胡 波，范志宇，王 芳，魏后軍，宋艷華，仇汝龍，劉 星，徐為中，薛家賓

(江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院獸醫(yī)研究所/農(nóng)業(yè)部獸用生物制品工程技術(shù)重點實驗室/國家獸用生物制品工程技術(shù)研究中心，江蘇南京 210014)

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患兔流行性腹脹病家兔腸道菌群結(jié)構(gòu)的ERIC-PCR指紋圖譜分析

胡 波，范志宇，王 芳*，魏后軍，宋艷華，仇汝龍，劉 星，徐為中，薛家賓

(江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院獸醫(yī)研究所/農(nóng)業(yè)部獸用生物制品工程技術(shù)重點實驗室/國家獸用生物制品工程技術(shù)研究中心，江蘇南京 210014)

兔流行性腹脹病是2004年春以來我國發(fā)生的由特定病原菌引起的家兔傳染性疾病，具有一定的傳染性和區(qū)域流行性，但其病原未知[1]。目前在我國江蘇、山東等省份仍有該病的發(fā)生和流行。病兔主要表現(xiàn)為腹部臌脹、有膠凍樣黏液排泄物及盲腸阻塞。從患病兔消化道中分離出的單一細(xì)菌不能復(fù)制該疾病的典型病理特征[1-2]。該病的臨床癥狀及病理變化與法國Licois等[3]報道的兔流行性腸病十分相似，有學(xué)者認(rèn)為其可能為同一種病[4]。斷奶仔兔至4月齡兔的發(fā)病率為50%～70%，死亡率可達(dá)90%以上[1-2]。研究表明，大多數(shù)抗生素藥物和抗球蟲藥物對該病沒有明顯療效[2-5]，而在飼料或飲水中添加復(fù)方新諾明[1]、恩拉霉素[2]、微生態(tài)制劑[4-6]等對治療該病有一定效果。除偶有發(fā)現(xiàn)輪狀病毒外，其他病毒(如杯狀病毒、圓環(huán)病毒等)的檢測均呈陰性。因此，認(rèn)為該病是一種腸道細(xì)菌性傳染病[7]。

腸道菌群是一個以專性厭氧菌為主的微生態(tài)系統(tǒng)。由于不能對腸道中所有細(xì)菌種類進(jìn)行分離培養(yǎng)，因而腸道菌群的定性和定量研究比較困難[8]，而分子生態(tài)學(xué)的發(fā)展為解決該問題提供了可能[9]。腸桿菌基因間重復(fù)共有序列基因擴(kuò)增技術(shù)(Enterobacteria repetitive intergenic consensus-PCR，ERIC-PCR)是一種用于分析不同生態(tài)系統(tǒng)結(jié)構(gòu)差異及同一生態(tài)系統(tǒng)中微生物群落結(jié)構(gòu)變化的方法，近年來已應(yīng)用于腸道菌群結(jié)構(gòu)特征的分析[8，10-11]。筆者采用ERIC-PCR 技術(shù)建立了流行性腹脹病兔和正常對照兔的腸道菌群DNA指紋圖譜，并對各組腸道菌群結(jié)構(gòu)的整體差異進(jìn)行了比較，以探討兔流行性腹脹病發(fā)病機(jī)制中家兔腸道微生物的變化及其影響。

1材料與方法

1.1樣品采集兔流行性腹脹病腸道樣品采自江蘇漣水、邳州等地，健康兔腸道樣品采自江蘇南京某兔場。所有樣品采集后立即于-20 ℃下冷凍保存，備用。

1.2試劑與儀器DNA Marker DL 2000購自TaKaRa公司；柱式糞便DNAout提取試劑盒購自北京天恩澤基因科技有限公司；PfxDNA聚合酶購自Invitrogen公司；其他試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.3方法

1.3.1兔腸道細(xì)菌總DNA的提取。取發(fā)病兔及健康對照兔腸道內(nèi)容物，分為小腸和大腸內(nèi)容物標(biāo)本，按照柱式糞便DNAout試劑盒說明書提取細(xì)菌總DNA，紫外分光光度計定量后，-20 ℃下凍存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.2ERIC-PCR反應(yīng)。引物序列參照文獻(xiàn)[12]由Invitrogen公司合成：上游引物ERIC-F，5′- ATGTAAGCTCCTGGGGATTCAC-3′；下游引物ERIC-R，5′- AAGTAAGTGACTGGGGTGAGCG-3′。PCR擴(kuò)增體系為：10×PfxBuffer 5.0 μL、2.5 mmol/L dNTP 4.0 μL、50 mmol/L MgSO42.0 μL、10 mmol/L 上下游引物各1.0 μL、PfxDNA 聚合酶0.4 μL、DNA 模板100 ng，加無菌水至50 μL。PCR反應(yīng)程序：94 ℃預(yù)變性7 min；94 ℃變性30 s，52 ℃退火1 min，68 ℃延伸8 min，30個循環(huán)；68 ℃延伸16 min，結(jié)束反應(yīng)。用1%瓊脂糖凝膠電泳鑒定PCR產(chǎn)物，經(jīng)過凝膠成像分析系統(tǒng)觀察DNA條帶并記錄結(jié)果。

1.3.3ERIC-PCR圖譜分析。假設(shè)每條泳道的每個條帶代表1個細(xì)菌類群，通過電泳圖譜統(tǒng)計樣本中獨特的ERIC條帶的數(shù)量，并制成累積曲線，以分析樣本中ERIC條帶數(shù)量增加的趨勢。使用SensiAnsys分析軟件，將電泳圖譜轉(zhuǎn)化為波峰圖，每個波峰下面積代表1個ERIC條帶的亮度，即代表該細(xì)菌類群的數(shù)量，通過Shannon-Wiener指數(shù)[13]進(jìn)行多樣性分析。

2結(jié)果與分析

2.1樣品DNA指紋圖譜的整體差異從圖1可以看出，所采集的9份兔流行性腹脹病小腸樣品DNA條帶(圖1B)與正常小腸樣品(圖1A)相比無明顯差異，條帶主要分布于100～1 000 bp，說明小腸中菌群的結(jié)構(gòu)較為相似，小腸可能不是流行性腹脹病病原主要定居的部位。采集8份兔流行性腹脹病大腸樣品(圖1D)整體條帶數(shù)目減少，與正常大腸樣品(圖1C)相比疾病組大腸樣品在約350 bp處有1個明顯突出的條帶，該條帶代表的菌群所占比例較高說明腹脹病兔大腸樣品可能存在某一類腸道優(yōu)勢細(xì)菌。

注：A.正常小腸樣品；B.兔流行性腹脹病小腸樣品；C.正常大腸樣品；D.兔流行性腹脹病大腸樣品。M.DNA Marker DL2000;1～9為樣品。Note：A.Normal sample of small intestine；B.Small intestinal sample of rabbits with epidemic abdominal distention disease；C.Normal sample of large intestine；D.Large intestinal sample of rabbits with epidemic abdominal distention disease. M. DNA Marker DL2000;1-9. Samples.圖1　兔腸道菌群DNA指紋圖譜Fig.1　DNA fingerprint of intestinal microflora in rabbits

2.2大腸樣品ERIC-PCR條帶分析為反映大腸樣品中細(xì)菌種類的數(shù)量變化，對ERIC-PCR 圖譜中隨著樣本個體(Xn)的增加，新的ERIC條帶的累加數(shù)量(Yn)進(jìn)行統(tǒng)計，Yn=Yn-1+第n個體與前n-1個個體均不相同的ERIC 條帶數(shù)目。對疾病組樣品和對照組進(jìn)行統(tǒng)計后，得到2組關(guān)于(X，Y)的數(shù)據(jù)，并制成累積曲線(圖2)。從圖2可以看出，疾病組的ERIC條帶總數(shù)和積累曲線的斜率均明顯小于對照組。

圖2　ERIC條帶積累曲線Fig.2　Accumulation curve of ERIC bands

2.3多樣性指數(shù)分析將代表細(xì)菌種類的泳道中各條帶的強(qiáng)弱通過波峰圖轉(zhuǎn)化為細(xì)菌數(shù)量后，以Shannon-Wiener公式分別計算2組大腸樣本ERIC條帶多樣性指數(shù)分布。經(jīng)計算，疾病組個體多樣性指數(shù)為(2.03±0.49)，對照組個體多樣性指數(shù)為(3.30±0.31)，疾病組個體多樣性指數(shù)比正常對照組減少。經(jīng)t檢驗發(fā)現(xiàn)，2組間多樣性指數(shù)存在極顯著差異(P<0.01)。因此，大腸菌群多樣性減少、結(jié)構(gòu)趨于簡單是流行性腹脹病個體的主要特征之一。

3討論與結(jié)論

目前，國內(nèi)外研究均未確定兔流行性腹脹病的病原[1-2，14]，但普遍認(rèn)為兔流行性腹脹病由細(xì)菌性感染引起而非病毒性和寄生蟲性感染引起[14-15]。在腸道疾病的發(fā)生過程中，腸道菌群的變化是一個重要的因素[16]。以前對細(xì)菌性腸道疾病的研究主要通過細(xì)菌純培養(yǎng)的方法，該方法有一定的局限性。由于腸道中多數(shù)未知菌無法進(jìn)行分離培養(yǎng)，因此進(jìn)行細(xì)菌的純培養(yǎng)不能完全準(zhǔn)確反映腸道菌群的結(jié)構(gòu)情況，有時難以發(fā)現(xiàn)與腸道疾病相關(guān)的特異病原菌。

在ERIC-PCR圖譜中，泳帶亮度反映了腸道中的優(yōu)勢菌群，而泳帶數(shù)目和位置反映了腸道菌群的多樣性[17]。筆者通過腸道菌群DNA圖譜分析，發(fā)現(xiàn)病兔與正常對照在小腸腸道菌群無明顯差異，而在大腸腸道菌群存在整體差異。病兔大腸腸道樣本DNA指紋圖譜條帶明顯少于正常對照，且在約350 bp處有高亮主帶。該試驗結(jié)果與臨床癥狀中盲腸阻塞及含有膠凍樣黏液排泄物相互印證。同時，該試驗借用了生態(tài)學(xué)上Shannon-Wiener公式計算大腸樣本ERIC條帶的多樣性指數(shù)分布情況，結(jié)果表明與對照組相比疾病組大腸菌群多樣性指數(shù)的分布減少。這些結(jié)果反映出流行性腹脹病兔個體腸道菌群結(jié)構(gòu)存在明顯的改變，疾病組存在某一類或以某類為主的腸道優(yōu)勢細(xì)菌。

筆者用DNA指紋圖譜技術(shù)首次在分子水平上對流行性腹脹病兔與正常健康兔之間的腸道菌群結(jié)構(gòu)差異和自身的特點做了初步研究，隨著研究的深入可為主要病原的分布和分離鑒定提供一定的依據(jù)。

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摘要[目的]建立患兔流行性腹脹病家兔腸道細(xì)菌的DNA指紋圖譜，并分析其腸道菌群結(jié)構(gòu)特征的整體差異。[方法]提取流行性腹脹病兔及健康兔腸道內(nèi)容物細(xì)菌總DNA，應(yīng)用腸桿菌基因間重復(fù)共有序列基因擴(kuò)增技術(shù)(ERIC-PCR)建立腸道菌群的DNA指紋圖譜，并分析其整體差異。[結(jié)果]病兔大腸樣本DNA條帶明顯少于健康兔對照，而小腸樣本在二者間無明顯差異，說明病兔與健康兔大腸腸道菌群存在整體差異。病兔大腸樣本DNA在約350 bp處出現(xiàn)1條主帶，同時伴有若干較弱的帶，而健康兔對照大腸樣本DNA條帶均無明顯規(guī)律。病兔大腸腸道的微生物群落多樣性指數(shù)為(2.03±0.49)，健康兔大腸腸道的微生物群落多樣性指數(shù)為(3.30±0.31)，差異極顯著(P<0.01)。 [結(jié)論]兔流行性腹脹病發(fā)病兔大腸中腸道菌群結(jié)構(gòu)多樣性降低，可能存在單一或幾種特定的腸道優(yōu)勢菌群。

關(guān)鍵詞兔流行性腹脹??；ERIC-PCR；腸道菌群；多樣性指數(shù)

ERIC-PCR Fingerprint of Intestinal Microflora of Epidemic Abdominal Distention Disease in Domestic Rabbit

HU Bo, FAN Zhi-yu, WANG Fang*et al(Institute of Veterinary Medicine, Jiangsu Academy of Agricultural Sciences/Key Laboratory of Veterinary Biological Engineering and Technology, Ministry of Agriculture/National Center for Engineering Research of Veterinary Bio-products, Nanjing, Jiangsu 210014)

Abstract[Objective] To establish the DNA fingerprint of intestinal microflora of epidemic abdominal distention disease in domestic rabbit, and to analyze the overall structural differences of intestinal microflora. [Method] The total DNAs were extracted from the intestinal samples of rapids, and enterobacterial repetitive intergenic consensus sequence-polymerase chain reaction (ERIC-PCR) was used to set up the DNA fingerprint of intestinal microflora. The overall differences existed among the fingerprints of intestinal microflora were compared. [Result] The number of DNA bands about large intestinal samples was obviously less in diseased rabbits than in healthy subjects, while the small intestinal samples showed similar DNA bands, indicating that significant differences existed in large intestine between diseased rabbits and healthy ones. The principal band of DNA fingerprint of READ samples appeared at about 350 bp, while no principal band was found in healthy samples. The corresponding Shannon’s diversity indexes of diseased rabbits and healthy rabbits were (2.03±0.49) and (3.30±0.31), respectively, showing significant differences (P< 0.01). [Conclusion] The diversity of large intestine microflora significantly reduces compared with healthy rabbits. It is likely that one or more principal microflora exist in the intestinal tissue of READ rabbits.

Key wordsRabbit epidemic abdominal distention disease; ERIC-PCR; Intestinal microflora; Diversity index

收稿日期2015-12-07

作者簡介胡波(1982- )，男，江蘇南京人，助理研究員，碩士，從事畜禽疫病防控與獸醫(yī)生物技術(shù)研究。*通訊作者，研究員，從事畜禽疫病防控與獸醫(yī)生物技術(shù)研究。

基金項目現(xiàn)代農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系建設(shè)專項(CARS-44)。

中圖分類號S 858.291

文獻(xiàn)標(biāo)識碼A

文章編號0517-6611(2016)01-083-03