韓燕全，洪　燕，夏倫祝，汪永忠，沈業(yè)兵，李鈺馨,，高家榮

(1.安徽中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院　國家中醫(yī)藥管理局中藥制劑三級實(shí)驗室，安徽 合肥　230031；

2.安徽中醫(yī)藥大學(xué)中西醫(yī)結(jié)合臨床學(xué)院，安徽 合肥　230038)

?

姜炭超高效液相色譜指紋圖譜研究

韓燕全1，洪燕2，夏倫祝1，汪永忠1，沈業(yè)兵1，李鈺馨1,2，高家榮1

(1.安徽中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院國家中醫(yī)藥管理局中藥制劑三級實(shí)驗室，安徽 合肥230031；

2.安徽中醫(yī)藥大學(xué)中西醫(yī)結(jié)合臨床學(xué)院，安徽 合肥230038)

[摘要]目的建立姜炭藥材的超高效液相色譜-二極管陣列檢測器(ultra performance liquid chromatography-photodiode array, UPLC-PDA)指紋圖譜。方法采用UPLC BEH色譜柱C18(2.1 mm×100 mm，1.7 μm)，流動相為水-乙腈，梯度洗脫；流速0.25 mL/min；柱溫30 ℃；檢測波長為280 nm；分別對14批樣品指紋圖譜進(jìn)行相似度分析、聚類分析和偏最小二乘法判別分析。結(jié)果實(shí)驗指認(rèn)了指紋圖譜15個共有色譜峰中的5個。14批不同產(chǎn)地姜炭藥材中9批樣品相似度大于0.9，可聚為4大類，其中10個色譜峰的VIP得分值大于1.0。結(jié)論所建立的指紋圖譜方法簡便、穩(wěn)定、可行，可用于姜炭的質(zhì)量評價及分類。

[關(guān)鍵詞]姜炭；超高效液相色譜指紋圖譜；偏最小二乘法判別分析模式識別

中醫(yī)素有“血見黑則止”的說法，因而炭藥作為止血藥在中醫(yī)臨床上被廣泛采用。炭類中藥的質(zhì)量控制方法是中藥學(xué)研究的難點(diǎn)，目前除了某些成分的定量測定以外，其控制方法多停留在“炒炭存性”的主觀經(jīng)驗判斷上，缺少客觀、可量化的質(zhì)量控制手段來全面控制其質(zhì)量。干姜是姜科植物姜ZingiberofficinaleRosc.干燥根莖；姜炭是由干姜經(jīng)過清炒而成的炮制品[1]。干姜炮制成炭后，辛味消失，“守而不走”，長于止血溫經(jīng)，主要用于吐血、衄血等脾陽不足病證?，F(xiàn)代研究表明，干姜炮制成姜炭后，氨基酸和揮發(fā)油等成分已被破壞，姜酚類成分含量降低至微量[2]。2010年版《中華人民共和國藥典》對姜炭的質(zhì)量控制標(biāo)準(zhǔn)是以6-姜辣素(C17H26O4)的含量不得少于0.05%，質(zhì)控指標(biāo)單一，有待提高。目前，有關(guān)生姜、干姜和炮姜的指紋圖譜研究已取得一定進(jìn)展[3]，但尚未見對姜炭指紋圖譜的研究。因此，本實(shí)驗在前期研究基礎(chǔ)上，建立了姜炭藥材的超高效液相色譜(ultra performance liquid chromatography, UPLC)指紋圖譜，并對其進(jìn)行模式識別分析,以期為全面控制姜炭的質(zhì)量提供參考依據(jù)。

1儀器與試藥

Waters UPLC系統(tǒng)主要有四元泵、自動進(jìn)樣器、柱溫箱、二極管陣列檢測器和Empower 2色譜工作站組成；AG285型十萬分之一電子天平：德國賽多利斯公司；KQ-3200B型超聲儀：江蘇昆山超聲儀器有限公司；HFB-200小型中藥材粉碎機(jī)：湖南省吉首市中州市中藥機(jī)械廠；DZF-6050型數(shù)控真空干燥箱：上海博訊醫(yī)療設(shè)備廠；色譜純乙腈：美國SIGMA公司；分析純試劑甲醇、磷酸等均購自國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；蒸餾水為屈臣氏公司生產(chǎn)；0.22 μm微孔濾膜購自北京八方世紀(jì)科技有限公司。

實(shí)驗用5種姜酚類對照品的批號和來源：姜酮(批號 122-485)、6-姜酚(批號 23513-146)、8-姜酚(批號 23513-088)、10-姜酚(批號 23513-157)對照品均購自上海鼎瑞化工有限公司，；6-姜烯酚(批號 12121803)對照品購自四川省成都曼斯特公司，5種對照品含量均大于98.0%，并經(jīng)1H-NMR、13C-NMR、MS、IR和UV等光譜檢測確認(rèn)其結(jié)構(gòu)。14份市售干姜藥材購自全國不同地區(qū)藥店，經(jīng)安徽中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院高家榮主任中藥師鑒定均為姜科植物姜ZingiberofficinaliesRose．的干燥根莖。姜炭炮制方法采用《中華人民共和國藥典》2010年版附錄ⅡD項下炒炭法，主要過程為取干姜塊，炒至表面黑色、內(nèi)部棕褐色，即得到姜炭藥材，樣品信息見表1。

2方法與結(jié)果

2.1色譜條件色譜柱為Waters Acquity UPLC BEH C18柱(2.1 mm×100 mm，1.7 μm)；流動相為乙腈(A)-水溶液(B)，梯度洗脫程序為：0～10 min，25%～75% A；10～15 min，75% A；15～16.5 min, 75%～100% A；16.5～18 min, 100% A; 18～20 min，100%～25% A;流速為0.25 mL/min；柱溫為30 ℃；檢測波長為280 nm；樣品進(jìn)樣量為2 μL。

2.2對照品溶液的制備精密稱取姜酮5.6 mg、6-姜酚5.0 mg、8-姜酚6.0 mg、6-姜烯酚5.8 mg和10-姜酚6.6 mg，各對照品分別置于容量瓶中，加甲醇定容，制備得到對照品母液；再分別吸取5種對照品母液一定容積置于同一10 mL容量瓶并定容，得終濃度分別為姜酮28 μg/mL、6-姜酚25 μg/mL、8-姜酚30 μg/mL、6-姜烯酚58 μg/mL和10-姜酚33 μg/mL的5種對照品混合溶液，冷藏備用。

2.3供試品溶液的制備取表1中各姜炭樣品，粉碎，過40目篩；精密稱取姜炭粉末0.5 g，至10 mL棕色量瓶中，加入90%乙醇至刻度，150 W，40 Hz超聲提取40 min，放冷，再加入90%乙醇補(bǔ)足損失量，搖勻，再用0.22 μm微孔濾膜過濾，留取續(xù)濾液，供指紋圖譜分析用。

2.4方法學(xué)考察

2.4.1精密度試驗取S6號(四川產(chǎn))姜炭供試品溶液，按照“2.1”項下的色譜條件，自動進(jìn)樣器連續(xù)進(jìn)樣6次，記錄指紋圖譜，對15個共有色譜峰的相對保留時間和相對峰面積的RSD計算結(jié)果表明，相對保留時間的RSD為0.02%～0.57%，相對峰面積的RSD為1.14%～2.72%；采用《中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)軟件》(2004版A)對6個樣品的指紋圖譜進(jìn)行相似度評價，結(jié)果6次進(jìn)樣指紋圖譜的相似度≥0.992，表明儀器精密度較好，可用于指紋圖譜測定。

2.4.2重復(fù)性試驗取S5號(四川產(chǎn))姜炭藥材粉末6份，每份0.5 g左右，按照“2.3”項下方法制備供試品溶液并測定其指紋圖譜，并計算15個共有色譜峰的相對保留時間和相對峰面積的RSD。結(jié)果表明，相對保留時間的RSD為0.28%～0.52%，相對峰面積的RSD為0.65%～2.87%，以《中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)軟件》(2004版A)評價，6份樣品的相似度≥0.981，表明樣品處理方法的重復(fù)性較好。

2.4.3穩(wěn)定性試驗取S2號(山東產(chǎn))姜炭供試品溶液，按照“2.1”項下的色譜條件，分別在樣品處理完成的第0、4、8、12、16、24 h進(jìn)樣，記錄色譜圖。計算15個共有色譜峰的相對保留時間和相對峰面積的RSD。結(jié)果表明，相對保留時間的RSD為0.13%～0.57%，相對峰面積的RSD為1.53%～2.16%，以《中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)軟件》(2004版A)評價，6個時間點(diǎn)的指紋圖譜相似度≥0.951，表明樣品溶液至少在24 h內(nèi)較穩(wěn)定。

2.4.4數(shù)據(jù)處理相似度評價采用國家藥典委員會《中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)軟件》(2004A版)；采用SPSS 16.0分析軟件進(jìn)行系統(tǒng)聚類分析；偏最小二乘法判別分析(partial least squares-discriminate analysis, PLA-DA)采用SIMCA 13.0分析軟件進(jìn)行。

2.5指紋圖譜測定與建立[4-5]分別取“2.2”項下的混合對照品溶液和14批姜炭供試品溶液，按“2.1”項下色譜條件進(jìn)行測定，分別得到5種對照品混合溶液和14批不同產(chǎn)地姜炭樣品的指紋圖譜。采用《中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)軟件》(2004版A)處理所得到的姜炭藥材圖譜，并生成姜炭藥材共有模式的對照指紋圖譜，5種對照品混合液和樣品的共有模式色譜圖見圖1。

圖1　混合對照品(A)和姜炭藥材共有模式(B)色譜圖

《中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)軟件》(2004版A)共匹配了15個色譜峰。通過與對照品保留時間比對，共指認(rèn)15個色譜峰中的5個峰，分別是3號峰(姜酮)，5號峰(6-姜酚)，6號峰(8-姜酚)，7號峰(6-姜烯酚)，9號峰(10-姜酚)。其中7號色譜峰(6-姜烯酚)出峰時間位于中間，面積最大且分離度較好，設(shè)為參照色譜峰。

2.6相似度評價將實(shí)驗所得的14批姜炭藥材UPLC圖譜以分析儀器關(guān)聯(lián)(analytical instrument association, AIA)格式導(dǎo)出，再依次導(dǎo)入《中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)軟件》(2004版A)軟件，以S1號(河北產(chǎn))樣品圖譜作為參照圖譜進(jìn)行指紋匹配，14批姜炭樣品匹配了15個共有色譜峰，并建立了姜炭藥材的共有模式指紋圖譜。14批姜炭樣品的相似度計算結(jié)果和疊加指紋圖譜分別見表1和圖2。結(jié)果顯示，14批藥材中相似度低于0.9的有5批，其中4批產(chǎn)地為四川。由于采用的炮制工藝較為均一，推測姜炭藥材的質(zhì)量差異主要發(fā)生在藥材的生長、干燥、儲存等環(huán)節(jié)。

表1　14份姜炭樣品來源

2.7系統(tǒng)聚類分析以共有色譜峰峰面積的積分值作為數(shù)據(jù)源，采用SPSS 16.0軟件對14批姜炭樣品進(jìn)行系統(tǒng)聚類分析，采用組間平均數(shù)聯(lián)結(jié)法(average linkage between groups)，以夾角余弦作為樣品相似度的距離公式，聚類樹形圖見圖3。根據(jù)圖3聚類分析結(jié)果，14批姜炭樣品大致可分為聚為4大類，Ⅰ類包括S1和S14，質(zhì)量最好；Ⅱ類包括S7、S11、S9、S10、S13、S8、S3、S2和S5，質(zhì)量較好；Ⅲ類包括S6和S12，質(zhì)量次之；S4單獨(dú)成類，與前3類樣品差異較大，質(zhì)量最差。各樣品聚類分析的相關(guān)性與指紋圖譜相似度之間的相關(guān)性，總體趨勢較一致。

圖2　14批姜炭藥材UPLC指紋圖譜疊加圖

2.8PLS-DA[6-7]將14批姜炭的共有樣品色譜峰面積數(shù)據(jù)導(dǎo)入SIMCA 13.0軟件，進(jìn)行PLS-DA分析。圖4(A)可見14批樣品均在95%置信區(qū)間內(nèi)，

分布在t1軸的左右兩側(cè)，左側(cè)有3批樣品，右側(cè)有11批樣品，根據(jù)相似度和聚類分析結(jié)果可見，左側(cè)的3批樣品即S12、S6、S4相似度較低，與其他樣品聚類距離較遠(yuǎn)，屬質(zhì)量較差樣品；右側(cè)的11批姜炭又被t2軸分為上下2類，上面的4個樣品屬質(zhì)量較佳的樣品，下面7批樣品屬質(zhì)量居中，應(yīng)屬合格樣品，相似度、聚類分析和PLS-DA的分析結(jié)果基本一致，可相互印證。PLS-DA分析各色譜峰(F)的VIP得分圖表明，色譜峰變量對樣品分類的影響大小排序為F15>F3>F14>F9>F7>F12>F13>F8>F10>F5>F6>F2>F4>F11>F1；其中VIP值>1.0的色譜峰共有10個，分別是F15、F3、F14、F9、F7、F12、F13、F8、F10、F5，說明姜炭的質(zhì)量差異是由總體色譜峰群的影響所導(dǎo)致的。

圖3　姜炭樣品聚類分析結(jié)果

圖414批姜炭樣品PLS-DA圖(A.樣品得分圖；B.各色譜峰變量投影重要性分析得分圖)

4討論

姜既是必不可少的調(diào)味品，又是臨床常用的中藥材，其常用炮制品有干姜、炮姜和姜炭等，其中姜炭是由干姜高溫炒炭存性的炮制品。姜中含多種姜酚類活性成分，具有抗血小板聚集，抗氧化和抗炎、降糖和抗腫瘤等多種作用[8-9]。而干姜炒炭后辛味消失，其溫中作用弱于干姜和炮姜，更擅長溫經(jīng)止血，可用于各種虛寒性出血。姜酚類成分具有多酚羥基結(jié)構(gòu)特點(diǎn)，在酸、堿、熱等環(huán)境下多酚羥基結(jié)構(gòu)易脫水形成姜烯酚[10]，這可能是干姜制炭后辛味消失，具有溫經(jīng)止血作用的機(jī)制之一。

炭藥炮制工藝的關(guān)鍵是“炒炭存性”，即既要保證藥物在高溫下其外部色澤炭化變黑，又要保持藥物內(nèi)部固有的色、嗅、味性能，切忌灰化[11]。中藥制成炭藥后多具有止血作用，這是制炭后藥材多成分變化共同的結(jié)果，因而在炭藥的質(zhì)量控制方面，單靠測定已知的單一指標(biāo)成分的含量是不夠的，應(yīng)從指紋圖譜等角度為炮制工藝及質(zhì)量控制提供更全面的參考。色譜指紋圖譜鑒別方法可以較全面地反映中藥化學(xué)成分的種類與數(shù)量，進(jìn)而反映中藥的質(zhì)量和中醫(yī)用藥所體現(xiàn)的整體療效[12]。

本實(shí)驗過程中對樣品處理方法、流動相系統(tǒng)、柱溫、流速、檢測波長和進(jìn)樣量等試驗條件均進(jìn)行了優(yōu)化，最終得到最佳的實(shí)驗條件，建立了姜炭藥材的指紋圖譜。通過相似度分析、聚類分析和PLS-DA模式識別分析相互印證，能將各產(chǎn)地藥材質(zhì)量較清晰地區(qū)別和分類。本次樣品多購自市售藥材市場，但姜炭為姜的炮制品，受產(chǎn)地、采收年限和炮制過程的影響較大，實(shí)驗結(jié)果基本反映了目前市售藥材的質(zhì)量狀況。實(shí)驗所建立的指紋圖譜對于控制姜炭的藥材質(zhì)量有一定的參考意義，結(jié)合實(shí)際情況對于姜炭的指紋圖譜質(zhì)量控制，可以考慮以相似度在0.9以上的樣品為參照。

參考文獻(xiàn)：

[1]國家藥典委員會．中華人民共和國藥典：一部[M]．北京：中國醫(yī)藥科技出版社，2010:13.

[2]石宇華.干姜的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)及干姜、炮姜和姜炭的化學(xué)成分比較研究[D].成都：成都中醫(yī)藥大學(xué)，2008：30-51.

[3]王維皓，李娟，高慧敏，等.從HPLC特征圖譜分析姜在炮制過程中的化學(xué)成分變化[J].藥物分析雜志，2009,29(8):1248-1252.

[4]劉芷，賈英，趙旭，等.五味子的UPLC指紋圖譜研究[J].中草藥，2014，45(11)：1631-1633.

[5]唐崢，畢開順，韓飛，等.梔子大黃湯UFLC指紋圖譜研究[J].中草藥，2014，45(3)：367-372.

[6]云琦，劉青旺，馬小華，等.新疆桃仁HPLC-UV指紋圖譜研究及在地區(qū)分類中的應(yīng)用[J].中國中藥雜志，2014,39(5):860-866.

[7]周喜丹，唐力英，周國洪，等.HPLC指紋圖譜鑒別葶藶子與車前子[J].中國中藥雜志，2015,40(2):275-279.

[8]Rahmani AH, Shabrmi FM, Aly SM. Active ingredients of ginger as potential candidates in the prevention and treatment of diseases via modulation of biological activities[J]. Int J Physiol Pathophysiol Pharmacol,2014，6(2):125-136.

[9]Ghlissi Z, Atheymen R, Boujbiha MA, et al. Antioxidant and androgenic effects of dietary ginger on reproductive function of male diabetic rats[J]. Int J Food Sci Nutr, 2013，64(8):974-978.

[10]黃雪松，宴日安，吳建中.姜酚的生物活性述評[J].暨南大學(xué)學(xué)報(自然科學(xué)版)，2005,26(3)：434-439.

[11]徐慧青.淺析炭藥的炮制質(zhì)量控制[J].浙江醫(yī)學(xué)教育，2009,8(4)：43-44.

[12]羅軍，卿娟，張麗艷，等.續(xù)斷生品與酒炙品HPLC指紋圖譜及其成分差異分析[J].中藥材,2015,38(3):493-496.

A Study of Ultra-Performance Liquid Chromatography Fingerprint of Ginger Charcoal

HANYan-quan1,HONGYan2,XIALun-zhu1,WANGYong-zhong1,SHENYe-bing1,LIYu-xin1,2,GAOJia-rong1

(1.TheFirstAffiliatedHospitalofAnhuiUniversityofChineseMedicine&Grade3LaboratoryofTraditionalChineseMedicinePreparation,StateAdministrationofTraditionalChineseMedicine,AnhuiHefei230031,China; 2.ClinicalSchoolofTraditionalChineseandWesternMedicine,AnhuiUniversityofChineseMedicine,AnhuiHefei230038,China)

[Abstract]ObjectiveTo establish the fingerprint of ginger charcoal by ultra-performance liquid chromatography-photodiode array (UPLC-PDA). MethodsThe UPLC BEH column C18(2.1 mm × 100 mm, 1.7 μm) was used with a mobile phase of water-acetonitrile for gradient elution at a flow rate of 0.25 mL/min, a column temperature of 30 ℃, and a detection wavelength of 280 nm; similarity analysis, cluster analysis, and partial least squares discriminant analysis were performed for the fingerprints of 14 batches of samples. ResultsThe laboratory test identified 5 out of 15 common chromatographic peaks in the fingerprints; of all the 14 batches of ginger charcoal produced in different places, 9 had a similarity higher than 0.9 and were clustered into 4 categories, and 10 chromatographic peaks had a VIP score higher than 1.0. ConclusionThe method to establish fingerprints is simple, stable, and feasible, and can be applied for the quality evaluation and categorization of ginger charcoal.

[Key words]Ginger charcoal; UPLC fingerprint; Partial least squares discriminant analysis for pattern recognition

收稿日期：(2015-07-27；編輯：姚實(shí)林)

通信作者：高家榮，zyfygjr2006@163.com

作者簡介：韓燕全(1978-)，男，博士，副主任中藥師

基金項目：國家自然科學(xué)基金項目(81102811)；安徽省自然科學(xué)基金項目(10040606Q40)；國家中醫(yī)藥重點(diǎn)學(xué)科臨床中藥學(xué)建設(shè)項目(國中醫(yī)藥人教發(fā)[2012]32號)

[中圖分類號]R284.1[DOI]10.3969/j.issn.2095-7246.2016.01.025