王月茹 謝 偉

(1 陜西國(guó)際商貿(mào)學(xué)院，咸陽(yáng)，712046； 2 陜西步長(zhǎng)制藥有限公司，咸陽(yáng)，71200)

中藥研究

HPLC法測(cè)定藥用菊花中10個(gè)主要化學(xué)成分的含量

王月茹1謝 偉2

(1 陜西國(guó)際商貿(mào)學(xué)院，咸陽(yáng)，712046； 2 陜西步長(zhǎng)制藥有限公司，咸陽(yáng)，71200)

目的：建立HPLC法測(cè)定菊花藥材中10個(gè)主要化學(xué)成分的含量，包括5個(gè)咖啡?？鼘幩犷惓煞趾?個(gè)黃酮類成分。方法：采用DiamonsilTM C18(4.6 mm×250 mm，5 μm)色譜柱，流動(dòng)相為乙腈-0.05%甲酸，流速1.0 mL/min，檢測(cè)波長(zhǎng)335 nm，柱溫40 ℃。結(jié)果：10個(gè)化合物在一定范圍內(nèi)與峰面積呈良好的線性關(guān)系，r值均大于0.999 5；平均加樣回收率(n=6)范圍為95.6%～100.3%，RSD為0.66%～1.95%。結(jié)論：本文所建立含量測(cè)定方法可作為中藥菊花的質(zhì)量控制的有效方法，為明確不同品種菊花的基原關(guān)系和品種鑒定研究提供了數(shù)據(jù)基礎(chǔ)。

菊花藥材；黃酮；咖啡?？鼘幩?；高效液相色譜法;含量測(cè)定

藥用菊花是菊科菊屬植物菊(ChrysanthemummorifoliumRamat.)的干燥頭狀花序。具有散風(fēng)清熱，平肝明目等功效，用于治療風(fēng)熱感冒、頭痛眩暈、目赤腫痛、眼目昏花[1]。菊花在中國(guó)已有2000多年的栽培歷史，我國(guó)主要產(chǎn)于浙江、安徽、河南、河北、江蘇、湖北等省。在長(zhǎng)期的栽培過(guò)程中，不同產(chǎn)地根據(jù)其當(dāng)?shù)氐牡乩須夂蛱攸c(diǎn)采取了不同加工方式，這就形成了道地藥材菊花的不同類型。其中，中國(guó)藥典收載的藥用菊花品種有“亳菊”“滁菊”“貢菊”“杭菊”[1]，然而，目前我國(guó)各大藥材市場(chǎng)上的藥用菊花還包括“懷菊”“祁菊”“濟(jì)菊”和“川菊”四個(gè)品種，這些共同構(gòu)成了我國(guó)藥用菊花的八大主流品種。經(jīng)查閱文獻(xiàn)和古代醫(yī)藥書籍發(fā)現(xiàn)，這8種菊花的藥用已有悠久的歷史淵源，并形成了各具特色的藥材[2-7]。

黃酮類成分普遍存在于菊屬植物中，主要包括黃酮及其苷、黃酮醇及其苷、二氫黃酮及其苷，咖啡酰奎寧酸類化合物(Caffeoylquinic Acids)是藥用菊花中的另一類主要成分[8-17]，這兩類類成分具有多種生理活性，是藥用菊花中的主要有效成分。中國(guó)藥典只收錄了亳菊、滁菊、貢菊和杭菊四個(gè)品種，祁菊、黃菊、濟(jì)菊、懷菊因具有悠久的藥用歷史和良好的藥效也為人們沿用至今，因此有必要對(duì)藥材市場(chǎng)上常見的菊花品種進(jìn)行全面評(píng)價(jià)和鑒別，文獻(xiàn)記載區(qū)分和鑒別菊花品種方法多從形態(tài)學(xué)的角度或顯微鑒定的角度，尚未有文獻(xiàn)記載以化學(xué)分類學(xué)的方法對(duì)菊花不同品種加以區(qū)分，本研究采用HPLC-DAD法建立了菊花藥材中5個(gè)咖啡?？鼘幩犷惓煞趾?個(gè)黃酮類成分類成分的含量測(cè)定方法。通過(guò)對(duì)菊花多成分含量測(cè)定的方法研究，以期達(dá)到鑒別菊花品種和評(píng)價(jià)藥材質(zhì)量的目的。結(jié)果表明該方法簡(jiǎn)便、快速、準(zhǔn)確，為建立菊花質(zhì)量評(píng)價(jià)方法提供科學(xué)依據(jù)。

1 儀器與試藥

1.1 儀器 島津LC-20ADXR液相色譜系統(tǒng)：LC-20ADXR高壓泵，SPD-20AV紫外檢測(cè)器，SPD-M20A光電二極管陣列檢測(cè)器，CTO-20AC柱溫箱，CBM-20A系統(tǒng)控制器，SIL-20AC自動(dòng)進(jìn)樣器，DGU-20A5自動(dòng)脫氣機(jī)，LC solution工作站。

1.2 試藥 色譜級(jí)甲醇、乙腈購(gòu)自天津賽孚世紀(jì)科技發(fā)展有限公司；分析純無(wú)水乙醇、正丁醇、甲醇購(gòu)自北京化工廠；甲酸購(gòu)自國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司)；水為超純水；色譜柱為DiamonsilTM C18柱(4.6 mm×250 mm，5 μm)；10個(gè)對(duì)照品：5-咖啡酰奎寧酸、4-咖啡?？鼘幩帷?,5-二咖啡?？鼘幩?、3,5-二咖啡?？鼘幩?、4,5-二咖啡?？鼘幩?、木犀草素、木犀草苷、香葉木素、金合歡素、蒙花苷購(gòu)自中國(guó)生物制品檢驗(yàn)所，結(jié)構(gòu)見圖1。

圖1 10個(gè)化合物的化學(xué)結(jié)構(gòu)

1.3 分析樣品 17批菊花藥材購(gòu)自各地藥材市場(chǎng)的9個(gè)品種，經(jīng)鑒定為菊科植物菊(ChrysanthemummorifoliumRamat.)和野菊(ChrysanthemumindicumL.)的干燥花序。

2 試驗(yàn)方法

2.1 對(duì)照品溶液 分別精密稱取10個(gè)對(duì)照品適量，用甲醇溶解制得5-咖啡?？鼘幩帷?-咖啡?？鼘幩?、1,5-二咖啡酰奎寧酸、3,5-二咖啡?？鼘幩?、4,5-二咖啡酰奎寧酸、木犀草素、木犀草苷、香葉木素、金合歡素、蒙花苷對(duì)照品溶液。

2.2 供試品溶液 取上述17份藥材粉末(過(guò)40目篩)1.0 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入甲醇50 mL，密塞，稱定重量，超聲處理(功率250 W，頻率40 kHz)30 min，放冷后稱定重量，用甲醇補(bǔ)足減失的重量。濾過(guò)，經(jīng)0.22 μm濾膜濾過(guò)，即得。

2.3 色譜條件與系統(tǒng)適用性試驗(yàn) 色譜柱為DiamonsilTM C18柱(4.6 mm×250 mm，5 μm)。流動(dòng)相為A(水，0.05% 甲酸)和 B(乙腈，0.05% 甲酸)，梯度洗脫條件如下：0→15 min，88% A→80% A；15→55 min，80% A→79% A；55→60 min，79% A→75% A；60→80 min，75% A→66% A；80→100 min，66% A→60% A；100→110 min，60% A→40% A；110→120 min，40% A→0% A。流速1.0 mL/min，進(jìn)樣量為10 μL，柱溫為40 ℃，檢測(cè)波長(zhǎng)為335 nm。在此色譜條件下，藥材中待測(cè)化合物的分離度良好，理論塔板數(shù)大于10 000，峰形尖銳，基線平穩(wěn)，適合進(jìn)行樣品含量測(cè)定。菊花藥材的色譜圖如圖2。

圖2 菊花藥材的HPLC圖

注：1：5-咖啡?？鼘幩?5-CQA)；2：4-咖啡酰奎寧酸(4-CQA)；3：木犀草苷(luteolin-7-O-glucoside)；4：1,5-二咖啡?？鼘幩?1,5-DCQA)；5：3,5-二咖啡?？鼘幩?3,5-DCQA)；6：4,5-二咖啡?？鼘幩?4,5-DCQA)；7：蒙花苷(linarin);8：木犀草素(luteolin)；9：香葉木素(diosmetin);10：金合歡素(acacetin)。

2.4 線性關(guān)系考察 取“2.1”項(xiàng)下混合對(duì)照品溶液，分別進(jìn)樣1、3、5、7、9 μL，注入液相色譜儀，重復(fù)進(jìn)樣測(cè)定3次，記錄峰面積。以進(jìn)樣量X(μg)為橫坐標(biāo)，峰面積平均值Y為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線并進(jìn)行回歸計(jì)算，10個(gè)化合物對(duì)照品線性關(guān)系良好，回歸方程、線性范圍、相關(guān)系數(shù)見表1。

2.5 精密度試驗(yàn) 取同一供試品溶液，連續(xù)進(jìn)樣8次，測(cè)定峰面積。結(jié)果表明，10個(gè)色譜峰RSD為0.13%～1.28%。說(shuō)明精密度良好。

2.6 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取同一供試品溶液，分別于0、2、4、8、12、24、48、72 h進(jìn)樣測(cè)定各成分峰面積值。結(jié)果10個(gè)色譜峰峰面積的RSD(n=8)為0.51%～1.33%，表明供試品溶液在72 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.7 重復(fù)性試驗(yàn) 精密稱取同一樣品共5份，按照供試品溶液制備方法制得供試品溶液，進(jìn)樣10 μL，每份樣品測(cè)定3次，記錄峰面積，計(jì)算RSD值，結(jié)果表明，5份樣品重復(fù)性試驗(yàn)中，供試品中10個(gè)化合物的RSD值為0.66%～1.95%，說(shuō)明該方法重復(fù)性良好。

2.8 加樣回收率試驗(yàn) 取已知含量的菊花藥材粉碎成細(xì)粉，過(guò)40目篩。精密稱取0.5 g，平行稱取5份，置于具塞錐形瓶中，分別精密加樣10個(gè)對(duì)照品或?qū)φ掌啡芤哼m量，揮去溶劑，精密加入50 mL甲醇，稱定重量，超聲提取(功率250 W，頻率40 kHz)30 min，靜置放冷后稱定重量，用甲醇補(bǔ)足減失的重量，濾過(guò)，使用前經(jīng)0.22 μm微孔濾膜濾過(guò)，即得加樣供試品溶液。結(jié)果表明，平均加樣回收率(n=6)為95.6%～100.3%之間，RSD為1.05%～2.78%，說(shuō)明加樣回收率良好，符合要求。

2.9 樣品測(cè)定 本研究對(duì)菊花中共12個(gè)化合物進(jìn)行了含量測(cè)定，包括5個(gè)咖啡?？鼘幩犷惓煞趾?2個(gè)黃酮類成分，17份菊花藥材的含量測(cè)定結(jié)果見表2。

表1 10個(gè)化合物的線性關(guān)系

表2 17批藥材中10個(gè)化合物的含量測(cè)定結(jié)果(%，n=3)

注：1：5-咖啡酰奎寧酸(5-CQA);2：4-咖啡?？鼘幩?4-CQA)；3：木犀草苷(luteolin-7-O-glucoside)；4：1,5-二咖啡?？鼘幩?1,5-DCQA)；5：3,5-二咖啡?？鼘幩?3,5-DCQA)；6：4,5-二咖啡?？鼘幩?4,5-DCQA)；7：蒙花苷(linarin);8：木犀草素(luteolin)；9：香葉木素(diosmetin)；10：金合歡素(acacetin)；“—”表示未檢出。

3 討論

本實(shí)驗(yàn)分別考察了乙腈-水、乙腈-甲酸溶液等多個(gè)流動(dòng)相，流動(dòng)相中加入適量甲酸溶液對(duì)改善峰型具有明顯的效果，故選擇乙腈-0.05%的甲酸溶液作為流動(dòng)相。還考察了柱溫(20 ℃、30 ℃、40 ℃)對(duì)色譜分離的影響，結(jié)果表明：柱溫在40 ℃時(shí)色譜圖基線平穩(wěn)且分離度較好，本文選擇40 ℃作為分析溫度。

本研究分別考察了不同提取溶劑(30%甲醇、50%甲醇、70%甲醇、純甲醇)，不同提取方法(超聲、回流、索氏提取)，結(jié)果表明，純甲醇超聲提取的提取率最高，且省時(shí)，操作簡(jiǎn)單，故選擇超聲提取法對(duì)菊花藥材進(jìn)行提取?？疾炝顺晻r(shí)間(15 min、30 min、45 min)、提取容積體積(25 mL、50 mL、100 mL)和提取次數(shù)對(duì)樣品的提取效果，最終確定了本文的提取方法。

木犀草苷，5-CQA，4,5-DCQA，3,5-DCQA，1,5-DCQA是9種菊花的共有成分，咖啡?？鼘幩犷惓煞质蔷栈ㄖ兄饕煞?；芹菜素在祁菊、野菊花、懷菊、濟(jì)菊中含量較高；木犀草素在祁菊、濟(jì)菊、貢菊和滁菊中含量較高，這為9個(gè)品種的菊花質(zhì)量評(píng)價(jià)提供依據(jù)。有文獻(xiàn)研究結(jié)果表明[18]，咖啡?？鼘幩犷惢衔锖忘S酮類化合物是菊花中的抗氧化活性成分，并且是菊花中的主要成分，咖啡?？鼘幩犷惢衔锏目偪寡趸钚载暙I(xiàn)率更高，是主要的抗氧化活性物質(zhì)基礎(chǔ)。含量測(cè)定結(jié)果表明祁菊、濟(jì)菊、滁菊、亳菊中咖啡?？鼘幩犷惢衔锟偤枯^高，因此，以抗氧化活性為評(píng)價(jià)指標(biāo)，這4種菊花品質(zhì)較好。含量測(cè)定結(jié)果表明杭白菊、亳菊、貢菊、懷菊、祁菊中黃酮類化合物的含量相對(duì)較高，因此，以抗炎活性為評(píng)價(jià)指標(biāo)，這5種菊花的品質(zhì)較好。

中藥指紋圖譜已經(jīng)成為被廣泛認(rèn)可的質(zhì)控方法，然而只有當(dāng)指紋圖譜中譜峰的化學(xué)結(jié)構(gòu)清楚及含量明確，才能使其真正的發(fā)揮質(zhì)量評(píng)價(jià)的價(jià)值。近年來(lái)，有關(guān)菊花的含量測(cè)定及質(zhì)量控制文獻(xiàn)記載多以綠原酸、木犀草素、木犀草苷等單一成分或兩三個(gè)成分為指標(biāo)[19-21]，不能全面地體現(xiàn)菊花的內(nèi)在品質(zhì)，也不能體現(xiàn)菊花各道地產(chǎn)地的化學(xué)成分組成和特點(diǎn)。本研究對(duì)菊花中10個(gè)主要成分進(jìn)行了多成分含量測(cè)定，豐富了該藥材的化合物結(jié)構(gòu)信息，為菊花的質(zhì)量控制提供了準(zhǔn)確的數(shù)據(jù)信息，為明確不同品種菊花的基原關(guān)系和品種鑒定研究提供了科學(xué)依據(jù)。

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(2016-03-29收稿 責(zé)任編輯：張文婷)

Quantification of 10 Key Contents in Chrysanthemum Flower by HPLC

Wang Yueru1，Xie Wei2

(1ShaanxiInstituteofInternationalTrade&Commerce，Shaanxi，Xianyang712046,China； 2ShaanxiBuchangPharmaceuti-calCo.，Ltd.，Xianyang712000,China)

Objective:To establish an HPLC method for simultaneous determination of 10 contents including 5 caffeoylquinic acids and 5 flavones in Chrysanthemum Flower.Methods:HPLC separation was carried out with an DiamonsilTM C18column(4.6 mm×250 mm，5 μm)using acetonitrile-0.05% Formic acid as mobile phase at a flow rate of 1.0 mL/min.The detection wavelength was 335 nm and the column temperature was maintained at 40 ℃.Results:Good linear relationships were observed between the masses and the peak areas of the 10 contents； The average recovery rates were between 95.6 and 100.3%，RSDwas between 0.66 and 1.95%.Conclusion:The content determination method can be used as an effective method for the quality control of Chrysanthemum Flower，which provides the data base for the research on the relationships between different contents of Chrysanthemum Flower.

Chrysanthemum Flower； Flavones； Caffeoylquinic acids； HPLC； Quantification method

陜西省中醫(yī)藥管理局攻關(guān)項(xiàng)目(編號(hào):15-Zy033)

王月茹(1985.01—)，女，碩士，講師，研究方向：中藥資源開發(fā)與利用研究，E-mail:379544542@qq.com

謝偉(1984.09—)，男，碩士，主管藥師，研究方向：中醫(yī)藥知識(shí)產(chǎn)權(quán)保護(hù)研究，E-mail:x-w8485@163.com

R284.1

A

10.3969/j.issn.1673-7202.2016.12.066