趙麗華（白城醫(yī)學(xué)高等?？茖W(xué)校 吉林 白城 137000）

bcl-2和bax蛋白在頸椎穩(wěn)定性異常小鼠腦組織中表達的變化及其意義

趙麗華
（白城醫(yī)學(xué)高等?？茖W(xué)校 吉林 白城 137000）

頸椎病是開始于單個或多個頸椎間盤的進行性退行性病變，并可導(dǎo)致周圍骨和軟組織的結(jié)構(gòu)改變，影響相關(guān)血管、神經(jīng)根或(和)脊髓，所以患者常伴頭痛、血壓升高、心率增快，特別老年病人常伴記憶力減退、嗜睡、乏力、行為異常等組織器官衰老病癥。

頸椎??；頸椎間盤；生物學(xué)機制

1.引言

頸椎病是開始于單個或多個頸椎間盤的進行性退行性病變，并可導(dǎo)致周圍骨和軟組織的結(jié)構(gòu)改變，影響相關(guān)血管、神經(jīng)根或(和)脊髓，所以患者常伴頭痛、血壓升高、心率增快，特別老年病人常伴記憶力減退、嗜睡、乏力、行為異常等組織器官衰老病癥。為深入探討頸椎穩(wěn)定性異常導(dǎo)致腦細胞凋亡的機制，采用免疫組化、逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)和Western blot觀察bcl-2和bax蛋白在小鼠頸椎穩(wěn)定性異常病理模型[1]腦組織中的表達變化，探討頸椎穩(wěn)定性異常與AD發(fā)病的分子生物學(xué)機制。

2.試劑配制和方法

2.1 主要試劑配制

0.01M檸檬酸緩沖液：3g檸檬酸三鈉+0.4g檸檬酸溶入1000m1蒸餾水，用0.1M NaOH溶液調(diào)定至pH 6.0。

4%多聚甲醛溶液：40g多聚甲醛溶于1000m1PBS溶液中，加熱溶解。

鹽酸乙醇：70%乙醇100ml+1%鹽酸lml混合均勻。

DAB配制：1ml蒸餾水中加入一滴濃縮緩沖液，混合均勻；滴加DAB溶液和濃縮過氧化氫溶液各一滴，再次混勻。避光保存，30分鐘內(nèi)使用。

Hams蘇木素染色液：用200ml蒸餾水加熱溶解15g硫酸鋁鉀，用l0ml無水乙醇溶解1g蘇木精，再倒入已溶解的硫酸鋁鉀蒸餾水中，煮沸1分鐘后，稍冷卻，慢慢加入0.5g紅色氧化汞，繼續(xù)加熱至染液變?yōu)樽霞t色，用紗布蓋瓶口，用前濾紙過濾后每100m1加冰醋酸10ml。

2.2 取材方法

8月齡ICR小鼠60只，隨機分為3組，即模型A組、模型B組和正常對照組，模型組第一與第二頸椎關(guān)節(jié)囊被膜周圍分別注射30%乳酸溶液，模型A組15μl/次，1次/日，連續(xù)注射3周。模型B組30μl/次，1次/周，連續(xù)注射3周。正常組未經(jīng)任何處理。

造模三個月時，經(jīng)行為學(xué)檢測后，將動物眼球取血處死、取腦，部分放入10%甲醛，經(jīng)蠟塊包埋留做病理觀察，部分投入液氮中l(wèi)分鐘速凍，然后置-80℃冰箱內(nèi)保存。

2.3 RT-PCR和瓊脂糖凝膠電泳

提取腦組織總RNA，通過逆轉(zhuǎn)錄得到cDNA，然后進行PCR擴增，觀察bcl-2和bax的基因表達情況。

2.3.1總RNA提取 每組取雙側(cè)海馬和皮層組織各100mg（每組4只小鼠，每只鼠取25mg）置5ml離心管中，加預(yù)冷的異硫氰酸胍變性溶液1ml，勻漿。加0.1mlNaAc（2mol/L，pH4.0），1ml酚-氯仿-異丙醇混合液，震蕩，4℃、10000g離心20分鐘。吸取上清，加等容積異丙醇，-20℃放置2h以上，4℃、10000g離心15分鐘。吸去上清。向沉淀中加0.5ml變性溶液，攪拌至RNA溶解。加NaAc（2mol/ L，pH4.0）0.05ml，酚-氯仿-異戊醇混合液0.5ml，震蕩，4℃、10000g離心20分鐘。上層水相轉(zhuǎn)移到1.5ml離心管中，加等容積異丙醇，-20℃放置2h以上，4℃、10000g離心15分鐘。以預(yù)冷的75%乙醇5ml洗滌沉淀，并按前法離心。吸去乙醇，在真空干燥器中干燥沉淀15分鐘，用0.3～0.5mlDEPC水溶解RNA沉淀。紫外分光光度計測定（260/280）nm吸光值，估算RNA樣品純度。

RNA濃度（μg/ml）=OD260值×40μg/ml×稀釋倍數(shù)。

2.3.2引物設(shè)計 從Genebank中找到小鼠bcl-2、bax的全長cDNA序列，利用Primer5.0和Oligo6.0軟件設(shè)計引物，以β-actin做內(nèi)參用于RT-PCR。

經(jīng)檢驗引物內(nèi)部無發(fā)夾結(jié)構(gòu)，引物之間無二聚體形成，引物與基因庫之間無非特異性同源區(qū)域。

2.3.3逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)合成cDNA 在0.5ml Eppendorf管中加入：（1）取總RNA10μg加DEPC水至12.5μl；（2）加入Olig-dT(1μg/μl)2.5μl；（3）混勻后置65℃水浴10分鐘，冰浴2分鐘；（4）另取一個0.5ml Eppendorf管加入5×RT-buffer10μl，dNTP（10mM）2.5μl，MMLV（100U/μl）2.0μl，滅活的DEPC水21.5μl；（5）將（4）混勻后加入（3）中，42℃水浴1h，然后70℃水浴10分鐘滅活逆轉(zhuǎn)錄酶；（6）逆轉(zhuǎn)錄所得cDNA摸板放于-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

2.3.4 PCR反應(yīng)擴增 設(shè)置反應(yīng)程序：94℃變性1分鐘，55℃退火1分鐘，72℃延伸1.4分鐘，共34個循環(huán)，最后72℃延伸10分鐘。

反應(yīng)總體積25μl：cDNA2.5μl，2×Taq PCR Plus Mix 12.5μl，primer1.0μl，ddH2O；9.0μl。

混勻，進行PCR。反應(yīng)結(jié)束后，拿出樣品取5ulPCR產(chǎn)物在2%瓊脂糖凝膠板上電泳，電壓50V大約20分鐘。電泳條帶跑開后，將瓊脂糖凝膠用圖像分析儀進行圖像分析。

3.結(jié)果

3.1免疫組織化學(xué)染色結(jié)果

免疫組化陽性細胞特征：細胞內(nèi)（胞膜或胞漿或核膜）有棕色陽性反應(yīng)物。

3.1.1 bcl-2蛋白免疫組織化學(xué)染色 模型組小鼠腦海馬、額葉和顳葉陽性細胞數(shù)比正常對照組均明顯減少，說明頸椎穩(wěn)定性異常可致腦組織bcl-2表達下調(diào)。見圖1。

圖1 小鼠腦海馬區(qū)bcl-2蛋白免疫組織化學(xué)染色結(jié)果（10×40）

3.1.2 bax蛋白免疫組織化學(xué)染色 模型組小鼠腦海馬、額葉和顳葉bax陽性細胞數(shù)較正常對照組均明顯增多，大小形態(tài)較均一，說明頸椎穩(wěn)定性異常可致腦海馬區(qū)bax表達上調(diào)。見圖2。

圖2 小鼠腦海馬區(qū)bax蛋白免疫組織化學(xué)染色結(jié)果（10×40）

3.2 半定量RT-PCR產(chǎn)物的電泳圖譜

模型組bcl-2基因表達較正常對照組明顯下調(diào)，bax 和caspase-3基因表達明顯上調(diào)，見圖3。

圖3 bcl-2和bax半定量RT-PCR產(chǎn)物的電泳圖譜

與正常對照組相比，模型組腦組織bcl-2含量明顯降低，bax含量明顯升高，差異顯著，見表1。

表1 腦組織bcl-2和bax RT-PCR產(chǎn)物半定量分析結(jié)果

3.3 Western blot實驗結(jié)果

模型組（A組、B組）小鼠腦組織中bcl-2蛋白表達較正常對照組明顯減少，bax蛋白表達明顯增加，詳見圖4。

圖4 Western blot檢測小鼠腦海馬區(qū)bcl-2和bax蛋白的表達

4.討論

定位于線粒體外膜、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜和核外膜原癌基因bcl-2能阻止細胞凋亡，延長細胞壽命并增加細胞對多種凋亡刺激因素抵抗性。正常情況下，bcl-2呈周期性低水平表達且與其它基因表達相適應(yīng)，過低表達可促進細胞凋亡。

本實驗結(jié)果顯示：模型組小鼠腦組織bcl-2基因水平、蛋白水平表達水平較正常對照組顯著降低，提示在老年性癡呆發(fā)生過程中可能抑制bcl-2基因。

bcl-2能夠編碼bcl-2A和bcl-2B兩種蛋白質(zhì)，是膜的整合蛋白。其作用機制可能為：（1）阻斷從內(nèi)質(zhì)網(wǎng)釋出鈣離子，降低依賴鈣離子的核酸內(nèi)切酶活性，阻斷DNA消化和細胞凋亡；（2）抑制氧自由基的產(chǎn)生或起抗氧化劑作用而阻斷細胞凋亡[2]；（3）作用并控制線粒體與核孔復(fù)合體上的信號分子轉(zhuǎn)導(dǎo)來延長細胞生存，bcl-2蛋白可與bax蛋白相結(jié)合，抑制細胞凋亡，bcl-2/bax比值決定了細胞接受凋亡信號后細胞存活與否；（4）bcl-2通過阻斷凋亡最后基因通路（激活caspases）抑制凋亡[3]。

Bax的基因產(chǎn)物蛋白由192個氨基酸組成，21%氨基酸與bcl-2同源，生物作用是促進凋亡，拮抗bcl-2功能。

本實驗應(yīng)用免疫組化染色和western blot試驗檢測同一組小鼠腦組織凋亡調(diào)控基因bcl-2/bax蛋白表達情況，發(fā)現(xiàn)AD演變過程中bcl-2蛋白表達陽性率逐漸減少，bax蛋白表達陽性率則逐漸增加，bcl-2與bax陽性率比值逐漸降低，說明頸椎穩(wěn)定性異常使腦組織bcl-2表達下調(diào)、bax表達上調(diào)，促進腦細胞凋亡。

[1]林桂渺，趙洪艷，范文靜，等.寰樞椎長期乳酸堆積對老年小鼠學(xué)習(xí)記憶能力的影響[J].吉林大學(xué)學(xué)報，2006，32(6)：968-970.

[2]張曉鈴.450例頸椎病患者的臨床流行病學(xué)分析[J].中華流行病學(xué)雜志，1995，16(1):35.

[3]黃流清，邵福源.他汀類藥物與癡呆[J].世界臨床藥物，2003，24(9):521-524.

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1009-5624（2016）06-0170-03