?

·基礎(chǔ)研究論著·

作者單位：272092 濟(jì)寧，濟(jì)寧醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院

黃芪甲苷抑制慢性心力衰竭大鼠心肌纖維化和轉(zhuǎn)化生長因子β1的表達(dá)

Myocardial fibrosis

慢性心力衰竭(CHF)是各種器質(zhì)性心臟疾患的終末階段，5年存活率和惡性腫瘤類似[1]。在中國34～74歲年齡段的人群，就有超過400萬的心力衰竭患者，年病死率高達(dá)40%[2]。心肌纖維化是CHF的重要特征之一，而轉(zhuǎn)化生長因子β1(TGFβ1)是最近幾年發(fā)現(xiàn)的與心肌纖維化、CHF密切相關(guān)的細(xì)胞因子[3]。黃芪甲苷是中藥黃芪制劑中的主要活性成分，同時(shí)黃芪甲苷的含量作為黃芪制劑的質(zhì)量控制標(biāo)準(zhǔn)。黃芪甲苷具有免疫調(diào)節(jié)、抗炎、抗氧化、保護(hù)血管內(nèi)皮等多效性的作用，本研究采用黃芪甲苷干預(yù)CHF大鼠模型，觀察其對心肌纖維化、心功能指標(biāo)等影響，進(jìn)一步探討黃芪甲苷的CHF保護(hù)作用是否與抑制TGFβ1的表達(dá)有關(guān)。

材料與方法

一、 材料及動(dòng)物模型建立

SD雄性大鼠110只(山東魯抗醫(yī)藥股份有限公司提供，生產(chǎn)許可證號(hào)：scxk魯20130001)，體質(zhì)量280～300 g。按照參考文獻(xiàn)[4]制作大鼠模型，術(shù)后連續(xù)3 d給予腹腔注射青霉素(20萬U/只)，常規(guī)喂養(yǎng)。假手術(shù)組(10只)穿線而不結(jié)扎腹主動(dòng)脈，其余操作參照模型，術(shù)后8周100只結(jié)扎大鼠存活65只，存活率65%，隨機(jī)抽取5只大鼠行血流動(dòng)力學(xué)監(jiān)測，左心室舒張未壓(LVEDP)均大于15 mm Hg(1 mm Hg=0.133 kPa),提示心力衰竭模型成功建立，剩余60只大鼠平均分為空白組、黃芪甲苷(低、中、高)劑量組(20、40、60 mg/kg)、纈沙坦組，每組12只，黃芪甲苷組以及纈沙坦組術(shù)后通過灌胃給予相應(yīng)劑量藥物，連續(xù)4周，空白組以及假手術(shù)組(全部存活)給予相應(yīng)劑量的生理鹽水。

二、 儀　器

電子天平(0～1 000 g)；10%水合氯醛；青霉素(80萬U/支，山東魯抗醫(yī)藥提供)。BL-420生物機(jī)能實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)(成都泰盟科技有限公司),全能型ChemiDocMP成像分析系統(tǒng)。黃芪甲苷(純度>98%，南京青澤醫(yī)藥科技開發(fā)有限公司),纈沙坦膠囊(80 mg/粒，北京諾華公司)，兔抗鼠多克隆抗體TGFβ1、甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GAPDH, USA, Proteintech)，Masson染色、RT-PCR、SP試劑盒(武漢博士德公司)。

三、 心臟血流動(dòng)力學(xué)指標(biāo)檢測

末次給藥之后，大鼠腹腔注射10%水合氯醛(3 ml/kg)進(jìn)行麻醉，測量大鼠體質(zhì)量,然后在頸部右側(cè)開約為2 cm的縱向切口，分離皮下組織找到頸總動(dòng)脈，用組織剪在頸總動(dòng)脈做一斜行切口，將充滿肝素生理鹽水的PE-50聚乙烯導(dǎo)管插入，緩慢旋轉(zhuǎn)進(jìn)管，最終進(jìn)入左心室腔，另一端接在連有BL-420生物機(jī)能實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)的壓力換能器上，記錄并分析LVEDP、左心室內(nèi)壓最大上升速率/左心室內(nèi)壓最大下降速率(±dp/dtmax)、左心室收縮壓(LVSP)、LVMI等指標(biāo)。

四、 心臟組織采集

待血流動(dòng)力學(xué)指標(biāo)測量完成后，稱量體質(zhì)量后立即取出心臟，用冰生理鹽水洗凈血液，濾紙吸干水跡等，稱量心臟質(zhì)量并記錄，然后剪取左心室(保留室間隔)，稱量左心室質(zhì)量，計(jì)算左室重量/體質(zhì)量比(LVW/BW，即LVMI)、心臟重量/體質(zhì)量比(HW/BW)，同時(shí)取大約0.5 cm厚的左心室組織置于4%多聚甲醛中用來包埋、切片(5 μm)，以備蘇木素-伊紅染色、Masson以及免疫組織化學(xué)染色，剩余組織放于-80℃中冷藏，用于蛋白免疫印跡法實(shí)驗(yàn)。

五、 心肌膠原容積分?jǐn)?shù)(CVF)的測定

按照Masson染色試劑盒的說明進(jìn)行操作，在光學(xué)顯微鏡下進(jìn)行觀察，每只大鼠取4個(gè)不含血管的視野進(jìn)行IPP 6.0圖像分析系統(tǒng)處理，計(jì)算膠原組織所占面積的百分比，取平均值作為每只大鼠的CVF。

六、 RT-PCR檢測心肌組織中TGFβ1 mRNA的表達(dá)

取上述新鮮組織，用生理鹽水灌洗后，按Trizol試劑盒提示方法提取總RNA，按照RT-PCR試劑盒說明進(jìn)行操作，檢查其濃度和純度后，在PCR 熱循環(huán)儀中逆轉(zhuǎn)錄為cDNA(TGFβ1引物上游5’-CCGCAACAACGCAATCTATG-3 下游5’-GCCCTGTATTCCGTCTCCTT-3’)。PCR 反應(yīng)程序?yàn)? 94 ℃預(yù)變性25 s，GAPDH 52 ℃退火30 s，共30個(gè)循環(huán)，72 ℃延伸30 s，TGFβ1 56℃退火38 s，共35個(gè)循環(huán)，72 ℃延伸35 s，PCR 產(chǎn)物經(jīng)2%瓊脂糖凝膠電泳，紫外燈下觀察結(jié)果。凝膠掃描分析儀計(jì)算目的帶吸光度值，TGFβ1 mRNA 表達(dá)的相對強(qiáng)度= TGFβ1條帶灰度值/GAPDH條帶灰度值。

七、 心肌組織TGFβ1的表達(dá)

參照SP試劑盒說明書進(jìn)行免疫組織化學(xué)染色，TGFβ1(體積稀釋度1∶300)，磷酸鹽緩沖液作為陰性對照。陽性表達(dá)為棕黃色顆粒。采用圖像分析系統(tǒng)進(jìn)行處理，經(jīng)過標(biāo)準(zhǔn)灰度值校正，然后隨機(jī)取每張圖片中的5個(gè)視野進(jìn)行積分光密度值的測定，取其平均值作為標(biāo)本值。在進(jìn)行蛋白免疫印跡之前，首先提取心肌組織蛋白，并進(jìn)行蛋白濃度的監(jiān)測，然后取50 μg蛋白進(jìn)行SDS-PAGE凝膠電泳，并轉(zhuǎn)膜至PVDF膜上，進(jìn)行脫脂奶粉的封閉處理，TBST洗膜，加入一抗(TGFβ1體積稀釋度1∶2 000)；GAPDH(體積稀釋度1∶2 000)，4℃孵育過夜，再次TBST洗膜后加入二抗室溫孵育2 h，ECL顯色，于全能型ChemiDocMP成像分析系統(tǒng)采集圖像，用積分吸光度比值(TGFβ1/GAPDH)作為其相對表達(dá)量。

八、 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

結(jié)果

一、 各組大鼠一般情況

假手術(shù)組大鼠表現(xiàn)正常，空白組大鼠皮毛不整，活動(dòng)后出現(xiàn)憋喘，雙下肢出現(xiàn)水腫；各用藥物組癥狀較空白組大鼠輕微，灌胃給藥結(jié)束后空白組大鼠死亡1只，考慮為慢性心力衰竭急性發(fā)作。其余組未見死亡。

二、 各組大鼠血流動(dòng)力學(xué)指標(biāo)監(jiān)測

與假手術(shù)組相比，空白組大鼠中±dp/dtmax顯著下降,LVEDP、LVSP明顯上升；與空白組相比，黃芪甲苷高、中劑量組LVEDP、LVSP明顯下降，+dp/dtmax、-dp/dtmax顯著上升，見表1。

表1±s)

注：與假手術(shù)組相比，aP<0.01；與空白組相比，bP<0.01，cP<0.05

三、 各組大鼠HW/BW、LVW/BW比值比較

與假手術(shù)組相比，空白組大鼠HW/BW、LVW/BW的比值明顯升高，黃芪甲苷組相應(yīng)比值較空白組有所下降，隨著的黃芪甲苷劑量的升高，下降的幅度越大，具有明顯的劑量依賴性，見圖1。

圖1　大鼠HW/BW、LVW/BW比值

四、 各組大鼠心肌組織切片蘇木素-伊紅染色結(jié)果比較

光鏡下觀察，假手術(shù)組中心肌細(xì)胞排列整齊、大小勻稱、細(xì)胞清晰可見。空白組大鼠心肌細(xì)胞形態(tài)不規(guī)則、細(xì)胞肥大，胞間存在大量的纖維組織，同時(shí)有大量炎性細(xì)胞的浸潤。黃芪甲苷低、中、高劑量組心肌細(xì)胞輕度肥大，細(xì)胞排列尚整齊，伴有不同程度的纖維組織的增生，較空白組明顯減輕，隨著黃芪甲苷的劑量的增加，改善程度增強(qiáng)，見圖2。

圖2　大鼠心肌組織切片(蘇木素-伊紅染色，×400)

五、 各組大鼠心肌組織切片Masson染色結(jié)果以及CVF比較

在Masson染色中，膠原蛋白被染色為藍(lán)色，心肌細(xì)胞染色為暗紅色，同假手術(shù)組比，空白組CVF的比值明顯升高，與空白組相比，黃芪甲苷低、中、高劑量組CVF比值明顯的下降，見圖3、表2。

圖3　大鼠心肌組織切片(Masson染色,×400)

六、 各組大鼠心肌組織免疫組織化學(xué)結(jié)果比較

TGFβ1主要表達(dá)于心肌胞質(zhì)中，為棕黃色的顆粒，同假手術(shù)組相比，空白組中TGFβ1平均積分吸光度值明顯增大；同空白組相比，黃芪甲苷低、中、高劑量組中TGFβ1的平均吸光度值顯著下降(呈現(xiàn)劑量依賴性)，見圖4、表2。

圖4　大鼠心肌組織切片免疫組化TGFβ1表達(dá)圖(×400)

表2±s)

注：與假手術(shù)組比較，aP<0.01；與空白組比較，bP<0.01，cP<0.05

七、 各組大鼠心肌組織蛋白免疫印跡法結(jié)果

同假手術(shù)組相比，空白組中心肌組織TGFβ1因子表達(dá)水平明顯增強(qiáng)；同空白組相比較，黃芪甲苷低、中、高劑量組心肌組織TGFβ1因子表達(dá)水平明顯減弱，見圖5、表2。

圖5　各組心肌組織TGFβ1因子的表達(dá)

討論

在CHF的發(fā)生發(fā)展的過程中，心室重構(gòu)、細(xì)胞肥大、心肌纖維化等機(jī)制發(fā)揮著巨大的作用，其中以心肌纖維化的作用更為突出，心力衰竭已經(jīng)成為21世紀(jì)嚴(yán)重威脅老年人生命的心臟疾病之一[5]。TGFβ1是一種由2條多肽鏈組成的二聚體(25kd)，正常情況下以非活性形式存在于細(xì)胞表面以及胞質(zhì)中，經(jīng)過纖維蛋白溶解酶溶解，成為活性型TGFβ1，在細(xì)胞的生長、分化、免疫調(diào)節(jié)、細(xì)胞外基質(zhì)合成及損傷后的修復(fù)方面發(fā)揮著重要作用[6]。TGFβ1 是屬于一組調(diào)節(jié)細(xì)胞生長和分化的細(xì)胞因子，其能夠促成纖維分裂和膠原沉積，與多種器官的纖維化密切相關(guān)[7]。既往實(shí)驗(yàn)證實(shí)TGFβ1不僅能夠誘導(dǎo)成纖維細(xì)胞增生并向肌成纖維細(xì)胞轉(zhuǎn)化，而且促進(jìn)Ⅰ、Ⅲ型膠原的高表達(dá)[8]。同時(shí)TGFβ1能夠促進(jìn)細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)的形成，并且能夠抑制細(xì)胞外基質(zhì)降解酶的活性，從而達(dá)到減少ECM降解的目的[9]。TGFβ1是一種促進(jìn)心肌纖維化的重要生長因子，在各種原因引起的慢性心力衰竭中均有較高的表達(dá)，大量研究發(fā)現(xiàn)，在心肌纖維化時(shí)，TGFβ1表達(dá)增高與Ang Ⅱ的作用密切相關(guān)，AngⅡ可通過刺激TGFβ1及其Smads 信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，進(jìn)而增加Ⅰ、Ⅲ型膠原和纖連蛋白的合成，并促進(jìn)心肌纖維化的發(fā)生[10]。既往研究已經(jīng)證實(shí)，CHF大鼠模型心肌組織中的TGFβ1表達(dá)明顯增強(qiáng)。

黃芪甲苷作為傳統(tǒng)的中藥黃芪的提取制劑，在治療心血管疾病方面藥理作用廣泛，主要表現(xiàn)在抑制心室重構(gòu)、抑制心肌纖維化、改善心功能、改善能量代謝等方面[11-12]。本研究觀察黃芪甲苷不同劑量組與空白組進(jìn)行比較發(fā)現(xiàn)，大鼠心肌組織中TGFβ1 mRNA、TGFβ1的表達(dá)都是明顯減弱的(P<0.01或P<0.05)，并呈現(xiàn)出黃芪甲苷的劑量依賴性。在心肌組織切片中，黃芪甲苷不同劑量組中的纖維化以及CVF表達(dá)為不同程度的下降，也呈現(xiàn)出劑量依賴性，與TGFβ1、TGFβ1 mRNA的表達(dá)水平相吻合。血流動(dòng)力學(xué)的監(jiān)測結(jié)果、心肌病理切片、CVF監(jiān)測等共同支持黃芪甲苷具有保護(hù)心功能、抑制心肌纖維化的作用。綜上所述，該研究推測黃芪甲苷能夠改善CHF大鼠心臟功能，減輕心臟的纖維化程度，可能是與其抑制心肌組織TGFβ1的過度表達(dá)有關(guān)，并呈現(xiàn)劑量的依賴性，具體機(jī)制可能是減少ECM的合成、促進(jìn)ECM的降解，從而達(dá)到抑制心肌纖維化的作用。因此，該實(shí)驗(yàn)為黃芪甲苷抑制心肌纖維化、治療CHF提供新的理論依據(jù)，為臨床治療慢性心力衰竭提供一種新的理想藥物。由于本研究納入的樣本量相對較少，此結(jié)論有待多中心、大樣本研究進(jìn)一步的證實(shí)。同時(shí)考慮 CHF的發(fā)生發(fā)展機(jī)制錯(cuò)綜復(fù)雜，CHF與其他多個(gè)因子關(guān)系密切[12](例如結(jié)締組織生長因子、IL-1、IL-6等)，黃芪甲苷是否通過其他相關(guān)因子抑制CHF的進(jìn)展尚需進(jìn)一步的研究。

參考文獻(xiàn)

[1]Ramani GV, Uber PA, Mehra MR. Chronic heart failure: contemporary diagnosis and management. Mayo Clin Proc，2010，85(2): 180-195.

[2]邢作英,王永霞,朱明軍.慢性心力衰竭流行病學(xué)研究現(xiàn)狀及其病因.中華實(shí)用診斷與治療雜志，2012，26(10):937-938.

[3]Song WH， Wang XM. The role of TGFβ1 and LRG1 in cardiac remodelling and heart failure. Biophys Rev，2015，7(1): 91-104.

[4]Corno AF, Cai X, Jones CB, Mondani G, Boyett MR, Jarvis JC, Hart G. Congestive Heart Failure: Experimental Model.Front Pediatr，2013，1: 33.

[5]Kong P, Christia P, Frangogiannis NG. The Pathogenesis of Cardiac Fibrosis. Cell Mol Life Sci，2014，71(4): 549-574.

[6]López-Díaz FJ, Gascard P, Balakrishnan SK, Zhao JX, del RinconSV, Spruck C, Tlsty TD, Emerson1 BM.Coordinate Transcriptional and Translational Repression of p53 by TGFβ1 Impairs the Stress Response. Mol Cell，2013，50(4): 552-564.

[7]Ieronimakis N,Hays AL, Janebodin K, Mahoney Jr WM, Duffield JS, Majesky MW, Reyes M. Coronary adventitial cells are linked to perivascular cardiac fibrosis via TGFβ1 signaling in the mdx mouse model of Duchenne Muscular Dystrophy.J Mol Cell Cardiol，2013，63:122-134.

[8]Sueblinvong V, Tseng V, Smith T, Saghafi R, Mills ST, Neujahr DC, Guidot DM.TGFβ1 Mediates Alcohol-Induced Nrf2 Suppression in Lung Fibroblasts. Alcohol Clin Exp Res，2014，38(11): 2731-2742.

[9]Klingberg F, Chow ML, Koehler A, Boo S, Buscemi L, Quinn TM, Costell M, Alman BA, Genot E, Hinz B.Prestress in the extracellular matrix sensitizes latent TGF-β1 for activation. J Cell Biol，2014，207(2): 283-297.

[10]Zhan CY, Tang JH, Zhou DX, Li ZH.Effects of tanshinone IIA on the transforming growth factor β1/Smad signaling pathway in rat cardiac fibroblasts. Indian J Pharmacol，2014，46(6): 633-638.

[11]Tu L,Pan CS,Wei XH, Yan L, Liu YY, Fan JY, Mu HN, Li Q, Li L, Zhang Y, He K, Mao XW, Sun K, Wang CS, Yin CC, Han JY. Astragaloside IV protects heart from ischemia and reperfusion injury via energy regulation mechanisms. Microcirculation，2013，20(8):736-747.

[12]汪明燈，高修仁.炎性細(xì)胞因子與慢性心力衰竭.新醫(yī)學(xué)，2006，37(3):200-202.

(本文編輯：楊江瑜)

蔣洪強(qiáng)張金國

【摘要】目的研究黃芪甲苷對慢性心力衰竭(CHF)大鼠心肌纖維化和轉(zhuǎn)化生長因子β1(TGFβ1)表達(dá)的影響。方法采用腹主動(dòng)脈縮窄法制作CHF模型，并分為空白組、黃芪甲苷低、中、高劑量(20、40、60 mg/kg)組、纈沙坦(10 mg/kg)組，同時(shí)設(shè)立假手術(shù)組做對照，每日給藥(灌胃)1次，持續(xù)4周。4周后行血流動(dòng)力學(xué)指標(biāo)的檢測，處死大鼠后計(jì)算心臟重量/體質(zhì)量比(HW/BW)、左心室重量/體質(zhì)量比(LVW/BW)，常規(guī)行蘇木素-伊紅染色觀察心肌組織形態(tài)學(xué)變化，Masson染色觀察心肌纖維化，測量膠原容積分?jǐn)?shù)(CVF)，RT-PCR、免疫組織化學(xué)和蛋白免疫印跡法檢測TGFβ1 mRNA以及TGFβ1分子表達(dá)水平。結(jié)果同空白組相比，黃芪甲苷低、中、高劑量組HW/BW、LVW/BW、CVF、TGFβ1 mRNA、TGFβ1等表達(dá)明顯減弱(P<0.05)，黃芪甲苷中、高劑量組左心室舒張末壓、左心室收縮壓顯著下降，±dp/dtmax顯著上升(P<0.05)，細(xì)胞形態(tài)明顯改善。結(jié)論黃芪甲苷能夠抑制CHF大鼠的心肌纖維化，具體作用機(jī)制可能是通過抑制心肌組織中TGFβ1的過度表達(dá)來實(shí)現(xiàn)的。

【關(guān)鍵詞】黃芪甲苷；慢性心衰；轉(zhuǎn)化生長因子β1；心肌纖維化

Inhibition of astragaloside IV on myocardial fibrosis and expression of myocardial transforming growth factor β1 in rats with chronic heart failureJiangHongqiang,ZhangJinguo.AffiliatedHospitalofJiningMedicalUniversity,Jining272092,China

Correspondingauthor,ZhangJinguo,E-mail:cck112000@aliyun.com

【Abstract】ObjectiveTo observe the effects of astragaloside IV on myocardial fibrosis and expression of myocardial transforming growth factor (TGFβ1) in rats with chronic heart failure(CHF). MethodsThe rat model of CHF was induced by abdominal aorta constriction. Experiments were carried out in the following groups: sham operation group, blank group, astragaloside IV low, medium and high dose group (20, 40, 60 mg/kg), valsartan group (10 mg/kg). The rats in those groups were daily administrated with corresponding drugs for 4 weeks, and then hemodynamic indexes were monitored. After the rats were executed, HW/BW and LVW/BW were measured. Further, conventional HE staining was performed to observe the morphologic changes of myocardial tissue; Masson staining was used to observe myocardial fibrosis and measure collagen volume fraction; and RT-PCR, immunohistochemistry and Western-blotting were used to monitor the expression level of TGFβ1 mRNA and TGFβ1. ResultsCompared with the blank group, HW/BW,LVW/BW,collagen volume fraction(CVF) and the expression level of TGFβ1 mRNA and TGFβ1 were obviously reduced in astragaloside IV low, medium and high dose group (P<0.05), and in astragaloside IV medium and high dose group left ventricular end-diastolic pressure and left ventricular systolic pressure were dramatically reduced with dramatically increased ±dp/dtmax (P<0.05) and obviously improved cytology morphology. ConclusionsAstragaloside IV can inhibit myocardial fibrosis in rats with CHF through a possible mechanism involving the inhibition of myocardial TGFβ1 expression by astragaloside IV.

【Key words】Astragaloside IV; Chronic heart failure;Transforming growth factor β1;

收稿日期：(2015-08-06)

通訊作者，張金國，E-mail:cck112000@aliyun.com

基金項(xiàng)目：山東省中醫(yī)藥科學(xué)技術(shù)研究項(xiàng)目(2013-235)；山東省高校優(yōu)秀科研創(chuàng)新團(tuán)隊(duì)計(jì)劃資助

DOI:10.3969/j.issn.0253-9802.2016.01.006