張春蕊，賈園園，王艷敏,2，王玉成，楊傳平，王　超*

(1 東北林業(yè)大學(xué)林木遺傳育種國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，哈爾濱 150040；2 黑龍江省林業(yè)科學(xué)研究所, 哈爾濱 150081)

剛毛檉柳液泡膜H+-PPase基因的克隆與脅迫下的表達(dá)分析

張春蕊1，賈園園1，王艷敏1,2，王玉成1，楊傳平1，王超1*

(1 東北林業(yè)大學(xué)林木遺傳育種國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，哈爾濱 150040；2 黑龍江省林業(yè)科學(xué)研究所, 哈爾濱 150081)

摘要:通過(guò)對(duì)剛毛檉柳轉(zhuǎn)錄組分析，鑒定獲得1個(gè)液泡膜H+-PPase基因的cDNA序列,命名為ThVP1。該cDNA序列全長(zhǎng)3 022 bp，開放閱讀框?yàn)? 298 bp，編碼765個(gè)氨基酸，編碼蛋白相對(duì)分子質(zhì)量80.37 kD，理論等電點(diǎn)5.25。ThVP1 編碼蛋白的疏水性較強(qiáng)，含有13個(gè)跨膜區(qū)。氨基酸多序列比對(duì)結(jié)果顯示，ThVP1具有典型的液泡膜H+-PPase 家族3個(gè)高度保守片段(CS1 、CS2 和CS3)，與大豆VP1氨基酸序列一致性最高，為93%。系統(tǒng)進(jìn)化分析表明，ThVP1屬于I型液泡膜H+-PPase基因。實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR分析顯示，NaCl和PEG脅迫下，ThVP1在檉柳根和葉中均呈現(xiàn)明顯上調(diào)表達(dá)，表達(dá)量最高達(dá)到對(duì)照的20.9倍，暗示ThVP1可能在剛毛檉柳抗旱耐鹽過(guò)程中發(fā)揮重要作用。

關(guān)鍵詞:剛毛檉柳；液泡膜H+-PPase；脅迫響應(yīng)；基因表達(dá)

高鹽和干旱是限制植物生長(zhǎng)和發(fā)育的主要逆境因素，土壤中大量Na+進(jìn)入細(xì)胞后，會(huì)造成植物細(xì)胞脫水，細(xì)胞的離子平衡紊亂，影響植物正常生理代謝，從而抑制植物的生長(zhǎng)發(fā)育，嚴(yán)重時(shí)可以導(dǎo)致植物死亡[1]。鹽生植物主要依靠離子區(qū)隔化的方法，通過(guò)液泡膜Na+/H+逆向轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白將細(xì)胞質(zhì)中過(guò)多的Na+區(qū)隔到液泡中[2]，從而減輕Na+對(duì)細(xì)胞質(zhì)內(nèi)的各類代謝酶的危害，同時(shí)降低了細(xì)胞滲透勢(shì)，進(jìn)而提高植物的耐鹽性和抗旱性。而在此過(guò)程中，液泡膜質(zhì)子泵(H+-ATPase和H+-PPase)為Na+/H+逆向轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白逆濃度梯度將Na+轉(zhuǎn)入液泡中提供質(zhì)子驅(qū)動(dòng)力[3-4]。

液泡膜H+-PPase，又稱液泡膜H+轉(zhuǎn)運(yùn)無(wú)機(jī)焦磷酸酶(H+-pyrophosphatase，H+-PPase，EC3.6.1.1)，是一種區(qū)別于H+-ATPase 的H+轉(zhuǎn)運(yùn)酶，廣泛存在于植物、少數(shù)藻類、原生動(dòng)物、細(xì)菌以及原始細(xì)菌中[5-6]。在液泡膜上，H+-PPase 能夠把無(wú)機(jī)焦磷酸(PPi)水解為2個(gè)Pi，同時(shí)產(chǎn)生的自由能催化H+由胞質(zhì)向液泡的運(yùn)輸，與液泡膜H+-ATPase一起，為各種溶質(zhì)分子(如陽(yáng)離子、陰離子、氨基酸和糖類等)的跨液泡膜主動(dòng)運(yùn)輸提供驅(qū)動(dòng)力，起到質(zhì)子泵的作用[7-8]。1992年，Sarafian等[9]從擬南芥(Arabidopsisthaliana)中克隆出高等植物的第1個(gè)液泡膜H+-PPase基因AVP1(M81892)。1999年，Gaxiola等[10]將擬南芥液泡膜H+-PPase基因AVP1在酵母鹽敏感突變體ena1上超表達(dá)后，該突變體恢復(fù)了耐鹽性；隨后，Gaxiola 等[11]將帶有35S啟動(dòng)子的AVP1基因轉(zhuǎn)入擬南芥，與野生型相比，AVP1超表達(dá)的轉(zhuǎn)基因植株能在250 mmol/L NaCl處理下正常生長(zhǎng)，耐鹽性和耐旱性顯著提高，在轉(zhuǎn)基因植株液泡中，包括Na+在內(nèi)的陽(yáng)離子的積累明顯增加。過(guò)表達(dá)AVP1基因的番茄(Lycopersiconesculentum)和陸地棉(Gossypiumhirsutum)轉(zhuǎn)基因植株也表現(xiàn)出比野生型植株更強(qiáng)的對(duì)干旱和鹽脅迫的耐受性[12-13]。這些研究都表明了液泡膜H+-PPase在植物響應(yīng)逆境脅迫中起著重要作用。

迄今為止，已從許多高等植物中克隆到液泡膜H+-PPase基因[3]，然而這些基因大多數(shù)都來(lái)自抗逆性不強(qiáng)的模式植物或農(nóng)作物上。剛毛檉柳(Tamarixhispida)是一種具有很強(qiáng)抗逆能力的木本鹽生植物，能在含鹽量達(dá)1%的土壤中形成天然林，因此是研究木本植物耐鹽機(jī)理和進(jìn)行耐鹽基因克隆的理想材料。本研究通過(guò)對(duì)剛毛檉柳根部組織轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)分析，克隆獲得了1條剛毛檉柳液泡膜H+-PPase基因(ThVP1)全長(zhǎng)cDNA 序列，并對(duì)該序列進(jìn)行了生物信息學(xué)分析，進(jìn)一步利用實(shí)時(shí)定量RT-PCR技術(shù)分析了其在鹽和干旱脅迫下不同時(shí)間點(diǎn)的表達(dá)模式，以期了解該基因在檉柳非生物脅迫應(yīng)答中的功能。

1材料和方法

1.1實(shí)驗(yàn)材料與處理

剛毛檉柳種子采自中國(guó)科學(xué)院吐魯番沙漠植物園。將剛毛檉柳種子播種于V(泥炭土)∶V(沙) =2∶1的混合土壤中，置于平均溫度24 ℃、光照/暗時(shí)間16 h/8 h、相對(duì)濕度70%～75%的溫室中培養(yǎng)。選取生長(zhǎng)狀態(tài)良好和長(zhǎng)勢(shì)一致的2月齡剛毛檉柳幼苗，分別用20%(w/v)PEG6000和0.4 mol/L NaCl進(jìn)行脅迫處理，同時(shí)用正常澆水幼苗作為對(duì)照。在脅迫3、6、9、12、24、48、72和96 h后取剛毛檉柳的根部組織和地上部分組織，每個(gè)處理重復(fù)3次，每個(gè)樣品取20棵幼苗，將其充分混勻，用液氮速凍，置于-80 ℃冰箱用于RNA的提取。

1.2方法

1.2.1總RNA的提取采用CTAB法提取剛毛檉柳在各處理下不同時(shí)間點(diǎn)的根部組織和地上部分組織的總RNA，按照Prime ScriptTMRT reagent Kit(TaKaRa)進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄合成cDNA，置于-20℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2液泡膜ThVP1全長(zhǎng)cDNA序列克隆與分析通過(guò)對(duì)剛毛檉柳轉(zhuǎn)錄組測(cè)序數(shù)據(jù)的分析，根據(jù)Unigenes功能注釋結(jié)果獲得1條液泡膜H+-PPase基因(ThVP1)的序列。以檉柳cDNA為模板對(duì)該基因進(jìn)行PCR擴(kuò)增，目的條帶經(jīng)膠回收純化后，連接到pMD18-T載體上進(jìn)行測(cè)序。利用在線工具ORF founder (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/gorf/gorf.html)分析ThVP1的開放讀碼框；利用ExPASy (http://www.expasy.org/tools/protparam.html)在線軟件預(yù)測(cè)ThVP1編碼的氨基酸序列的分子量及理論等電點(diǎn)。利用Bioedit對(duì)ThVP1的同源蛋白序列進(jìn)行多序列比對(duì)；利用MEGA5.0軟件中Neighbor-Joining方法構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹；利用二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)軟件(https://www.predictprotein.org/)預(yù)測(cè)ThVP1基因編碼的蛋白質(zhì)的二級(jí)結(jié)構(gòu)。利用在線工具TMpred(http://www.genome.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/)預(yù)測(cè)ThVP1可能的跨膜區(qū)；利用Protscale(http://web.expasy.org/cgi-bin/protscale/protscale.pl)在線分析ThVP1蛋白質(zhì)的疏水性。應(yīng)用WoLF PSORT軟件(http://wolfpsort.seq.cbrc.jp/)進(jìn)行亞細(xì)胞定位預(yù)測(cè)。

表1　實(shí)時(shí)定量RT-PCR 引物序列

1.2.3實(shí)時(shí)定量RT-PCR根據(jù)ThVP1全長(zhǎng)cDNA序列設(shè)計(jì)定量引物，以剛毛檉柳β-actin (FJ618517)、β-tubulin (FJ618518) 和β-tubulin (FJ618519)基因作為內(nèi)參基因，引物序列見(jiàn)表1。利用MJ Opticon實(shí)時(shí)定量PCR儀(Bio-Rad，Hercules，CA)分析ThVP1的表達(dá)情況。實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR使用試劑盒TransStart Top Green qPCR SuperMix(TransGen)進(jìn)行，反應(yīng)體系：2×TransStart Top Green qPCR SuperMix 10 μL，上游引物和下游引物(10 μmol/L)各1 μL，稀釋后的模板cDNA 2 μL，加滅菌去離子水補(bǔ)足體積至20 μL。反應(yīng)程序?yàn)椋?4 ℃預(yù)變性30 s；94 ℃變性12 s，58 ℃退火30 s，72 ℃延伸45 s，79 ℃讀板1 s，45個(gè)循環(huán)。待PCR反應(yīng)結(jié)束后，將反應(yīng)溫度以0.5 ℃/s的速度從55 ℃升到99 ℃。每個(gè)樣品重復(fù)3次，用2-ΔΔCt方法進(jìn)行基因的相對(duì)定量分析[14-15]。

2結(jié)果和分析

2.1ThVP1基因全長(zhǎng)cDNA的獲得及序列分析

通過(guò)對(duì)剛毛檉柳轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)分析，獲得1條編碼H+-PPase基因的序列。由于轉(zhuǎn)錄組測(cè)序獲得的基因序列是由小片段拼接而成，為了確保序列的準(zhǔn)確性，我們克隆了該基因并進(jìn)行測(cè)序，獲得的測(cè)序結(jié)果與轉(zhuǎn)錄組測(cè)序拼接的編碼序列完全相同。利用NCBI 網(wǎng)站在線軟件對(duì)該基因編碼蛋白進(jìn)行保守結(jié)構(gòu)域分析，結(jié)果顯示：其屬于H+轉(zhuǎn)運(yùn)無(wú)機(jī)焦磷酸酶超家族，具有典型的H+-PPase結(jié)構(gòu)域(圖1)，將該基因命名為ThVP1(GenBank登錄號(hào)KU880710)。ThVP1基因cDNA全長(zhǎng)為3 022 bp，包含2 298 bp完整的開放讀碼框，編碼765個(gè)氨基酸。推測(cè)ThVP1編碼蛋白質(zhì)的分子量為80.37 kD，理論等電點(diǎn)為5.25，分子式為 C3670H5772N900O1053S32。

采用Predictprotein軟件預(yù)測(cè)ThVP1編碼蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)(圖2)，結(jié)果表明：該蛋白質(zhì)的二級(jí)結(jié)構(gòu)中，α-螺旋和無(wú)規(guī)則卷曲占主要部分，分別占60.92%和33.86%。疏水結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)表明，ThVP1編碼蛋白質(zhì)具有明顯的疏水區(qū)，且均勻分布于整個(gè)肽鏈(圖3)?？缒そY(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)顯示，該蛋白包含13個(gè)跨膜螺旋結(jié)構(gòu)(圖4)，亞細(xì)胞定位預(yù)測(cè)顯示其定位于液泡膜上，表明ThVP1是一個(gè)液泡膜跨膜蛋白。

2.2ThVP1同源比對(duì)與進(jìn)化樹構(gòu)建

將ThVP1的氨基酸序列與10種植物液泡膜H+-PPase的氨基酸序列進(jìn)行同源性比較，結(jié)果顯示ThVP1與其他植物的VP1氨基酸序列一致性較高，為93%～89%。ThVP1具有H+-PPase家族高度保守的3個(gè)結(jié)構(gòu)域(CS1，CS2和CS3)，其中CS1 中包含保守的DVGADLVGKVE氨基酸序列, 與H+-PPase家族基因結(jié)構(gòu)一致(圖6)[16-17]。

利用MEGA5.0軟件對(duì)不同植物的H+-PPase基因氨基酸序列構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(圖5)，結(jié)果顯示ThVP1與南瓜CmVP1等I類液泡膜H+-PPase親緣關(guān)系較近，而與擬南芥VP2等Ⅱ類液泡膜H+-PPase親緣關(guān)系較遠(yuǎn)，表明ThVP1是檉柳的一個(gè)I類液泡膜H+-PPase。

2.3非生物脅迫下ThVP1基因的表達(dá)

為了進(jìn)一步研究ThVP1基因?qū)δ婢趁{迫的響應(yīng)情況，采用實(shí)時(shí)RT-PCR方法分析其在NaCl和PEG脅迫下的表達(dá)模式。ThVP1在高鹽及干旱脅迫下均呈現(xiàn)為表達(dá)上調(diào)，但在各脅迫時(shí)間點(diǎn)和不同組織中的表達(dá)模式有所差異(圖7)。在NaCl脅迫下，ThVP1在檉柳根部表達(dá)量迅速上升，在脅迫6 h表達(dá)量達(dá)到最高，表達(dá)上調(diào)12.2倍，隨著脅迫時(shí)間的延長(zhǎng)，ThVP1表達(dá)量又逐漸降低；在地上部組織中，ThVP1表達(dá)量在3 和12 h呈現(xiàn)2個(gè)高峰，表達(dá)分別上調(diào)20.9和17.9倍。

在PEG6000模擬干旱脅迫下，ThVP1在檉柳根部和地上組織表達(dá)均呈現(xiàn)先上升再下降的趨勢(shì)。在根部組織中，ThVP1在脅迫12 h表達(dá)量達(dá)到頂峰，表達(dá)上調(diào)14.2倍；在地上部組織中，ThVP1表達(dá)量在6 h達(dá)到最大值，表達(dá)上調(diào)16.5倍。

圖2　ThVP1蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)Fig. 2　Secondary structure prediction of ThVP1

圖1　ThVP1保守結(jié)構(gòu)域分析Fig. 1　Conserved domain analysis of ThVP1

圖3　ThVP1蛋白質(zhì)的疏水結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)Fig. 3　Hydrophobicity analysis of ThVP1

圖4　ThVP1蛋白質(zhì)的跨膜結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)Fig. 4　Transmembrane domain prediction of the antiporter protein ThVP1

標(biāo)尺代表每單位氨基酸的變化，0.1代表兩個(gè)序列之間10%的差異; ThVP1. 剛毛檉柳；VrVP1. 綠豆；OsVP1.水稻；HbVP1. 橡膠樹；GhVP1. 棉花；NtVP1.煙草；AtVP1. 擬南芥；SbVP1.高粱；AtVP2. 擬南芥；BvVP1. 甜菜；CmVP1. 南瓜；TaVP1. 小麥；HvVP1. 大麥；ZmVP1. 玉米；ZmVP2. 玉米；ThVP2. 鹽芥；VvVP2. 葡萄圖5　幾種植物VP蛋白同源序列的系統(tǒng)進(jìn)化樹分析The scale bar expected the number of substitution per site, 0.1 means 10% changes were observed between two sequences;ThVP1. Tamarix hispida(KU880710); VrVP1. Vigna radiata (AB009077); OsVP1. Oryza sativa(BAD02277.1); HbVP1. Hevea brasiliensis(AY514019); GhVP1.Gossypium hirsutum (ADN96173); NtVP1. Nicotiana tabacum(X77915); AtVP1. Arabidopsis thaliana(M81892); SbVP1. Sorghum bicolor (ADJ67258); AtVP2.Arabidopsis thaliana(AF182813); BvVP1. Beta vulgaris(L32791); CmVP1. Cucurbita moschata (BAA3333149); TaVP1. Triticum aestivum(AY296911); HvVP1. Hordeum vulgare(ACA63883); ZmVP1. Zea mays(CAG29370);ZmVP2. Zea mays(ABK51382); ThVP2. Eutrema halophilum(BAJ33614); VvVP2. Vitis vinifera(CA041672)Fig. 5　Phylogenetic tree analysis of VP proteins from various plant species

綜上所述，ThVP1對(duì)高鹽和干旱脅迫具有明顯的響應(yīng)，在檉柳根部和地上組織中表達(dá)量顯著上升，表明ThVP1可能參與檉柳抗旱耐鹽生理過(guò)程。同時(shí)發(fā)現(xiàn)ThVP1在地上部相對(duì)表達(dá)量高于根部，推測(cè)其主要在檉柳葉和莖中發(fā)揮抗逆功能。

3討論

離子區(qū)隔化是植物進(jìn)行滲透調(diào)節(jié)的主要方式之一，液泡膜H+-PPase作為質(zhì)子泵，在植物離子區(qū)隔化過(guò)程中發(fā)揮重要的作用。研究發(fā)現(xiàn)，大多數(shù)植物H+-PPase基因的開放讀碼框(ORF)含有2 283～2 319個(gè)核苷酸，編碼大約761 ～ 773個(gè)氨基酸殘基，分子量為80～81 kD[18-21]，不同物種中的H+-PPase基因具有高度的序列同源性[22]。本研究從剛毛檉柳中克隆到H+-PPase基因ThVP1，其開放閱讀框長(zhǎng)2 298 bp，編碼765個(gè)氨基酸，分子量為80.37 kDa。ThVP1具有植物H+-PPase共有的氨基酸序列DVGADLVGKVE，與大豆、菜豆、巨桉、棉花等植物的液泡膜H+-PPase基因具有較高同源性。因此，ThVP1在結(jié)構(gòu)上符合植物液泡膜H+-PPase的特性。

粗線框表示保守結(jié)構(gòu)域CS1；虛線框表示保守結(jié)構(gòu)域CS2；細(xì)線框表示保守結(jié)構(gòu)域CS3； 圖中從上至下依次代表的是剛毛檉柳、大豆、菜豆、巨桉、棉花、可可樹、油棕、馬鈴薯、蘋果、毛果楊的H+-PPase氨基酸序列圖6　ThVP1與其他植物H+-PPase同源序列的比較The thick lines stand for conserved domain CS1; dashed box stand for conserved domain CS2; thin box stand for conserved domain CS3;The amino acid sequences in the map which from the top to the bottom represent: Tamarix hispida (KU880710), Glycine max (XP_003542656.1), Phaseolus vulgaris (XP_007155080.1), Eucalyptus grandis (XP_010050115.1), Gossypium hirsutum (ADN96173.1), Theobroma cacao ( XP_007013600.1), Elaeis guineensis (XP_010928300.1), Solanum tuberosum ( XP_006359496.1), Malus domestica (XP_008352108.1) and Populus trichocarpa (XP_006381091.1)Fig. 6　Alignment analysis of ThVP1 with H+-PPase from other plants

圖7　ThVP1基因在不同脅迫下的表達(dá)模式分析Fig. 7　Expression analysis of ThVP1 gene under several abiotic stresses

高等植物中存在2種類型的液泡膜H+-PPase：Ⅰ型和Ⅱ型。Ⅰ型依賴K+激活而適度被Ca2+激活，Ⅱ型對(duì)K+不敏感而對(duì)Ca2+極其敏感[23-24]。這2種類型的H+-PPase在氨基酸序列相似性僅有37%～39%，在細(xì)胞中參與不同的生理過(guò)程，目前對(duì)Ⅰ型功能的研究多于Ⅱ型[25]。本研究中的檉柳ThVP1與大豆、擬南芥等植物的Ⅰ型H+-PPase的氨基酸序列相似性較高(>80%)，親緣關(guān)系較近；而與擬南芥Ⅱ型H+-PPase氨基酸序列相似較低(<40%)，表明ThVP1屬于Ⅰ型液泡膜H+-PPase。

盡管不同物種中的H+-PPase基因具有高度的同源性，但研究發(fā)現(xiàn)不同植物的H+-PPase基因轉(zhuǎn)錄水平或活性對(duì)鹽脅迫的響應(yīng)存在很大差異。Colombo 和Cerana報(bào)道鹽脅迫可提高胡蘿卜懸浮細(xì)胞中液泡膜H+-PPase活性[26]；Fukuda 等[27]用100 mmol/L NaCl 處理大麥后，其根中H+-PPase基因轉(zhuǎn)錄水平顯著升高，表明NaCl誘導(dǎo)H+-PPase活性或轉(zhuǎn)錄水平增加。然而，有研究發(fā)現(xiàn)Na+對(duì)一些植物的H+-PPase具有抑制作用。Nakamura 等[28]發(fā)現(xiàn)100 mmol/L NaCl 處理下綠豆根部H+-PPase活性受到強(qiáng)烈抑制。NaCl處理下冰葉日中花(Mesembryanthemumcrystallinum)中H+-PPase的含量和活性均下降。這些研究結(jié)果表明H+-PPase活性或轉(zhuǎn)錄水平的變化可能與植物種類、器官類型、發(fā)育狀態(tài)等諸多因素有關(guān)。為了研究液泡膜H+-PPase基因在檉柳非生物脅迫應(yīng)答中的功能，本研究采用實(shí)時(shí)RT-PCR方法分析ThVP1在NaCl和PEG脅迫下的表達(dá)模式。在NaCl和PEG脅迫處理后，ThVP1基因在檉柳的根部和地上部的表達(dá)量均明顯增加，特別是在地上部組織中，ThVP1基因在脅迫后呈現(xiàn)高豐度表達(dá)。ThVP1在干旱和高鹽脅迫下的表達(dá)變化也存在器官差異性，其在地上部的相對(duì)表達(dá)量高于根部，推測(cè)其主要在檉柳葉和莖中參與對(duì)Na+的隔離，從而提高檉柳的耐鹽和抗旱能力。

2001年，Gaxiola等[11]報(bào)道了過(guò)表達(dá)擬南芥液泡膜H+-PPase基因AVP1提高了轉(zhuǎn)基因擬南芥的抗旱耐鹽能力。此后，鹽芥、鹽地堿蓬、沙冬青、鹽爪爪的H+-PPase基因的抗逆功能也得到了驗(yàn)證[29-31]。 這些研究表明利用轉(zhuǎn)化液泡膜H+-PPase基因提高植物的耐鹽能力，是利用基因工程方法培育耐鹽植物新品種的一種有效途徑。剛毛檉柳是具有優(yōu)良抗逆能力的鹽生植物，與甜土植物相比，鹽生植物的離子區(qū)隔化更為明顯和有效。ThVP1對(duì)干旱和鹽分脅迫高度響應(yīng)，暗示其可能在剛毛檉柳離子區(qū)隔化過(guò)程中發(fā)揮重要作用[32]。 后續(xù)研究將把ThVP1轉(zhuǎn)入擬南芥和檉柳中驗(yàn)證其抗逆功能，以期為植物抗逆育種提供有效的基因資源。

參考文獻(xiàn):

[1]ZHU J. Plant salt tolerance[J].TrendsinPlantScience,2001, (6):66-71．

[2]BLUMWALD E ,POOLE R J. Na/H antiport in isolated tonoplast vesicles from storage tissue ofBetavulgaris[J].PlantPhysiology,1985,78(1):163-167．

[3]BLUMWALD E. Tonoplast vesicles for the study of ion transport in plant vacuoles[J].Physiol.Plantarum,1987, (69):731-734．

[4]王延枝. 植物液泡膜上的焦磷酸酶[J]. 植物生理學(xué)通訊. 1990，(4): 73-76.

WANG Y Z. Plant vacuole membrane pyrophosphatase[J].PlantPhysiologyCommunications,1990，(4):73-76 .

[5]MAESHIMA M. Vacuolar H+-pyrophosphatase[J].BiochimicaetBiophysicaActa-biomembranes,2000,1 465(1):37-51．

[6]DROZDOWICZ Y M,REA P A. Vacuolar H(+)pyrophosphatases: from the evolutionary backwaters into the mainstream[J].TrendsinPlantScience,2001,6(5):206-211．

[7]BUCHANAN BB G W J R. Biochemistry and Molecular Biology of Plants[M].AmerimanSocietyofPlantPhysiologists,2000:637-638．

[8]包愛(ài)科，張金林，郭正剛，等. 液泡膜H+-PPase與植物耐鹽性[J]. 植物生理學(xué)通訊. 2006, (4): 777-783.

BAO A K, ZHANG J L,GUO Z G,etal. Tonoplast H+-pyrophosphatase involved in plant salt tolerance[J].PlantPhysiologyCommunications,2006,42(4):777-783 .

[9]SARAFIAN V, KIM Y, POOLE R J,etal. Molecular cloning and sequence of cDNA encoding the pyrophosphate-energized vacuolar membrane proton pump ofArabidopsisthaliana[J].ProceedingsoftheNationalAcademyofSciences,1992,89(5):1 775-1 779．

[10]GAXIOLA R A, RAO R, SHERMAN A,etal. TheArabidopsisthalianaproton transporters, AtNhx1 and Avp1, can function in cation detoxification in yeast[J].ProceedingsoftheNationalAcademyofSciences,1999,96(4) :1 480-1 485．

[11]GAXIOLA R A, LI J, UNDURRAGA S,etal. Drought- and salt-tolerant plants result from overexpression of the AVP1 H+-pump[J].ProceedingsoftheNationalAcademyofSciences,2001,98(20): 11 444-11 449．

[12]PARK S ,LI J ,PITTMAN J K,etal. Up-regulation of a H+-pyrophosphatase (H+-PPase) as a strategy to engineer drought-resistant crop plants[J].ProceedingsoftheNationalAcademyofSciences,2005,102(52):18 830-18 835．

[13]PASAPULA V ,SHEN G ,KUPPU S ,etal. Expression of anArabidopsisvacuolar H+-pyrophosphatase gene (AVP1) in cotton improves drought- and salt tolerance and increases fibre yield in the field conditions[J].PlantBiotechnologyJournal,2011,9(1):88-99．

[14]LIVAK K J ,SCHMITTGEN T D. Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2[-Delta Delta C(T)] method[J].Methods,2001,25(4):402-408.

[15]VANDESOMPELE J ,De PRETER K ,PATTYN F ,etal. Accurate normalization of real-time quantitative RT-PCR data by geometric averaging of multiple internal control genes[J].GenomeBiology,2002,3(7):H34．

[16]DROZDOWICZYM K J R. AVP2,a sequence-divergent,K+-insensitive H+-translocating in organic pyrophosphatase fromArabidopsis[J].PlantPhysiology,2000,123(1) :353-362．

[17]ZHU J K. Plant salt tolerance[J].TrendsinPlantScience,2001,6(2):66-71．

[18]REA P A, KIM Y, SARAFIAN V,etal. Vacuolar H(+)-translocating pyrophosphatases: a new category of ion translocase[J].TrendsinBiochemicalSciences,1992,17(9):348-353．

[19]MAESHIMA M. TONOPLAST TRANSPORTERS: Organization and function[J].AnnualReviewofPlantPhysiologyandPlantMolecularBiology,2001,52:469-497．

[20]LüSY J Y P X. cDNA cloning of a vacuolar H+-pyrophosphatase and its expression inHordeumbrevisubulatum(Trin.) Link. in response to salt stress[J].AgriculturalSciencesinChina,2005,4(4): 247～251．

[21]SARAFIAN V, KIM Y, POOLE R J,etal. Molecular cloning and sequence of cDNA encoding the pyrophosphate-energized vacuolar membrane proton pump ofArabidopsisthaliana[J].ProceedingsoftheNationalAcademyofSciences,1992,89(5):1 775-1 779．

[22]NAKANISHI Y, MAESHIMA M. Molecular cloning of vacuolar H(+)-pyrophosphatase and its developmental expression in growing hypocotyl of mung bean[J].PlantPhysiology,1998,116(2):589-597.

[23]SERRANO A, PEREZ-CASTINEIRA J R, BALTSCHEFFSKY M,etal. H+-PPases: yesterday, today and tomorrow[J].IubmbLife,2007,59(2) :76-83.

[24]GAXIOLA RA P M S K. Plant proton pumps[J].FebsLetters,2007,581:2 204-2 214.

[25]MOHAMMED S A, NISHIO S,TAKAHASHI H,etal. Role of vacuolar H+-inorganic pyrophosphatase in tomato fruit development[J].JournalofExperimentalBotany,2012,63(15):5 613-5 621.

[26]R C R C. Enhanced activity of tonoplast pyrophosphatase in NaCl.Grown cells ofDaucuscarota[J].JournalofPlantPhysiology,1993,142(2)：226-229．

[27]FUKUDA A C K M M. Effect of salt and osmotic stresses on the vacuolar H+-pyrophosphatase, H+-ATPase subunit A, and Na+/H+antiport from barley[J].JournalofExperimentalBotany,2004,55(397): 585-594．

[28]BREMBERGER C ,LUTTGE U. Dynamics of tonoplast proton pumps and other tonoplast proteins ofMesembryanthemumcrystallinumL. during the induction of crassulacean acid metabolism[J].Planta,1992,188(4) :575-580．

[29]GAO F, GAO Q, DUAN X,etal. Cloning of an H+-PPase gene fromThellungiellahalophilaand its heterologous expression to improve tobacco salt tolerance[J].JournalofExperimentalBotany,2006,57(12) :3 259-3 270.

[30]GUO S, YIN H, ZHANG X,etal. Molecular cloning and characterization of a vacuolar H+-pyrophosphatase gene,SsVP, from the halophyteSuaedasalsaand its overexpression increases salt and drought tolerance ofArabidopsis[J].PlantMolecularBiology,2006,60(1) :41-50．

[31]YAO M, ZENG Y, LIU L,etal. Overexpression of the halophyteKalidiumfoliatumH(+)-pyrophosphatase gene confers salt and drought tolerance inArabidopsisthaliana[J].MolecularBiologyReports,2012,39(8) :7 989-7 996．

[32]BLUMWALD E . Sodium transport and salt tolerance in plants[J].CurrentOpinioninCellBiology, 2000,12(4): 431-434.

(編輯:宋亞珍)

Cloning and Expression Analysis of a Vacuolar H+-PPase Gene fromTamarixhispida

ZHANG Chunrui1，JIA Yuanyuan1，WANG Yanmin1、2，WANG Yucheng1，YANG Chuanping1，WANG Chao1*

(1 State Key Laboratory of Tree Genetics and Breeding, Northeast Forestry University, Harbin 150040,China; 2 Heilongjiang Forestry Academy of Science, Harbin 150081,China)

Abstract:A full length cDNA of a vacuolar H+-PPase gene (named ThVP1) was isolated from the transcriptome cDNA librarys of Tamarix hispida. ThVP1 was 3 022 bp in length, including an open reading frame of 2 298 bp which was predicted to encode a polypeptide of 765 amino acids. The estimated molecular weight and isoelectric points of the putative protein were 80.37 kD and 5.25, respectively. Hydrophobicity analysis and transmembrane domain prediction indicated that the ThVP1 contained 13 potential transmembrane domains with strong hydrophobicity. The amino acids sequence of ThVP1 contains three conservative domains (CS1, CS2 and CS3)，which shows 93% identities in amino acids sequence to vacuolar H+-PPase genes from Reaumuria trigyna. Phylogenetic analysis indicates that ThVP1 belongs to class I type vacuolar H+-PPase gene. Quantitative real-time PCR assay revealed that the mRNA level of ThVP1 was significantly up-regulated by more than 20- fold higher than that of control under NaCl and PEG treatments in Tamarix hispida, suggesting that ThVP1 might play an important role in salt and drought tolerance of T. hispida.

Key words:Tamarix hispida; vacuolar H+-PPase; stress responses; gene expression

文章編號(hào):1000-4025(2016)05-0881-07

doi:10.7606/j.issn.1000-4025.2016.05.0881

收稿日期:2016-01-22;修改稿收到日期:2016-04-28

基金項(xiàng)目:國(guó)家自然科學(xué)基金(31300571)；教育部博士點(diǎn)基金(20130062120012)

作者簡(jiǎn)介:張春蕊(1991-)，女，在讀碩士研究生，主要從事林木抗逆機(jī)理研究。 E-mail. zcr_sherry@163.com *通信作者:王超，博士，副教授，碩士生導(dǎo)師，主要從事林木分子育種研究。E-mail. wzyrgm@163.com

中圖分類號(hào):Q786

文獻(xiàn)標(biāo)志碼:A