●高厚明劉志承 石巧玲 馮四林

厚樸酚改善LPS誘導(dǎo)的小鼠抑郁行為和大腦細(xì)胞因子的研究※

●高厚明*劉志承 石巧玲 馮四林

目的：研究厚樸酚對(duì)脂多糖(LPS)誘導(dǎo)的小鼠抑郁行為及其大腦細(xì)胞因子表達(dá)的影響。方法：厚樸酚(10, 20mg·kg-1)和陽(yáng)性藥鹽酸氟西汀(15mg·kg-1)連續(xù)灌胃給藥7天后，腹腔注射LPS 0.83mg·kg-1，采用糖水實(shí)驗(yàn)觀察厚樸酚對(duì)糖水偏好值的影響，采用強(qiáng)迫游泳實(shí)驗(yàn)觀察厚樸酚對(duì)不動(dòng)時(shí)間的影響，并采用RT-PCR檢測(cè)厚樸酚對(duì)大腦白細(xì)胞介素-1β(IL-1β)、白細(xì)胞介素-6(IL-6)和腫瘤壞死因子-α(TNF-α)的mRNA表達(dá)的影響。結(jié)果：行為學(xué)實(shí)驗(yàn)表明LPS顯著降低小鼠糖水偏好值，增加小鼠不動(dòng)時(shí)間；分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)表明LPS顯著增加大腦IL-1β、IL-6和TNF-α mRNA的表達(dá)量。厚樸酚(10，20mg·kg-1)和鹽酸氟西汀(15mg·kg-1)給藥7天后，顯著改善上述異常。結(jié)論：厚樸酚對(duì)大腦促炎性細(xì)胞因子IL-1β、IL-6和TNF-α的抑制作用可能是厚樸酚抗抑郁作用機(jī)制之一。

厚樸酚 抗抑郁 促炎性細(xì)胞因子

當(dāng)今社會(huì)競(jìng)爭(zhēng)日趨激烈，人們不斷承受來(lái)自各方面的壓力，導(dǎo)致人類(lèi)精神性疾病發(fā)病率與日俱增。據(jù)報(bào)道，目前全球約有17%人口患有精神性疾病——抑郁癥，該病在世界十大疾病中排位第四，但據(jù)WHO預(yù)測(cè)，到2020年抑郁癥將會(huì)上升至第二，僅次于癌癥[1]。促炎性細(xì)胞因子是由淋巴細(xì)胞和巨噬細(xì)胞等免疫細(xì)胞分泌的調(diào)節(jié)免疫應(yīng)答的信號(hào)分子，目前研究發(fā)現(xiàn)促炎性細(xì)胞因子在中樞神經(jīng)系統(tǒng)調(diào)節(jié)神經(jīng)生化，神經(jīng)內(nèi)分泌和行為的改變，參與抑郁癥的發(fā)生和抗抑郁藥的治療[2]。

厚樸酚是傳統(tǒng)中藥厚樸的主要活性成分，具有抗衰老、抗腫瘤、降低膽固醇、抗抑郁和抗炎等藥理活性。本研究基于促炎性細(xì)胞因子與抑郁癥之間存在的復(fù)雜關(guān)系為基礎(chǔ)，研究厚樸酚對(duì)LPS小鼠抑郁模型的行為學(xué)影響，并進(jìn)一步研究厚樸酚抗抑郁的可能作用機(jī)制。

1 材料

1.1 動(dòng)物 SPF級(jí)健康ICR雄性小鼠，體重18～22 g，購(gòu)自上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司，動(dòng)物合格證號(hào)：SCXK(滬)2012-0005。小鼠糖水適應(yīng)性3次后開(kāi)始實(shí)驗(yàn)。

1.2 試劑 厚樸酚(批號(hào)：110729)購(gòu)自中國(guó)藥品生物制造檢定所，鹽酸氟西汀(批號(hào)：20130701)購(gòu)自常州四藥制藥有限公司；PCR相關(guān)試劑購(gòu)買(mǎi)自海門(mén)碧云天公司；IL-1β引物：上游：5'-AAGATGAAGGGCTGCTTCCAAACC-3′，下游：5′-ATACTGCCTGCCTGAAGCTCTTGT-3′；IL-6引物：上游：5′-CCAGAAACCGCTATGAAGTTCCT-3′，下游：5′-CACCAGCATCAGTCCCAAGA-3′；TNF-α引物：上游：5′-CGTCAGCCGATTTGCTATCT-3′，下游：5′-CGGACTCCGCAAAGTCTAAG-3′；β-actin內(nèi)參引物：上游：5′-TGGAATCCTGTGGCATCCATGAAAC-3′，下游：5′-TAAAACGCAGCTCAGTAACAGTCCG-3′，均由上海生工生物技術(shù)服務(wù)有限公司合成。

1.3 儀器 7500型熒光定量PCR儀(美國(guó)ABI公司)；MK3酶標(biāo)儀(美國(guó)Thermo公司)；3K-15高速冷凍離心機(jī)(德國(guó)Sigma公司)；LX-200-迷你離心機(jī)(海門(mén)其林貝爾公司)；JY92-IIN-超聲波細(xì)胞破碎儀(寧波新芝公司)；HF R76數(shù)碼攝像機(jī)(日本佳能公司)。

2 方法

2.1 分組與給藥 實(shí)驗(yàn)分為5組，每組10只小鼠，包括正常對(duì)照組、模型對(duì)照組、鹽酸氟西汀組(15mg·kg-1)、厚樸酚組(10，20mg·kg-1)。小鼠連續(xù)給藥7天，第7天給藥后1小時(shí)注射LPS(0.83mg·kg-1)，于給藥24小時(shí)后進(jìn)行糖水實(shí)驗(yàn)，36小時(shí)后進(jìn)行強(qiáng)迫游泳實(shí)驗(yàn)。

2.2 糖水實(shí)驗(yàn)[3]小鼠被水食剝奪12h，正式實(shí)驗(yàn)在20：30am開(kāi)始進(jìn)行：隨機(jī)在每個(gè)鼠籠放置兩瓶已稱(chēng)重的100mL蔗糖水和已稱(chēng)重的100mL清水，并記錄重量，12h之后，把兩個(gè)水瓶取下，并立即再次稱(chēng)重，記錄數(shù)據(jù)。糖水偏好值=糖水消耗/(糖水消耗+清水消耗)×100%。

2.3 強(qiáng)迫游泳實(shí)驗(yàn)[4]將小鼠放在圓柱型玻璃容器內(nèi)，其內(nèi)注有15cm高的水，用攝像機(jī)記錄時(shí)間為6min，統(tǒng)計(jì)最后4min的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)，統(tǒng)計(jì)參數(shù)以秒為計(jì)時(shí)單位。統(tǒng)計(jì)此時(shí)間內(nèi)小鼠的不動(dòng)時(shí)間，即小鼠頭部保持處于水面上方，四肢不動(dòng)處于漂浮狀態(tài)。

2.4 RT-PCR實(shí)驗(yàn) 組織樣品1：10 加入預(yù)冷的Trizol 試劑，迅速充分勻漿。吸取勻漿液于1. 5mL 離心管中，室溫放置5～10min。接著加入0.2mL 三氯甲烷，劇烈震蕩15s，室溫放置3min。之后12000r·min-1離心10min。吸取上清水相轉(zhuǎn)移至干凈的離心管中，加入等體積異丙醇，混勻，室溫放置20min。12000r·min-1離心10min，棄上清。底部出現(xiàn)的白色沉淀即RNA。加入1mL 75% 乙醇洗滌沉淀。12000 r·min-1離心3min，棄上清。室溫干燥5～10min。加入30～50μL RNase-free ddH2O，充分溶解RNA 后將溶液置于-80℃保存。按照熒光定量試劑盒測(cè)定IL-1β、IL-6和TNF-α mRNA表達(dá)量。

3 結(jié)果

3.1 厚樸酚對(duì)LPS抑郁小鼠糖水偏好值的影響 腹腔注射LPS后，模型對(duì)照組小鼠糖水偏好值顯著低于正常對(duì)照組(P<0.01)。鹽酸氟西汀(15mg·kg-1)和厚樸酚(10，20mg·kg-1)給藥7天顯著升高糖水偏好值，與模型對(duì)照組相比均有極顯著性差異(P<0.01)。見(jiàn)表1。

表1 厚樸酚對(duì)LPS抑郁小鼠糖水偏好值和不動(dòng)時(shí)間的影響

注：與正常對(duì)照組比較，##P<0.01；與模型對(duì)照組比較，**P<0.05，**P<0.01。

3.2 厚樸酚對(duì)LPS抑郁小鼠不動(dòng)時(shí)間的影響 腹腔注射LPS后，模型對(duì)照組小鼠不動(dòng)時(shí)間顯著高于正常對(duì)照組(P<0.01)。鹽酸氟西汀(15mg·kg-1)和厚樸酚給藥7天顯著降低不動(dòng)時(shí)間，其中20mg·kg-1厚樸酚與模型對(duì)照組相比有極顯著性差異(P<0.01)。見(jiàn)表1。

3.3 厚樸酚對(duì)LPS抑郁小鼠大腦促炎性細(xì)胞因子IL-1β、IL-6和TNF-α mRNA表達(dá)量的影響 腹腔注射LPS后，模型對(duì)照組促炎性細(xì)胞因子IL-1β、IL-6和TNF-αmRNA表達(dá)量顯著升高，與正常對(duì)照組相比均具有極顯著性差異(P<0.01)。鹽酸氟西汀(15mg·kg-1)和厚樸酚(10，20mg·kg-1)給藥7天后3種促炎性細(xì)胞因子均顯著降低，與模型對(duì)照組相比均有顯著性差異(P<0.01)。見(jiàn)表2。

表2 厚樸酚對(duì)LPS抑郁小鼠大腦IL-1β、IL-6和TNF-α mRNA表達(dá)量的影響

注：與正常對(duì)照組比較，##P<0.01；與模型對(duì)照組比較，**P<0.01。

4 討論

現(xiàn)在臨床上廣泛應(yīng)用的抗抑郁藥物普遍具有惡心、出汗增多、頭痛等副作用，所以急需發(fā)現(xiàn)副作用小的藥物代替臨床上的抗抑郁藥物，同時(shí)也需要研究導(dǎo)致抑郁癥發(fā)生的多種因素，從而為抑郁癥的治療提供更多的靶標(biāo)因子，因此越來(lái)越多的研究開(kāi)始聚焦于天然植物提取物或有效成分的研究。

大量臨床研究表明，抑郁癥患者外周血中促炎性細(xì)胞因子IL-1β、IL-6和TNF-α含量顯著高于正常人，抗抑郁藥治療之后可以抑制外周血中促炎性細(xì)胞因子水平的升高[5，6]。同時(shí)，動(dòng)物實(shí)驗(yàn)也清楚地表明，抑郁動(dòng)物大腦和外周血促炎性細(xì)胞因子異常升高，給藥之后均可降低促炎性細(xì)胞因子的水平，同時(shí)改善抑郁動(dòng)物行為[7，8]。提示抗炎藥物具有潛在的抗抑郁活性，并且如果炎癥的確是抑郁癥的病因之一，那么抗炎作用應(yīng)該參與抗抑郁藥的作用機(jī)制。考慮到厚樸酚具有抗炎作用[9]，并且前期實(shí)驗(yàn)證明其具備抗抑郁作用，因此本實(shí)驗(yàn)著重探討抗炎機(jī)制是否參與厚樸酚的抗抑郁作用。

研究發(fā)現(xiàn)厚樸酚可以增加抑郁小鼠的糖水偏好值，降低抑郁小鼠的不動(dòng)時(shí)間，與前期實(shí)驗(yàn)的結(jié)果基本相符[10，11]，再次確認(rèn)厚樸酚具有抗抑郁作用。并且厚樸酚給藥7天后可以顯著降低大腦促炎性細(xì)胞因子IL-1β、IL-6和TNF-α的含量，表明厚樸酚的抗抑郁作用與抗炎作用相關(guān)。但是，厚樸酚改善大腦IL-1β、IL-6和TNF-α表達(dá)后，如何通過(guò)下游信號(hào)分子改善抑郁癥狀，還有待進(jìn)一步的研究。

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廣東省深圳市科技研發(fā)資金(No.JCYJ 20150401163247216)

高厚明，男，副主任中藥師，研究方向：中藥藥理與臨床。

廣東省深圳市中醫(yī)院(518033)