代振江， 梁海英， 曾智勇*， 湯德元， 王偉丞， 劉 釗

(1.貴州大學(xué) 動物科學(xué)學(xué)院， 貴州 貴陽 550025； 2.貴州省動物疫病控制中心， 貴州 貴陽 550025)

豬流行性腹瀉病毒的分離及其M基因的生物信息學(xué)分析

代振江1， 梁海英1， 曾智勇1*， 湯德元1， 王偉丞2， 劉 釗1

(1.貴州大學(xué) 動物科學(xué)學(xué)院， 貴州 貴陽 550025； 2.貴州省動物疫病控制中心， 貴州 貴陽 550025)

為了解貴州豬流行性腹瀉病毒(Porcine epidemic diarrhea virus, PEDV)的變異情況，對分離PEDV的M基因進(jìn)行了克隆測序和生物信息學(xué)分析。結(jié)果表明：分離的PEDV株(用N-GZ表示)與貴州省動物疫病研究室曾報道的PEDV株(用GZ表示)位于同一進(jìn)化分支，與疫苗株CV777處于不同進(jìn)化分支。N-GZ株與GZ株M基因的核苷酸序列相似性為98.5%，表明其親緣關(guān)系較近，與CV777疫苗株的親緣關(guān)系稍遠(yuǎn)。多重比較發(fā)現(xiàn)，N-GZ株與CV777株M蛋白的抗原表位區(qū)存在3個氨基酸的差異，與GZ株相比存在2個氨基酸的突變。M基因是PEDV的保守基因，但N-GZ株M基因在抗原表位區(qū)存在一定程度突變。

PEDV； M蛋白； 變異； 生物信息學(xué)分析

豬流行性腹瀉是由豬流行性腹瀉病毒(Porcine epidemic diarrhea virus, PEDV)引起的一種接觸性腸道傳染病，主要以引起初生仔豬腹瀉、嘔吐和脫水為基本特征[1-3]。PEDV是冠狀病毒科冠狀病毒屬的線性單股正鏈RNA病毒，PEDV全基因組長為27 000～33 000個核苷酸，其中含有6個開放性閱讀框(ORF)[4-6]，包括6個基因，分別為復(fù)制酶基因(Rep)、纖突蛋白基因(S)、ORF3基因、囊膜蛋白基因(E)、膜蛋白基因(M)和核衣殼蛋白基因(N)[7-10]。其中，PEDV的M基因負(fù)責(zé)編碼PEDV的膜糖蛋白，該蛋白對病毒的裝配和成熟起重要作用，同時也是病毒刺激機體產(chǎn)生免疫保護抗體的重要結(jié)構(gòu)蛋白，在PEDV膜蛋白的組裝過程中發(fā)揮重要作用，M蛋白可以介導(dǎo)細(xì)胞融合，能誘導(dǎo)宿主產(chǎn)生無中和活性的特異性抗體，同時還能間接誘導(dǎo)α-干擾素的表達(dá)，研究M基因有助于了解各PEDV毒株間M基因的差異和PEDV的流行變異情況[11-13]，但貴州的PEDV毒株間M基因是否存在差異和PEDV的流行變異情況尚無報道。筆者對N-GZ株的M全基因進(jìn)行了克隆和序列分析并與NG株和CV777株進(jìn)行分析比較，了解其變異情況，以期為豬場對PEDV的免疫防控提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

病毒材料采自貴陽市某豬場腹瀉仔豬的大、小腸及其內(nèi)容物，DL2000 Marker、Prime Script One Step RT-PCR Kit VER 2.0、PMD19-T Simple Vector 購于大連寶生物公司，Gel Extraction Kit 購自北京莊盟國際生物有限公司，Plasmid Miniprep Kit 采購于OMEGA公司，其余試劑皆為國產(chǎn)分析純。

1.2 RNA的提取

將采集的病毒材料充分研磨，反復(fù)凍融3次后勻漿，4℃ 12 000 r/min 離心10 min，取上清，根據(jù)Prime Script One Step RT-PCR Kit VER 2.0說明書提取RNA，保存于-20℃?zhèn)溆谩?/p>

1.3 引物的設(shè)計與合成

用王偉丞等[14]設(shè)計的引物對目的片段進(jìn)行擴增，預(yù)計擴增片段大小為681 bp，上游引物為5′-TCGGAATTCATGTCTAACGGTTCT-3′，下游引物為5′-ACGCTCGAGTTAGACTAAATGAAG-3′。

1.4 RT-PCR 擴增

以提取的核酸為模版，用上述引物對目的片段進(jìn)行擴增，反應(yīng)體系為25 μL：模版3 μL，2×1 Buffer 12.5 μL，上下游引物各0.5 μL，One Step Enzyme Mix 1 μL，RNase Free H2O 8 μL。反應(yīng)條件為50℃反轉(zhuǎn)錄40 min；94℃預(yù)變性5 min；94℃變性 30 s，55℃退火30 s，72℃延伸30 s，35個循環(huán)；72℃延伸10 min。用1.5%的瓊脂糖凝膠對其進(jìn)行電泳檢測。

1.5 目的基因的克隆與序列分析

用Gel Extraction Kit膠回收試劑盒對目的產(chǎn)物進(jìn)行回收純化，將純化產(chǎn)物用常規(guī)方法連接至pMD19-T載體，并轉(zhuǎn)化到Top10感受態(tài)細(xì)胞，在37℃恒溫箱過夜培養(yǎng)后挑取陽性菌落于含有氨芐的LB營養(yǎng)液中，于37℃搖床中培養(yǎng)10 h，用試劑盒提取質(zhì)粒，通過質(zhì)粒PCR對其進(jìn)行鑒定。將鑒定為陽性的克隆質(zhì)粒送至大連寶生物公司進(jìn)行測序。用DNA Star 軟件對N-GZ、GZ和M基因進(jìn)行氨基酸序列的多重比對，用DNA Star軟件對M基因進(jìn)行核酸序列相似性分析，用SignalP在線軟件分別對N-GZ株、GZ株和CV777株的M蛋白信號肽進(jìn)行預(yù)測，用KinasePhos軟件預(yù)測其磷酸化位點，用ProtParam預(yù)測M蛋白的親疏水性，用Protean軟件對M蛋白的二級結(jié)構(gòu)預(yù)測，用TMHMM Server v. 2.0對其跨膜螺旋區(qū)預(yù)測。

2 結(jié)果與分析

2.1 目的片段的擴增與克隆質(zhì)粒的鑒定

瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果顯示，通過RT-PCR獲得與目的片段大小一致的681 bp片段，表明成功擴增M基因，通過質(zhì)粒PCR對克隆的質(zhì)粒進(jìn)行鑒定，結(jié)果顯示克隆成功(圖1)。測序結(jié)果表明，克隆的目的片段大小為681 bp，說明成功克隆了PEDV的M基因。

2.2M基因的生物信息學(xué)

2.2.1 PEDVM基因的相似性 新分離株(用N-GZ表示)與王偉丞等[14]分離的PEDV株(用GZ表示)M基因的核苷酸序列相似性為98.5%，與CV777株的相似性為96.7%，GZ株與CV777相似性為98.2%，與NCBI上公布的其他PEDV分離株M基因相似性為95.8%～98.5%，說明M基因較為保守。

注：1：擴增的目的片段；2：質(zhì)粒PCR產(chǎn)物；M1, M2：DL2000 Marker

Note: 1: Amplification product of purpose segment; 2: Plasmid PCR product; M1, M2: DL2000 Marker.

圖 1M基因的擴增產(chǎn)物和克隆質(zhì)粒的PCR 鑒定圖譜

Fig.1 Amplification product ofMgene and PCR identification of cloned plasmid

2.2.2 遺傳進(jìn)化樹的構(gòu)建 基于PEDVM基因的核苷酸序列，用MEGA5.0軟件構(gòu)建遺傳進(jìn)化樹(圖2)。構(gòu)建的進(jìn)化樹顯示，N-GZ株與GZ株位于同一進(jìn)化分支，N-GZ與CV777株位于不同進(jìn)化分支且遺傳進(jìn)化關(guān)系較遠(yuǎn)。

圖2 基于M基因核酸序列構(gòu)建的遺傳進(jìn)化樹

Fig.2 Phylogenetic tree constructed according to the nucleotide sequence ofMgene

圖3 M基因氨基酸序列的多重比對

Fig.3 Multiple alignment of amino acid sequence forMgene

2.2.3 目的基因的多重序列比對 如圖3所示，N-GZ株與CV777株M基因編碼的第3、11、13、16、32、42、214、225位氨基酸有差異，與GZ株的第3、11、16、32、225位氨基酸有差異。

2.2.4M基因序列翻譯后的加工修飾預(yù)測 3株毒株均不存在信號肽，3株P(guān)EDV毒株M基因編碼的膜糖蛋白存在19個絲氨酸磷酸化位點、18個蘇氨酸磷酸化位點、9個酪氨酸磷酸化位點。3株毒株均為疏水蛋白質(zhì)。

2.2.5 目的蛋白二級結(jié)構(gòu)的預(yù)測 對N-GZ、GZ和CV777毒株的M蛋白的二級結(jié)構(gòu)預(yù)測表明，N-GZ株的M蛋白存在10個α螺旋、16個β折疊、9個T-轉(zhuǎn)角、9個無規(guī)卷曲；GZ株的M蛋白存在10個α螺旋、16個β折疊、10個T-轉(zhuǎn)角、10個無規(guī)卷曲；CV777毒株的M蛋白存在10個α螺旋、18個β折疊、10個T轉(zhuǎn)角、9個無規(guī)卷曲。3株毒株的M蛋白皆存在3個跨膜螺旋區(qū)。

3 結(jié)論與討論

為了解貴州省PEDV的遺傳變異情況，對N-GZ株的M基因進(jìn)行了克隆測序和生物信息學(xué)分析。基于核酸序列進(jìn)行的相似性分析發(fā)現(xiàn)，N-GZ株與其他毒株的相似性為95.8%～98.5%，與GZ株的相似性為98.5%，與CV777毒株的相似性為96.7%?；贛基因核酸序列構(gòu)建的進(jìn)化樹顯示，CV777與2株貴州PEDV毒株均不在同一進(jìn)化分支，從進(jìn)化樹看，二者與疫苗株遺傳距離較遠(yuǎn)。N-GZ株與GZ株位于同一進(jìn)化分支，說明在2個不同豬場暴發(fā)的PEDV為同一毒株。有資料表明，M蛋白N端的第1～19位氨基酸為有效表位抗原區(qū)，其核心序列為第5～16位氨基酸[15]。對M基因氨基酸序列進(jìn)行多重序列比對發(fā)現(xiàn)，與CV777株在M蛋白N端的抗原表位區(qū)存在3個氨基酸的差異，與GZ株相比存在2個氨基酸的突變，這些差異和突變可能致使B細(xì)胞對PEDV的識別和處理能力發(fā)生改變，由此影響機體針對PEDV抗體的產(chǎn)生。除此之外，N-GZ與GZ株還存在3個氨基酸的差異，與CV777株存在5個氨基酸的差異。針對這些差異，預(yù)測3株毒株的二級結(jié)構(gòu)發(fā)現(xiàn)，僅β折疊、無規(guī)卷曲和T-轉(zhuǎn)角的數(shù)目有差異，但該差異是否會導(dǎo)致M蛋白功能的變化還有待進(jìn)一步研究。

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(責(zé)任編輯： 劉忠麗)

Separation and Bioinformatics Analysis of PEDVMGene

DAI Zhenjiang1, LIANG Haiying1, ZENG Zhiyong1*, TANG Deyuan1, WANG Weicheng2, LIU Zhao1

(1.CollegeofAnimalScience,GuizhouUniversity,Guiyang,Guizhou550025; 2.GuizhouAnimalEpidemicDiseaseControlCenter,Guiyang,Guizhou550025,China)

In order to know the mutation of Guizhou PEDV, theMgene was cloned, sequenced and analyzed by bioinformatics software in this study. Results: Phylogenetic tree showed that the current separated PEDV strain (N-GZ) and the previous separated PEDV (NG ) were in the same branch, the N-GZ and the vaccine strain CV777 were in the different branches.The similarity of the N-GZ and GZ was 98.5%, it suggested that the two PEDV strains appeared in two different pig farms were the same PEDV strain. The result of sequence alignment showed that there were three amino acids to be different in the M protein epitope domain of N-GZ and CV777 and two amino acids to be different with GZ. TheMgene is a conserved gene of PEDV, but a certain extent mutation appeared in epitope domain ofMgene from N-GZ strain.

PEDV; M protein; mutation; bioinformatics

2015-08-19； 2016-03-01修回

貴州省農(nóng)業(yè)科技攻關(guān)項目“貴州省規(guī)?；i場豬繁殖障礙性疫病防控體系的研究與示范”[黔科合NY字(2010)3042]；貴州省動物疫病防控與獸醫(yī)公共衛(wèi)生保障科技創(chuàng)新人才團隊[黔科合人才團隊(2015)4016]

代振江(1991-)，男，在讀碩士，研究方向：動物傳染病病原分子生物學(xué)。E-mail:792128405@qq.com

*通訊作者：曾智勇(1978-)，男，教授，博士，從事動物傳染病病原分子生物學(xué)研究。E-mail:as.zyzeng@gzu.edu.cn

1001-3601(2016)04-0152-0028-03

S828

A