E5組高于E1組、E2組，E4～E7組低于E3組，E5組、E6組低于E4組，E6組低于E5組(P<0.05)。各組E-cadherin表達(dá)水平比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；其中E3～E6組低于E1組、E2組，E4～E7組高于E3組，E5組、E6組高于E4組，E6組高于E5組(P<0.05)。各組FN表達(dá)水平比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；其中E3～E5組高于E1組、E2組，E4～E7組低于E3組，E5組、E6組低于E4組，E6組低于E5組(P<0.05)。E3組、E4組、E5組、E6組RhoA mRNA與ROCK mRNA均呈正相關(guān)(P<0.05)。結(jié)論人純化清蛋白能誘導(dǎo)HK-2細(xì)胞發(fā)生上皮細(xì)胞-間充質(zhì)細(xì)胞轉(zhuǎn)分化(EMT)，進(jìn)而發(fā)生RIF，而rHuEPO通過(guò)阻斷EMT的RhoA/ROCK信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路從而抑制RIF發(fā)生，且在一定范圍內(nèi)rHuEPO水平越高，其抑制作用越強(qiáng)。

腎間質(zhì)纖維化(renal interstitial fibrosis，RIF)是逐步進(jìn)展成慢性腎衰竭的一個(gè)必經(jīng)之路。探討一種新的、針對(duì)性的治療方案，阻斷甚至逆轉(zhuǎn)RIF的進(jìn)展，在延緩慢性腎臟病進(jìn)展中顯得尤其重要。在RIF過(guò)程中，腎小管基底膜損害的同時(shí)常伴有腎小管上皮細(xì)胞向肌成纖維細(xì)胞樣細(xì)胞轉(zhuǎn)分化，這種現(xiàn)象被稱作“上皮細(xì)胞-間充質(zhì)細(xì)胞轉(zhuǎn)分化(epithelial-mesenchymal transformation，EMT)”，各種細(xì)胞因子、生長(zhǎng)因子、激素等均參與并協(xié)同完成EMT過(guò)程[1-3]。近幾年，有學(xué)者認(rèn)為，在EMT過(guò)程中，RhoA/Rho相關(guān)卷曲螺旋形成的蛋白激酶(Rho-associated coiled-coil-forming protein kinase，ROCK)與轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β1(transforming growth factor β1，TGFβ1)/smads是2條并行的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路[4-5]。本研究旨在探討重組人促紅細(xì)胞生成素(rHuEPO)的腎臟保護(hù)生物學(xué)效應(yīng)是否與抑制RhoA/ROCK信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路有關(guān)，為進(jìn)一步深入研究RIF機(jī)制提供科學(xué)依據(jù)。

1材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1細(xì)胞來(lái)源人腎小管上皮細(xì)胞(HK-2細(xì)胞)株來(lái)源于美國(guó)組織培養(yǎng)物細(xì)胞庫(kù)(ATCC)。

1.1.2主要試劑DMEM/F12培養(yǎng)基(美國(guó)HyClone公司)，胎牛血清、0.25%胰蛋白酶(美國(guó)Gibco公司)，人純化清蛋白(成都雙流正龍生化制品研究室)，3-(4，5-二甲基噻唑-2)-2(MTT)(南京森貝伽生物科技有限公司)，rHuEPO(沈陽(yáng)三生制藥股份有限公司惠贈(zèng))，總RNA抽提試劑(Trizol)(美國(guó)Invitrogen公司)，反轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(RT-PCR)試劑盒(美國(guó)Fermentas公司)，2×EasyTaq PCR SuperMix(北京全式金生物技術(shù)有限公司)，鼠抗人單克隆α-平滑肌肌動(dòng)蛋白(α-SMA)、E-鈣黏蛋白(E-cadherin)抗體、異硫氰酸熒光素(FITC)標(biāo)記抗小鼠免疫球蛋白G(IgG)二抗(北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司)，ROCK抑制劑Y27632(美國(guó)Sigma公司)。

1.1.3主要儀器PCR擴(kuò)增儀、Gel DocXR凝膠成像系統(tǒng)(美國(guó)Bio-Rad公司)，DYPC-31DN型電泳儀(北京市六一儀器廠)，全自動(dòng)酶標(biāo)儀(美國(guó)Thermo公司)，熒光顯微鏡(日本Olympus)，5% CO2培養(yǎng)箱(美國(guó)Thermo公司)。

1.2實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1細(xì)胞培養(yǎng)及實(shí)驗(yàn)分組2014年7月—2015年6月，取凍存于液氮中的HK-2細(xì)胞，立刻投入37 ℃溫水中解凍，1 500 r/min離心10 min(離心半徑10 cm)，棄上清液，加入含10%胎牛血清的DMEM/F12培養(yǎng)基，吹打使得細(xì)胞沉淀混懸，接種于無(wú)菌培養(yǎng)瓶中，置于37 ℃ 5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，2 d換液1次，當(dāng)顯微鏡下觀察細(xì)胞融合至80%以上時(shí)，用0.25%胰蛋白酶消化、傳代。將HK-2細(xì)胞隨機(jī)分為7組：空白對(duì)照組(E1組)：未加任何刺激物；rHuEPO對(duì)照組(E2組)：rHuEPO終濃度為20 U/ml；人純化清蛋白誘導(dǎo)組(E3組)：人純化清蛋白終濃度為5 mg/ml；E4組：加人純化清蛋白(5 mg/ml)和rHuEPO(5 U/ml)；E5組：加人純化清蛋白(5 mg/ml)和rHuEPO(10 U/ml)；E6組：加人純化清蛋白(5 mg/ml)和rHuEPO(20 U/ml)；ROCK抑制劑Y27632組(E7組)：加ROCK抑制劑Y27632(10 μmol/L)，30 min后加人純化清蛋白(5 mg/ml)。

1.2.2細(xì)胞增殖試驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞增殖數(shù)采用MTT法進(jìn)行細(xì)胞增殖試驗(yàn)。收集各組對(duì)數(shù)期HK-2細(xì)胞，往96孔板每孔中加入100 μl細(xì)胞懸液，鋪板將待測(cè)細(xì)胞密度調(diào)到2 000/ml，邊緣孔以無(wú)菌磷酸鹽緩沖液(PBS)填充，置于37 ℃ 5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，然后分別往各組加入刺激物，100 μl/孔，每組設(shè)5個(gè)復(fù)孔，同時(shí)設(shè)置調(diào)零孔〔只加入DMEM/F12培養(yǎng)基、MTT、二甲基亞砜(DMSO)〕和對(duì)照孔(只加入細(xì)胞、相同濃度藥物溶解介質(zhì)、含10%胎牛血清的DMEM/F12培養(yǎng)基、MTT、DMSO)；繼續(xù)置于37 ℃ 5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)16 h，棄板中培養(yǎng)液，小心用PBS沖洗2～3遍，每孔加100 μl MTT溶液(5 mg/ml)，繼續(xù)培養(yǎng)4 h；棄去各組孔內(nèi)培養(yǎng)液，每孔加100 μl DMSO，放置搖床上低速振蕩10 min，使結(jié)晶物充分溶解；最后在酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)檢測(cè)儀490 nm處檢測(cè)各組的吸光度(OD值)，即細(xì)胞增殖數(shù)。記錄刺激16、24、48、72 h時(shí)各組細(xì)胞增殖數(shù)。實(shí)驗(yàn)共重復(fù)3次，取平均值。

1.2.3RT-PCR法檢測(cè)RhoA、ROCK mRNA表達(dá)水平用Trizol分別提取各組HK-2細(xì)胞總RNA，取總RNA 1.5 μg反轉(zhuǎn)錄合成cDNA，取cDNA 2 μl在2×EasyTaq PCR SuperMix的作用下擴(kuò)增目標(biāo)基因(以人β-actin為內(nèi)參照)，總反應(yīng)體系50 μl。PCR引物由美國(guó)Invitrogen公司設(shè)計(jì)，如下：RhoA(356 bp)：上游引物為5′-GGCTGGACTCGGATTCGTTG-3′，下游引物為5′-CGTTGGGACAGAAATGCTTGAC-3′；ROCK(293 bp)：上游引物為5′-TGATGGCTATTATGGACGAG-3′，下游引物為5′-GGAGCGTTTCCCAAGC-3′；β-actin(443 bp)：上游引物為5′-CGGGAAATCGTGCGTGAC-3′，下游引物為5′-TGGAAGGTGGACAGCGAGG-3′。擴(kuò)增條件：94 ℃預(yù)變性2～5 min，54 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，共32～33個(gè)循環(huán)，最后72 ℃終延伸2 min。最后配制2%瓊脂糖凝膠，PCR擴(kuò)增產(chǎn)物在120 V DYPC-31DN型電泳儀上電泳30 min，Gel DocXR凝膠成像系統(tǒng)成像并使用Quantity One軟件分析RhoA、ROCK mRNA表達(dá)水平。實(shí)驗(yàn)共重復(fù)3次，取平均值。

1.2.4細(xì)胞免疫熒光法檢測(cè)α-SMA、E-cadherin表達(dá)水平收集96孔板中的各組HK-2細(xì)胞，于4 ℃冰箱中采用4%多聚甲醛溶液固定細(xì)胞20 min，0.1% 曲拉通(Triton)穿孔15～20 min，5%胎牛血清清蛋白(BSA)室溫封閉30 min，滴加鼠抗人單克隆α-SMA抗體或鼠抗人單克隆E-cadherin抗體(用5% BSA以1∶200濃度稀釋)，4 ℃冰箱孵育過(guò)夜，次日先取出置室溫30 min復(fù)溫，再加入FITC標(biāo)記抗小鼠 IgG二抗(用5% BSA以1∶500濃度稀釋)，置37 ℃恒溫震蕩箱中孵育30 min，熒光顯微鏡下觀察。每組細(xì)胞隨機(jī)選取10個(gè)視野(×200)攝像，熒光圖片用Image-Pro Plus 6.0軟件分析，每個(gè)視野累計(jì)光密度值與測(cè)量面積的比值為平均熒光強(qiáng)度(即蛋白相對(duì)表達(dá)水平)。實(shí)驗(yàn)共重復(fù)3次，取平均值。

1.2.5ELISA法檢測(cè)纖維連接蛋白(FN)表達(dá)水平收集各組HK-2細(xì)胞上清液，嚴(yán)格按ELISA試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行操作，記錄全自動(dòng)酶標(biāo)儀波長(zhǎng)為450 nm處的OD值，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線方程分別求出各組FN表達(dá)水平。實(shí)驗(yàn)共重復(fù)3次，取平均值。

2結(jié)果

2.1細(xì)胞增殖數(shù)比較16 h時(shí)，各組細(xì)胞增殖數(shù)比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。24、48、72 h時(shí)，各組細(xì)胞增殖數(shù)比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；其中E3～E6組高于E1組、E2組，E4～E6組高于E3組，E7組低于E3組，E5組、E6組高于E4組，E6組高于E5組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05，見表1)。

2.2RhoA、ROCK mRNA表達(dá)水平比較各組RhoA mRNA表達(dá)水平比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；其中E3～E6組高于E1組、E2組，E4～E6組低于E3組，E5組、E6組低于E4組，E6組低于E5組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。各組ROCK mRNA表達(dá)水平比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；其中E3～E6組高于E1組、E2組，E4～E7組低于E3組，E5組、E6組低于E4組，E6組低于E5組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05，見圖1、表2)。

Table 1　Comparison of the number of proliferating cells among the 7 groups

組別16h24h48h72hE1組0.570±0.0241.177±0.0141.234±0.0151.322±0.012E2組0.569±0.0321.171±0.0131.225±0.0131.236±0.005E3組0.586±0.0161.487±0.022ab1.556±0.004ab1.635±0.018abE4組0.584±0.0151.552±0.009abc1.682±0.003abc1.724±0.021abcE5組0.590±0.0211.722±0.015abcd1.855±0.024abcd1.883±0.018abcdE6組0.603±0.0181.775±0.017abcde1.923±0.007abcde1.964±0.025abcdeE7組0.579±0.0511.383±0.007c1.412±0.015c1.534±0.014cZ(u)值3.252.38f2.47f2.96fP值0.6750.0360.0290.021

注：與E1組比較，aP<0.05；與E2組比較，bP<0.05；與E3組比較，cP<0.05；與E4組比較，dP<0.05；與E5組比較，eP<0.05；f為u值

注：ROCK=Rho相關(guān)卷曲螺旋形成的蛋白激酶

圖1瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果

Figure 1Results of agarose gel electrophoresis

Table 2Comparison of the expression levels of RhoA mRNA and ROCK mRNA levels among the 7 groups

組別RhoAmRNAROCKmRNAE1組0.214±0.0020.171±0.001E2組0.209±0.0010.171±0.003E3組0.653±0.002ab0.780±0.001abE4組0.524±0.004abc0.648±0.002abcE5組0.407±0.003abcd0.522±0.004abcdE6組0.261±0.005abcde0.285±0.002abcdeE7組0.591±0.0010.180±0.003cF值2723.6924353.18P值0.0310.029

注：與E1組比較，aP<0.05；與E2組比較，bP<0.05；與E3組比較，cP<0.05；與E4組比較，dP<0.05；與E5組比較，eP<0.05；ROCK=Rho相關(guān)卷曲螺旋形成的蛋白激酶

2.3α-SMA、E-cadherin表達(dá)水平比較各組α-SMA表達(dá)水平比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；其中E3～E5組高于E1組、E2組，E4～E7組低于E3組，E5組、E6組低于E4組，E6組低于E5組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。各組E-cadherin表達(dá)水平比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；其中E3～E6組低于E1組、E2組，E4～E7組高于E3組，E5組、E6組高于E4組，E6組高于E5組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05，見圖2～3、表3，本文圖2、圖3等彩圖見網(wǎng)站www.chinagp.net電子期刊相應(yīng)文章附件)。

2.4FN表達(dá)水平比較各組FN表達(dá)水平比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。其中E3～E5組高于E1組、E2組，E4～E7組低于E3組，E5組、E6組低于E4組，E6組低于E5組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05，見表3)。

表3各組HK-2細(xì)胞中α-SMA、E-cadherin、FN表達(dá)水平比較

Table 3Comparison of α-SMA,E-cadherin and FN levels among the 7 groups

組別α-SMAE-cadherinFN(ng/ml)E1組0.028±0.003 0.279±0.004 6003±73E2組0.030±0.0030.268±0.002 6130±63E3組0.158±0.003ab0.006±0.002ab569073±222abE4組0.102±0.004abc0.082±0.003abc145528±353abcE5組0.062±0.002abcd0.119±0.006abcd33988±26abcdE6組0.033±0.003bcde0.245±0.005abcde 5609±86cdeE7組0.032±0.002c0.268±0.003c 7657±78cF值663.731425.47742.18P值0.0240.0420.022

注：與E1組比較，aP<0.05；與E2組比較，bP<0.05；與E3組比較，cP<0.05；與E4組比較，dP<0.05；與E5組比較，eP<0.05；α-SMA=α-平滑肌肌動(dòng)蛋白，E-cadherin=E-鈣黏蛋白，F(xiàn)N=纖維連接蛋白

2.5相關(guān)性分析E1組、E2組、E7組RhoA mRNA與ROCK mRNA無(wú)直線相關(guān)關(guān)系(P>0.05)；E3組、E4組、E5組、E6組RhoA mRNA與ROCK mRNA均呈正相關(guān)(P<0.05，見表4)。

表4　各組RhoA mRNA與ROCK mRNA的相關(guān)性

組別相關(guān)系數(shù)(r值)P值E1組0.1140.128E2組0.3250.064E3組0.8960.021E4組0.8520.033E5組0.8640.048E6組0.8210.010E7組0.3430.074

3討論

在EMT過(guò)程中，腎小管上皮細(xì)胞并不是被動(dòng)的受害者，而是擔(dān)任主導(dǎo)作用的角色[6]。許多臨床實(shí)踐和試驗(yàn)數(shù)據(jù)顯示，RIF程度是決定慢性腎臟病預(yù)后轉(zhuǎn)歸的重要因素[1,7-9]。RhoA/ROCK信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路中的RhoA作為Ras超家族的核心成員，主要參與細(xì)胞內(nèi)信號(hào)、炎性細(xì)胞的活化以及吞噬細(xì)胞的成熟、分化、遷移過(guò)程；而ROCK屬于絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶家屬，迄今發(fā)現(xiàn)有ROCK1和ROCK2兩類同源性非常相似的異構(gòu)體存在，是目前結(jié)構(gòu)、功能研究均比較明確的Rho下游序列的靶效應(yīng)分子，腎臟組織中高表達(dá)ROCK1，而ROCK2主要在心臟和大腦表達(dá)[10]。Rho與其下游效應(yīng)分子ROCK組成的RhoA/ROCK信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，在體外可介導(dǎo)RIF中的一個(gè)重要的細(xì)胞機(jī)制，即EMT。當(dāng)前，RhoA/ROCK信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路在EMT的發(fā)生、發(fā)展過(guò)程中受到廣泛關(guān)注[11-14]。在臨床工作中，使用ROCK抑制劑Y27632可以明顯改善多種器官的炎性反應(yīng)，但是其藥物代謝動(dòng)力學(xué)特點(diǎn)是分解快、t1/2短，至今尚未找到能應(yīng)用于臨床的類似藥物[15]。另外一種抑制劑法舒地爾，最早應(yīng)用于心腦血管疾病，其作用是舒緩平滑肌，近期發(fā)現(xiàn)其也是RhoA/ROCK信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的一種選擇性阻斷劑，但目前還沒(méi)有充分證據(jù)表明其能用于RIF的治療[16]。本研究結(jié)果顯示，E7組ROCK mRNA、α-SMA、FN表達(dá)水平低于E3組，E-cadherin表達(dá)水平高于E3組，提示ROCK抑制劑Y27632能顯著減輕RIF程度，其可能通過(guò)RhoA/ROCK信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，對(duì)EMT的發(fā)生發(fā)展起防治作用，因此阻斷該通路可能成為RIF治療的靶目標(biāo)。

人促紅細(xì)胞生成素(erythropoietin，EPO)基因位于7號(hào)染色體長(zhǎng)臂，包含3 000個(gè)堿基序列，編碼1條含有193個(gè)氨基酸的多肽分子，EPO在產(chǎn)生與分泌過(guò)程中需要經(jīng)過(guò)修飾，其N端27個(gè)氨基酸的前肽與C端的精氨酸均被切除，因此機(jī)體內(nèi)的活性EPO僅有165個(gè)氨基酸分子[17-18]。原味雜交大鼠在注射氯化鈷后，腎小管上皮細(xì)胞存在EPO mRNA，揭示在病理?xiàng)l件下腎小管上皮細(xì)胞亦可合成EPO[19]。1958年Jacobs等[20]、Kimel 等[21]首次通過(guò)基因工程技術(shù)合成rHuEPO，三十多年后才開始應(yīng)用于臨床，用其治療各種慢性腎衰竭患者并發(fā)癥，此后多年中，其應(yīng)用領(lǐng)域始終局限于免疫功能缺陷患者貧血癥狀的改善。近幾年中，隨著對(duì)EPO及其受體作用機(jī)制的不斷探討，EPO的臨床應(yīng)用領(lǐng)域也逐步擴(kuò)展，其不僅用于腎性貧血的治療，而且對(duì)其他病因?qū)е碌呢氀?、骨髓增生性疾病、營(yíng)養(yǎng)不良、神經(jīng)系統(tǒng)疾病、腦血管病變以及創(chuàng)傷等均具備一定療效[22-25]。本研究結(jié)果顯示，24、48、72 h時(shí)，各組細(xì)胞增殖數(shù)有差異，其中E3～E6組高于E1組、E2組，E4～E6組高于E3組，E5組、E6組高于E4組，E6組高于E5組；各組α-SMA、FN表達(dá)水平有差異，其中E3～E5組高于E1組、E2組，E4～E6組低于E3組，E5組、E6組低于E4組，E6組低于E5組；各組E-cadherin表達(dá)水平有差異，其中E3～E6組低于E1組、E2組，E4～E6組高于E3組，E5組、E6組高于E4組，E6組高于E5組。提示人純化清蛋白能誘導(dǎo)HK-2細(xì)胞發(fā)生EMT，進(jìn)而發(fā)生RIF；rHuEPO可抑制人純化清蛋白超負(fù)荷引起的EMT，延緩RIF進(jìn)展，且rHuEPO水平越高，其抑制作用越強(qiáng)，與周媧等[26]結(jié)果相同。本研究結(jié)果亦顯示，各組RhoA、ROCK mRNA表達(dá)水平有差異，其中E3～E6組高于E1組、E2組，E4～E6組低于E3組，E5組、E6組低于E4組，E6組低于E5組，Person相關(guān)性分析結(jié)果顯示，E3組、E4組、E5組、E6組RhoA mRNA與ROCK mRNA均呈正相關(guān)。因此，筆者推測(cè)rHuEPO可能通過(guò)抑制RhoA/ROCK信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路發(fā)揮抑制EMT的腎臟保護(hù)作用，且在一定范圍內(nèi)隨著rHuEPO水平增加，其抑制作用逐漸增強(qiáng)。

綜上所述，人純化清蛋白能誘導(dǎo)HK-2細(xì)胞發(fā)生EMT，進(jìn)而發(fā)生RIF，rHuEPO通過(guò)阻斷EMT的RhoA/ROCK信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路而抑制RIF發(fā)生，且在一定范圍內(nèi)rHuEPO水平越高，其抑制作用越強(qiáng)。但是，EMT的形成機(jī)制亦十分復(fù)雜，所涉及的細(xì)胞因子眾多，加之受實(shí)驗(yàn)者技術(shù)水平、實(shí)驗(yàn)經(jīng)費(fèi)等多重因素所限，本實(shí)驗(yàn)僅從人純化清蛋白誘導(dǎo)HK-2細(xì)胞發(fā)生EMT、rHuEPO干預(yù)EMT的RhoA/ROCK信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路方面進(jìn)行了初步研究。且本研究只是一次探索性研究，相信日后隨著對(duì)rHuEPO對(duì)該信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路作用機(jī)制的進(jìn)一步深入探討，rHuEPO會(huì)更好地應(yīng)用于臨床治療，為慢性腎臟病患者的遠(yuǎn)期治療帶來(lái)新的曙光。

作者貢獻(xiàn)：江羅佳進(jìn)行實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)與實(shí)施、資料收集整理、撰寫論文、成文并對(duì)文章負(fù)責(zé)；秦曉華、黃翀、房向東進(jìn)行實(shí)驗(yàn)實(shí)施、評(píng)估、資料收集；涂衛(wèi)平進(jìn)行質(zhì)量控制及審校。

本文無(wú)利益沖突。

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(本文編輯：崔麗紅)

【關(guān)鍵詞】腎疾??；細(xì)胞轉(zhuǎn)分化；重組人促紅細(xì)胞生成素；rho相關(guān)激酶類；信號(hào)傳導(dǎo)

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Mechanism of Recombinant Human Erythropoietin in the Treatment of Renal Interstitial FibrosisJIANGLuo-jia,QINXiao-hua,HUANGChong,etal.DepartmentofNephrology,theSecondAffiliatedHospitalofNanchangUniversity,Nanchang330006,China

【Abstract】ObjectiveTo investigate the mechanism of recombinant human erythropoietin (rHuEPO) in the treatment of renal interstitial fibrosis (RIF).MethodsFrom July 2014 to June 2015,divided the sampled human renal tubular epithelial cells (HK-2 cell) into 7 groups:E1 group (no irritants),E2 group (20 U/ml rHuEPO),E3 group (5 mg/ml purified albumin),E4 group (5 mg/ml purified albumin+5 U/ml rHuEPO),E5 group (5 mg/ml purified albumin+10 U/ml rHuEPO),E6 group (5 mg/ml purified albumin+20 U/ml rHuEPO),E7 group (5 mg/ml purified albumin 30 min after 10 μmol/L Y27632).At 16,24,48 and 72 h,the number of proliferating cells of each group was detected by cell proliferation assay;RhoA and ROCK mRNA expression levels were detected by RT-PCR;α-SMA and E-cadherin levels were detected by cell immunofluorescence method;fiber connection protein (FN) expression level was examined by ELISA method.ResultsAt 16 h,the 7 groups were not significantly different in the number of proliferating cells (P>0.05).At 24,48 and 72 h,the 7 groups were significantly different in the number of proliferating cells (P<0.05);E3-E6 groups were higher than E1 group and E2 group;E4-E6 groups were higher than E3 group;E7 group was lower than E3 group;E5 and E6 groups were higher than E4 group;E6 group was higher than E5 group (P<0.05).The 7 groups were significantly different in the expression level of RhoA mRNA (P<0.05);E3-E6 groups were higher than E1 group and E2 group;E4-E6 groups were lower than E3 group;E5 and E6 groups were lower than E4 group;E6 group was lower than E5 group (P<0.05).The 7 groups were significantly different in the expression level of ROCK mRNA (P<0.05);E3-E6 groups were higher than E1 group and E2 group;E4-E7 groups were lower than E3 group;E5 and E6 groups were lower than E4 group;E6 group was lower than E5 group (P<0.05).The 7 groups were significantly different in the expression level of α-SMA (P<0.05);E3-E5 groups were higher than E1 group and E2 group;E4-E7 groups were lower than E3 group;E5-E6 groups were lower than E4 group;E6 group was lower than E5 group (P<0.05).The 7 groups were significantly different in the expression level of E-cadherin (P<0.05);E3-E6 groups were lower than E1 group and E2 group;E4-E7 groups were higher than E3 group;E5-E6 groups were higher than E4 group;E6 group was higher than E5 group (P<0.05).The 7 groups were significantly different in the FN expression level (P<0.05);E3-E5 groups were higher than E1 group and E2 group;E4-E7 groups were lower than E3 group;E5-E6 groups were lower than E4 group;E6 group was lower than E5 group (P<0.05).RhoA mRNA was positively correlated with ROCK mRNA in E3,E4,E5 and E6 group (P<0.05).ConclusionPurified albumin can induce the occurrence of EMT and further induce RIF.rHuEPO can inhibit the occurrence of RIF,and its inhibitory effect improves with the increase of rHuEPO level to some extent.

【Key words】Kidney diseases;Cell transdifferentiation;Recombinant erythropoietin;rho-associated kinases;Signal transduction

(收稿日期：2015-05-03；修回日期：2015-11-26)

【中圖分類號(hào)】R 692

【文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼】A

doi：10.3969/j.issn.1007-9572.2016.06.010

通信作者：房向東，330006 江西省南昌市，南昌大學(xué)第二附屬醫(yī)院腎內(nèi)科；E-mail：xiangdongfang818@sina.com

基金項(xiàng)目：江西省教育廳科學(xué)技術(shù)研究項(xiàng)目(GJJ12107)
作者單位：330006 江西省南昌市，南昌大學(xué)第二附屬醫(yī)院腎內(nèi)科(江羅佳現(xiàn)工作于九江市第一人民醫(yī)院腎內(nèi)科)