張 璐,鄭亞軍,李 艷,張有林*,張潤光,張玉峰

(1.陜西師范大學(xué)食品工程與營養(yǎng)科學(xué)學(xué)院，陜西西安 710119;2.海南大學(xué)園藝園林學(xué)院，海南海口 570228;3.中國熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院椰子研究所，海南文昌 571339)

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油棕仁貯藏蛋白質(zhì)亞基組成和含量分析

張 璐1,2,鄭亞軍1,3,李 艷1,張有林1*,張潤光1,張玉峰3

(1.陜西師范大學(xué)食品工程與營養(yǎng)科學(xué)學(xué)院，陜西西安 710119;2.海南大學(xué)園藝園林學(xué)院，海南海口 570228;3.中國熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院椰子研究所，海南文昌 571339)

油棕(ElaeisguineensisL.)果肉含油率46%～50%，果仁含油率50%～60%，其產(chǎn)油量是花生的7～8倍，有“世界油王”之稱[1]。棕油是目前世界上產(chǎn)量和貿(mào)易量第一的植物油，可以用作食用油和燃油，也是許多產(chǎn)業(yè)的關(guān)鍵原料如紡織、化學(xué)品、醫(yī)藥、塑料、清潔劑和潤滑劑等[2]。我國于1926年開始引種油棕，目前在海南、云南、廣西等省有一定的種植面積，但沒有形成規(guī)?；挠妥禺a(chǎn)業(yè)，加工業(yè)尤其落后。目前，我國的棕油幾乎完全依賴進口[3]。

油棕仁粕是棕櫚油加工業(yè)的副產(chǎn)物，僅菲律賓1年的油棕粕產(chǎn)量就達2 310萬t[4]。研究表明，油棕仁粕中蛋白質(zhì)含量為24.3%[5]，是豐富的植物蛋白質(zhì)資源。同時，油棕仁粕蛋白質(zhì)具有較高的營養(yǎng)價值，有較好的溶解性、乳化性及熱穩(wěn)定性[6-7]，開發(fā)潛力較大。然而，目前關(guān)于油棕蛋白質(zhì)開發(fā)利用和研究報道較少，即使在油棕加工業(yè)比較發(fā)達的馬來西亞、尼日利亞等，脫脂油棕粕也僅被作為飼料和肥料[8]，造成植物蛋白質(zhì)資源的浪費。

蛋白質(zhì)分子中各亞基的空間排布及亞基接觸部位的布局和相互作用，被稱為蛋白質(zhì)的四級結(jié)構(gòu)(Quaternary structure)。研究表明，蛋白質(zhì)的四級結(jié)構(gòu)對蛋白理化性質(zhì)和功能活性的影響較大[9]。二硫鍵是穩(wěn)定蛋白質(zhì)四級結(jié)構(gòu)的主要作用力。二硫鍵的含量和位置影響著蛋白質(zhì)的一些功能和活性。一些研究表明，二硫鍵或巰基含量較高的蛋白質(zhì)或多肽具有較好的還原力和絡(luò)合金屬離子的能力[10]。前期研究也表明，半胱氨酸和甲硫氨酸含量較高的油棕谷蛋白具有較好的抗氧化性和Fe2+絡(luò)合能力[5]6940。

對油棕仁貯藏蛋白亞基正確的凝膠電泳分離、鑒別和分析，在油棕的資源篩選及加工利用上有重要的意義。筆者采用變性和非變性SDS-PAGE(十二烷基磺酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳)、Native-PAGE(非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳)凝膠電泳方法對油棕仁貯藏蛋白的亞基組成和含量進行研究，試圖為油棕蛋白質(zhì)的進一步利用提供理論基礎(chǔ)。

1材料與方法

1.1材料供試大葉厚殼型非洲油棕杜拉型(E.guineensisJacqL.L.Dura.,簡稱杜拉型)、非洲油棕丹那拉變種(E.guineensis.Var.tenera，簡稱丹娜拉型)均由中國熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院椰子大觀園提供。

1.2方法

1.2.1脫脂油棕仁粉的制備。選取油棕，去油棕果肉和果殼，得到油棕仁，粉碎，干燥，按料液比1∶10加入無水乙醚，脫脂8 h，過濾，收集濾渣，反復(fù)脫脂3次，在45 ℃干燥2 h，得到脫脂油棕仁粉。

1.2.2油棕仁貯藏蛋白的提取。稱取脫脂油棕仁粉，按料液比1∶20加入0.2 mol/L、pH 8.0的磷酸鹽緩沖液(含0.4 mol/L NaCl),在4 ℃磁力攪拌提取1 h，在4 ℃ 10 000 × g 離心20 min，收集上清液，調(diào)節(jié)pH至4.5，在等電點沉淀0.5 h，攪拌15 min，在 4 ℃10 000 × g 離心20 min， 收集沉淀，復(fù)溶于ddH2O中，在4 ℃ddH2O中透析24 h，冷凍真空干燥，得到油棕仁貯藏蛋白(Oil palm kernel storage proteins，PKSP )。

1.2.3油棕仁貯藏蛋白的電泳試驗方法。

1.2.3.1油棕仁貯藏蛋白的非變性SDS-PAGE[11]。將蛋白質(zhì)溶液與樣品緩沖液按1∶1的比例混合，取15 μl該混合液進行非變性SDS-PAGE凝膠電泳分析?；旌弦褐泻?.125 mol/L Tris-HCl緩沖液(pH 6.8),1% (w/V) SDS,0.05 % (V/V) 溴酚藍和 30%(V/V) 甘油。首先,在不同分離膠濃度(10%、12%、14%和16%)的SDS-PAGE中分離油棕仁貯藏蛋白，確定最佳的分離膠濃度。在恒壓電泳時，濃縮膠電壓為100 V，分離膠電壓為150 V，當(dāng)溴酚藍指示劑跑到距膠底部5 mm時停止電泳，剝下膠片后將膠片放入固定液中固定30 min，然后用考馬斯亮藍R-250染色，過夜，放入脫色液中脫色，直至膠片背景藍色完全透明狀，數(shù)碼照相，在Syngene型凝膠成像系統(tǒng)中分析。

1.2.3.2油棕仁貯藏蛋白的變性SDS-PAGE[12]。為分析油棕仁貯藏蛋白在變性SDS-PAGE下的分離效果，將油棕仁貯藏蛋白溶液與樣品緩沖液按1∶1的比例混合，100 ℃煮沸5 min。其中，所用樣品緩沖液與“1.2.3.1”基本相同，只是增加了5% (V/V)的β-巰基乙醇。在β-巰基乙醇的作用下，蛋白質(zhì)的二硫鍵被打斷，各亞基與SDS結(jié)合呈棒狀且?guī)嗤碾姾?，因而在SDS-PAGE中亞基按照分子量大小進行分離。取15 μl煮好的油棕仁貯藏蛋白溶液，在濃縮膠為7.5%、分離膠為12.0%的SDS-PAGE中恒壓電泳，濃縮膠電壓為100 V，分離膠電壓為150 V，當(dāng)溴酚藍指示劑跑到距膠底部5 mm時停止電泳。染色，脫色，數(shù)碼照相，在Syngene型凝膠成像系統(tǒng)中分析。為確定亞基的分子量，以低分子量標(biāo)準(zhǔn)蛋白繪制遷移率與分子量的曲線。

1.2.3.3油棕仁貯藏蛋白的Native-PAGE分析[13]。Native-PAGE(非變性凝膠電泳)與SDS-PAGE的步驟基本相同，只是樣品緩沖液中不加SDS和β-巰基乙醇，電極緩沖液中也不加SDS。在Native-PAGE 中，蛋白質(zhì)按照自身的電荷數(shù)、分子大小和形狀進行分離。將提取的油棕仁貯藏蛋白標(biāo)定濃度后，按4∶1的比例與樣品緩沖液混合，搖勻，點樣，進行非變性聚丙稀酰胺凝膠電泳分析。

1.3分析軟件采用SYNGENE凝膠成像系統(tǒng)及分析軟件和DPS軟件，對試驗數(shù)據(jù)進行分析。

2結(jié)果與分析

2.1油棕仁貯藏蛋白的SDS-PAGE分析

注：分離膠濃度分別為16%(a)、14%(b)、12%(c) 和10%(d)。Note：The concentrations were 16% (a),14% (b),12% (c) and 10% (d),respectively.圖1　油棕仁貯藏蛋白的電泳圖譜Fig.1　 Electrophoretogram of oil palm kernel proteins at different separation concentrations

2.1.1最佳膠濃度的選擇。在SDS-PAGE電泳中，影響亞基分離的主要因素是分子量。要達到理想的分離效果，就需要選擇合適的凝膠孔徑。試驗濃縮膠濃度為7.5%，分離膠濃度則設(shè)置10%、12%、14%、16%共4個水平，研究油棕仁貯藏蛋白在不同的分離膠濃度條件下的分離效果，探討分離膠濃度對亞基分離效果的影響，尋找最合適的分離膠濃度，比較各分離膠濃度下的電泳圖譜，以圖譜清晰、差異帶明顯、條帶整體位置等為評判標(biāo)準(zhǔn)。從圖1可以看出，在分離膠濃度為16%和14%的凝膠系統(tǒng)中，油棕仁貯藏蛋白小分子量的亞基分得比較開，而大分子量亞基堆積在一起，且各亞基的位置偏上，整體分離效果較差。在分離膠濃度為10%的凝膠電泳系統(tǒng)中，各亞基整體位于分離膠的下部，大分子量亞基的分離效果較好，但小分子量亞基堆積在一起，分離效果較差。因此，分離膠濃度為10%的SDS-PAGE凝膠系統(tǒng)適合于油棕仁貯藏蛋白中較大分子量亞基的分離。

油棕仁貯藏蛋白亞基在分離膠濃度為12%凝膠電泳系統(tǒng)中得到很好的分離。在所得分離膠中，亞基條帶清晰，各個亞基間的距離適中，位于膠片上部的大分子量亞基和位于膠片下部的小分子量亞基都得到較好的分離，而且各亞基基本上位于膠片的中部，整體效果也好。因此，分離膠濃度為12%的SDS-PAGE凝膠系統(tǒng)適合于油棕仁貯藏蛋白的分離分析。

2.1.2油棕仁貯藏蛋白各亞基的分子量和含量。采用濃縮膠濃度為7.5%、分離膠濃度為12%的SDS-PAGE凝膠系統(tǒng)，對油棕仁貯藏蛋白進行分析，所得電泳圖譜見圖2。將電泳圖譜采用SYNGENE凝膠成像系統(tǒng)分析各亞基的光密度。在圖3中，每個光密度吸收峰都代表一個油棕仁貯藏蛋白亞基，峰的面積代表亞基的百分比含量，而每個吸收峰距離Y軸的距離為該亞基的遷移率。在SDS-PAGE凝膠電泳系統(tǒng)中，蛋白質(zhì)遷移速率與分子量呈對數(shù)型負相關(guān)，即蛋白質(zhì)的分子量越大，它的遷移率越小。

從表1可以看出，油棕仁貯藏蛋白質(zhì)中主要含有6條亞基，亞基的分子量范圍為18.8～51.5 kDa，其中分子量為51.5、30.2、22.1和18.8 kDa的亞基含量最高，約占總數(shù)的90%。不同品種油棕仁貯藏蛋白亞基的組成和含量間差異并不顯著。

2.1.3油棕仁貯藏蛋白的非變性SDS-PAGE分析。將2種油棕仁貯藏蛋白進行分變性SDS-PAGE凝膠電泳分析。在變性SDS-PAGE凝膠電泳中，β-巰基乙醇將蛋白質(zhì)分子中的二硫鍵打斷，使蛋白質(zhì)發(fā)生變性；而在非變性SDS-PAGE凝膠電泳中，由于不加β-巰基乙醇等強還原劑，蛋白質(zhì)中的二硫鍵不會被破壞，蛋白質(zhì)的變性幾率大大降低，蛋白質(zhì)分子呈現(xiàn)在自然狀態(tài)下的亞基組成。因此，比較同一種蛋白質(zhì)在變性SDS-PAGE和非變性SDS-PAGE凝膠電泳中的亞基組成，可以判斷該蛋白質(zhì)分子中是否含有二硫鍵。從圖4可以看出，油棕仁貯藏蛋白在非變性SDS-PAGE凝膠電泳下分離出5條分子量范圍為51.5～20.7 kDa的亞基，而在變性SDS-PAGE凝膠電泳下分離出6條主要亞基，分子量范圍為51.5～18.8 kDa。這表明在油棕仁貯藏蛋白質(zhì)分子中可能含有二硫鍵。 同時，所選2個品種的貯藏蛋白在非變性和變性SDS-PAGE中的亞基組成均無差異。

注：泳道1.低分子量標(biāo)準(zhǔn)蛋白；泳道2.丹娜拉型油棕仁貯藏蛋白；泳道3.杜拉型油棕仁貯藏蛋白。　Note：Lane 1.Low molecular weight standard protein; Lane 2.Oil palm kernel protein of E.guineensis.var.tenera;; Lane 3.Oil palm kernel protein of E.guineensis Jacq L.L.Dura.圖2　油棕仁貯藏蛋白各亞基的電泳圖譜Fig.2　Electrophoretogram of subunits in oil palm kernel proteins

注：a.丹娜拉型油棕仁貯藏蛋白;b.杜拉型油棕仁貯藏蛋白。　Note：a.Oil palm kernel protein of E.guineensis.var.tenera; b.Oil palm kernel protein of E.guineensis Jacq L.L.Dura.圖3　油棕仁貯藏蛋白的光密度分析Fig.3 Scanning profile of photodensitometry of oil palm kernel proteins

亞基Subunit非洲丹那拉變種油棕蛋白E.guineensis.var.tenera分子量olecularweight∥Da百分含量Percentagecontent∥%大葉厚殼型非洲油棕杜拉型E.guineensisJacqL.L.Dura.分子量Molecularweight∥Da百分含量Percentagecontent∥%151475.11±1.2020.64±3.2351490.79±1.7219.33±0.36237262.18±2.722.33±0.2237363.88±2.792.02±0.57330185.31±1.2818.58±3.7030662.71±1.8317.19±1.10428999.86±1.0210.49±1.8129021.48±2.439.56±0.46522032.79±1.2714.81±3.0422091.54±2.0315.24±0.21618838.41±1.299.31±0.7518824.15±2.7011.72±0.47

注：Mw.低分子量蛋白;1.丹娜拉型油棕仁貯藏蛋白;2.杜拉型油棕仁貯藏蛋白。Note：Mw-Low molecular weight protein; 1. Oil palm kernel protein of E.guineensis.var.tenera; 2.Oil palm kernel protein of E.guineensis Jacq L.L.Dura.圖4　油棕仁貯藏蛋白的變性SDS-PAGE(a)和非變性SDS-PAGE(b)凝膠電泳圖Fig.4　 SDS-PAGE gel electrophoresis of oil palm kernel storage proteins with β-mercaptoethanol (a) and without β-mercaptoethanol (b)

2.2油棕蛋白的Native-PAGE分析在Native-PAGE凝膠電泳中，由于沒有SDS和β-巰基乙醇的加入，蛋白質(zhì)變性的幾率更小。影響蛋白質(zhì)遷移率的主要因素除了蛋白質(zhì)的分子量外，還有蛋白質(zhì)的形狀和所帶的電荷數(shù)。利用非變性電泳，分析蛋白質(zhì)的天然組分。該試驗對油棕仁貯藏蛋白進行了非變性聚丙稀酰胺(Native-PAGE)分析，首先篩選出最佳的分離膠濃度。從圖5可以看出，油棕仁貯藏蛋白在濃縮膠濃度為3%、分離膠濃度為5%的Native-PAGE凝膠電泳系統(tǒng)中可以得到較好的分離。在非變性凝膠電泳中，油棕仁貯藏蛋白分離為4個組分。這表明在自然狀態(tài)下的油棕仁貯藏蛋白是由6個亞基通過二硫鍵鏈接成4個組分。這可能是油棕仁蛋白質(zhì)的四級結(jié)構(gòu)。

注：L1.丹娜拉型油棕仁貯藏蛋白；L2.杜拉型油棕仁貯藏蛋白Note: L1- Oil palm kernel protein of E.guineensis.var.tenera; L2- Oil palm kernel protein of E.guineensis Jacq L.L.Dura.圖5　油棕仁貯藏蛋白的非變性電泳圖譜Fig.5　Native-PAGE profiles of oil palm kernel storage protein

3結(jié)論與討論

在油棕仁貯藏蛋白的SDS-PAGE分析中，分離膠濃度對椰子蛋白亞基的分離效果有顯著影響。研究表明，要想得到最佳的蛋白SDS-PAGE凝膠電泳分離效果，濃縮膠濃度為7.5%、分離膠濃度為12%是最理想的選擇。在該試驗條件下油棕仁貯藏蛋白分離為6條條帶清晰的亞基，分子量范圍為18.8～51.5 kDa，所選的兩個品種間無顯著差異。Morcillo等[14]曾對油棕胚中蛋白質(zhì)進行分析，發(fā)現(xiàn)油棕蛋白中主要含中小分子量亞基。這與該研究結(jié)果相一致。比較油棕仁貯藏蛋白的非變性SDS-PAGE和變性SDS-PAGE，發(fā)現(xiàn)油棕仁貯藏蛋白的多肽鏈間含有一定量的二硫鍵。

綜合分析油棕貯藏蛋白質(zhì)的SDS-PAGE和Native-PAGE，可以推測在自然條件下油棕仁貯藏蛋白質(zhì)所含的6條主要亞基通過二硫鍵等非共價鍵鏈接成4個分子大小不一、帶有不同電荷的組分。這4個組分再構(gòu)成油棕仁貯藏蛋白質(zhì)分子。然而，目前對各亞基之間的連接方式未弄清楚，而對亞基的含量與油棕仁貯藏蛋白營養(yǎng)價值、功能特性和活性之間的關(guān)系仍需要進一步開展研究。

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摘要[目的]為油棕仁中蛋白質(zhì)的進一步研究與開發(fā)利用提供指導(dǎo)。[方法] 采用非變性聚丙稀酰胺凝膠電泳(Native-PAGE)和十二烷基硫酸鈉-聚丙稀酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)對油棕仁中貯藏蛋白質(zhì)亞基進行研究，分析油棕仁蛋白主要亞基的組成、分子量、含量、二硫鍵的位置及種間差異。[結(jié)果] 油棕仁中貯藏蛋白質(zhì)在濃縮膠濃度為7.5%、分離膠濃度為12%的SDS-PAGE凝膠系統(tǒng)中可以得到很好的分離。在油棕仁貯藏蛋白中含有6條主要亞基，分子量范圍為18.8 ～51.5 kDa，主要是中、小分子量亞基；各亞基之間含一定量的二硫鍵。非變性凝膠電泳分析表明，油棕仁貯藏蛋白中含有4個不同分子量、不同電荷的組分。[結(jié)論] 該研究所選的不同油棕品種之間亞基的組成和含量沒有顯著性差異。

關(guān)鍵詞油棕仁; 貯藏蛋白; 亞基; SDS-PAGE

Study on Subunits of Oil Palm Kernel Storage Proteins

ZHANG Lu1,2, ZHENG Ya-jun1, 3, LI Yan1, ZHANG You-lin1*et al (1. College of Food Engineering and Nutritional Science, Shaanxi Normal University, Xi’an, Shaanxi 710119; 2.College of Horticulture and Landscape Architecture, Hainan University, Haikou, Hainan 570228; 3.Coconut Research Institute, Chinese Academy of Tropic Agriculture Science, Wenchang, Hainan 571339)

Abstract[Objective] The research aimed to provide the guidance for the further study and the development and utilization of protein in oil palm kernel. [Method] The subunits of storage proteins in oil palm kernel were studied by SDS-PAGE and Native-PAGE, including their content, molecular weight, content of disulfide bonds and variance difference. [Result] Storage proteins in oil palm kernel were well separated by SDS-PAGE with 12% separation gel and 7.5 % pile gel. Under this condition, the storage proteins in oil palm kernel were separated into 6 main subunits, with a molecular weight range of 18.8～51.5 kDa. This meant that the main subunits were lower molecular weight in oil palm kernel storage proteins. Compared with the result of SDS-PAGE with Native-PAGE, there were some disulfide bonds among the subunits of oil palm kernel storage proteins. There were four peptides with different molecular and different electric charge separated by Native-PAGE. [Conclusion] There was no significant difference between the two kinds of oil palm.

Key wordsOil palm kernel; Storage protein; Subunits; SDS-PAGE

收稿日期2015-11-30

作者簡介張璐(1993- )，男，四川成都人，本科生，專業(yè)：園藝學(xué)。*通訊作者，教授，博士生導(dǎo)師，從事農(nóng)產(chǎn)品加工及貯藏方面的研究。

基金項目國家科技支撐項目(2012BAD31B03)；海南省重大科技項目 (ZDZX2013011)。

中圖分類號S 789.5;TS 201

文獻標(biāo)識碼A

文章編號0517-6611(2016)01-008-04