千建峰 蔡麗慧 亓衛(wèi)東* 趙 霞 陳 新

1(復(fù)旦大學(xué)附屬華山醫(yī)院耳鼻咽喉-頭頸外科，上海 200040)2(聚合物分子工程國家重點實驗室，高分子及其先進(jìn)復(fù)合材料協(xié)同創(chuàng)新中心，復(fù)旦大學(xué)高分子科學(xué)系先進(jìn)材料實驗室,上海 200433)3(鄭州人民醫(yī)院耳鼻咽喉-頭頸外科, 鄭州 450012)

不同孔徑絲素蛋白支架體內(nèi)降解觀察

千建峰1,3蔡麗慧1亓衛(wèi)東1*趙 霞1陳 新2

1(復(fù)旦大學(xué)附屬華山醫(yī)院耳鼻咽喉-頭頸外科，上海 200040)2(聚合物分子工程國家重點實驗室，高分子及其先進(jìn)復(fù)合材料協(xié)同創(chuàng)新中心，復(fù)旦大學(xué)高分子科學(xué)系先進(jìn)材料實驗室,上海 200433)3(鄭州人民醫(yī)院耳鼻咽喉-頭頸外科, 鄭州 450012)

近年來，絲素蛋白支架因其固有的低免疫原性、良好的生物相容性在組織工程研究中備受關(guān)注。通過觀察不同孔徑絲素蛋白支架在活體Sprague-Dawley(SD)大鼠體內(nèi)不同時間點降解的形態(tài)學(xué)特點，了解材料的結(jié)構(gòu)特性對絲素蛋白支架降解的影響。將3種不同孔徑絲素蛋白支架：SF1(平均孔徑 (20±1.5) μm，平均孔隙率 86.8%±0.2%)、SF2(平均孔徑(100±8) μm，平均孔隙率 92.4%±0.1%)、SF3(平均孔徑(200±15) μm，平均孔隙率 96.6%±0.1%)隨機(jī)植入12只SD大鼠背部皮下，分別于術(shù)后6、12、18、24周隨機(jī)取材，分別進(jìn)行大體觀察、組織切片HE染色和Masson染色。結(jié)果顯示，不同孔徑絲素蛋白支架在體內(nèi)的降解速率不同：SF1 24周內(nèi)未見明降解，SF2 24周內(nèi)降解約40%，SF3至24周時基本崩解。植入早期絲素蛋白支架主要被炎性細(xì)胞及成纖維細(xì)胞浸潤，后期主要為成纖維細(xì)胞，并可見膠原纖維包繞并生長入材料?？讖捷^大的絲素蛋白支架比孔徑較小的降解速度快，可通過改變絲素蛋白支架的孔徑有效干預(yù)絲素蛋白支架在生物體內(nèi)的降解速率，以適應(yīng)不同組織修復(fù)的需求。

絲素蛋白；多孔支架；組織工程；降解

引言

組織工程技術(shù)包含3個關(guān)鍵要素：種子細(xì)胞、支架材料和細(xì)胞因子[1]。支架材料作為組織再生的框架，其特性直接影響細(xì)胞的粘附、生長和代謝。多孔絲素蛋白支架能夠支持軟骨細(xì)胞、骨細(xì)胞、上皮細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞、膠質(zhì)細(xì)胞、角質(zhì)化細(xì)胞、成纖維細(xì)胞、血管、脂肪、神經(jīng)等的黏附、增殖與分化，成為目前組織工程研究的熱點[2-8]。我們已在多孔徑絲素蛋白支架上成功培養(yǎng)了成纖維細(xì)胞、許旺細(xì)胞[9]，初步觀察了多孔絲素蛋白支架原位修復(fù)兔下

頜骨臨界性骨缺損效果[10]。理想的組織工程支架材料不僅要具備良好的生物相容性，還應(yīng)具有與修復(fù)區(qū)組織細(xì)胞生長速率相匹配的降解速率，這樣才能為新生組織提供相應(yīng)的力學(xué)支撐。由于對絲素蛋白材料體內(nèi)降解的控制尚缺乏深入的了解[11-13]，本研究通過對活體動物體內(nèi)埋植不同孔徑絲素蛋白降解行為進(jìn)行觀察，了解不同孔徑絲素蛋白支架在體內(nèi)降解速率、降解過程中材料的形態(tài)學(xué)改變以及宿主的組織學(xué)反應(yīng)，為進(jìn)一步研究絲素蛋白材料體內(nèi)降解的可控提供參考。

1 材料與方法

1.1 多孔絲素蛋白支架的制備

由復(fù)旦大學(xué)高分子科學(xué)系制備3種不同孔徑的絲素蛋白支架，3種支架的規(guī)格均為直徑1.5 cm、厚0.5 cm圓柱體，圓柱體外周為薄致密層，內(nèi)為多孔結(jié)構(gòu)，孔徑平均大小分別為20、100、200 μm，依次以SF1、SF2、SF3命名。

1.2 多孔絲素蛋白支架的基本參數(shù)檢測

1.2.1 孔隙率的測定

采用密度法測量，有

式中，WS為絲素蛋白支架的質(zhì)量，VS為支架的表觀體積，ρ為絲素蛋白密度。

隨機(jī)取5個絲素蛋白支架樣品，其中絲素蛋白密度ρ=1.355 g/cm3，計算3種絲素蛋白支架的孔隙率(n=5)。

1.2.2 孔徑的測定

在3種多孔絲素蛋白支架中分別隨機(jī)抽取20個樣本，切成小片后冷凍干燥，然后在液氮中脆斷，并用導(dǎo)電膠固定在樣品臺上，噴金后在TS 5136MM型可變真空掃描電子顯微鏡上(500×)對多孔支架斷面的形貌進(jìn)行觀察，測試電壓為20 kV。多孔支架的孔徑大小和分布由圖像處理軟件隨機(jī)選擇50個孔測量并統(tǒng)計平均求得，以Mean±SD表示。

1.3 動物實驗

1.3.1 實驗動物的購買與飼養(yǎng)

健康Sprague-Dawley(SD)雄性大鼠12只，體重150～200 g，由復(fù)旦大學(xué)上海醫(yī)學(xué)院實驗動物部提供[許可證:SCXK(滬)2007-0 007]。在復(fù)旦大學(xué)上海醫(yī)學(xué)院實驗動物中心同環(huán)境下適應(yīng)性飼養(yǎng)1周。

1.3.2 支架植入手術(shù)

術(shù)區(qū)備皮，動物用鹽酸氯胺酮注射液(2 mL/0.1 g)與咪達(dá)唑侖注射液(2 mL/2 mg)按1∶2比例混合后腹腔麻醉。仰臥位，碘伏于術(shù)區(qū)及周圍5 cm的皮膚常規(guī)消毒、鋪巾。在其脊柱兩側(cè)共作3個長約1 cm切口，潛行分離形成3個皮下囊狀間隙，分別將SF1、SF2、SF3植入左上、右上及左下3個囊狀間隙，絲線分層縫合皮膚切口。

1.3.3 實驗分組及取材

根據(jù)國家標(biāo)準(zhǔn)[14]《醫(yī)療器械生物學(xué)評價第六部分：植入后局部反應(yīng)試驗》確定觀察時間為材料植入SD大鼠體內(nèi)術(shù)后6、12、18、24周。每個時間點隨機(jī)抽取3只動物取材，每次分別有SF1、SF2、SF3各3個標(biāo)本。分別進(jìn)行大體觀察、HE染色、Masson染色組織切片觀察。

1.3.4 術(shù)后觀察及組織學(xué)染色

1)大體觀察。動物麻醉后取出皮下植入材料，取材時保留周圍部分組織。觀察材料周圍組織有無明顯炎癥反應(yīng)，材料表面有無明顯纖維組織包繞，周圍組織有無反應(yīng)性肉芽增生，植入材料的外觀形態(tài)改變，測量植入材料的直徑與厚度得出降解百分比。

2)HE染色。將植入材料標(biāo)本置于10%中性福爾馬林液中固定，常規(guī)石蠟包埋、切片、HE染色，光學(xué)顯微鏡下觀察不同時間點組織纖維化反應(yīng)、炎性細(xì)胞類型，及支架崩解情況，是否存在組織壞死，材料內(nèi)有無組織長入。

3)Masson染色。取出材料保留部分周圍組織，常規(guī)石蠟包埋、切片、Masson染色，光學(xué)顯微鏡下觀察Masson染色結(jié)果，染色后膠原纖維、粘液、軟骨呈藍(lán)色，胞漿、肌肉、纖維素、神經(jīng)膠質(zhì)呈紅色，胞核黑藍(lán)色。

2 結(jié)果

2.1 多孔絲素蛋白支架孔徑及孔隙率

制備3種多孔絲素蛋白支架材料SF1、SF2、SF3(見圖1)，平均孔徑及孔隙率見表1。

圖1 3種不同孔徑絲素材料掃描電鏡照片(500×)。 (a) SF1； (b) SF2； (c) SF3Fig.1 Scanning electron microscope images of silk fibroin scaffolds with different pore sizes (500×). (a) SF1; (b) SF2; (c) SF3

表1 3種多孔絲素蛋白支架參數(shù)(均值±標(biāo)準(zhǔn)差)Tab.1 Mean aperture and mean porosity of 3 silk fibroin scaffold materials(Mean±SD)

2.2 標(biāo)本大體觀察

SF1: 術(shù)后6周，SF1形態(tài)、外觀與植入前無明顯變化，移植物周圍無明顯炎癥反應(yīng)；術(shù)后12～24周，可見絲素蛋白支架與周圍組織輕度粘連，易于分離。6周～24周內(nèi)支架材料體積及外形無明顯變化(見圖2(a))。

SF2: 術(shù)后6周，SF2與周圍組織粘連，表面組織較易分離。第12周開始發(fā)現(xiàn)材料體積變小約15%，部分降解，與周圍新生組織難以分離。隨著時間延長，材料厚度逐漸變薄，與周圍組織粘連更加緊密，24周時絲素蛋白支架直徑無明顯變化，厚度縮小約40%(見圖2(b))。

SF3: 術(shù)后6周，SF-3與周圍組織難以分離，體積較植入前變小。12周時，材料與周圍組織分離困難，材料直徑無明顯變化，體積縮小約50%。24周時，組織生長進(jìn)入材料內(nèi)部，很難找到成形材料存在(見圖2(c))。

總體上SF1在24周內(nèi)降解十分緩慢或基本不能降解；SF2降解較緩慢，24周時厚度縮小約40%；SF3降解較快，12周厚度減少約50%，24周時支架基本崩解。

圖2 植入3種支架術(shù)后大體觀察像(每行從左至右分別為12、18、24周時照片)。 (a) SF1; (b) SF2; (c) SF3Fig.2 Images of 3 silk fibroin scaffolds postoperative 12, 18 and 24 weeks (from left to right each line). (a) SF1; (b) SF 2; (c) SF 3

2.3 HE染色

SF1: 術(shù)后第6周取材，SF-1材料表面可見巨噬細(xì)胞及較多中性粒細(xì)胞浸潤。隨著時間延長，炎癥細(xì)胞逐漸減少，成纖維細(xì)胞逐漸增多。在整個降解過程中絲素蛋白支架嗜伊紅染色，材料與周圍組織界限清楚，內(nèi)部未見組織細(xì)胞長入，材料結(jié)構(gòu)變化不大(見圖3(a))。

SF2：術(shù)后6周可見成纖維細(xì)胞粘附在絲素蛋白材料表面生長，周圍組織呈增生性改變，可見炎性細(xì)胞浸潤，偶可見新生血管形成，周圍組織未見壞死征象。術(shù)后12周可見組織細(xì)胞逐漸長入材料，18周后邊界材料出現(xiàn)明顯崩解現(xiàn)象，24周可見成熟血管長入材料(見圖3(b))。

SF3：術(shù)后6周材料內(nèi)部分區(qū)域嗜伊紅染色消失，支架結(jié)構(gòu)有崩解現(xiàn)象，炎癥細(xì)胞明顯減少，可見較多血管及成纖維細(xì)胞，成纖維細(xì)胞等組織細(xì)胞逐漸深入材料內(nèi)部生長。術(shù)后12周見較多成熟血管及成纖維細(xì)胞，材料邊緣支架結(jié)構(gòu)崩解現(xiàn)象較前明顯，出現(xiàn)較大孔隙，但材料內(nèi)部變化不大，組織細(xì)胞進(jìn)一步長入材料，組織增生現(xiàn)象仍較明顯。術(shù)后18周與12周所見基本相同，組織細(xì)胞進(jìn)一步長入材料。術(shù)后24周絲素支架基本崩解，組織細(xì)胞與殘存材料共存，鏡下界限不明確(見圖3(c))。

圖3 植入3種支架后HE染色圖像(每行從左至右分別為6、12、18、24周時照片，左起第1列400×，其余為200×; S-絲素蛋白支架, *-巨噬細(xì)胞; ★-血管)。 (a) SF1; (b) SF2; (c) SF3Fig.3 Images of HE staining for 3 silk fibroin scaffolds postoperative 6, 12, 18 and 24 weeks (From left to right each line, first column left 400×, others 200×; S- silk fibroin scaffolds, *- macrophages; ★- blood vessel). (a) SF 1; (b) SF 2; (c) SF 3

2.4 Masson染色

SF1：術(shù)后6周、12周、18周時，材料與周圍組織無明顯粘連，可見膠原纖維與絲素材料界限較清楚，未見明顯包繞、長入。術(shù)后24周見膠原纖維包繞材料，但未長入材料(見圖4(a))。

SF2：術(shù)后6周材料周圍見膠原纖維包繞，未見明顯長入。術(shù)后12周，膠原纖維長入材料，邊界模糊。隨著時間延長，血管與膠原纖維逐漸由絲素蛋白支架周圍向內(nèi)部生長(見圖4(b))。

SF3：術(shù)后6周見較多膠原纖維、新生血管長入材料。12周時可見成熟血管及膠原纖維進(jìn)一步長入。18周時見膠原纖維侵入材料深部，分區(qū)包繞材料。24周見大量膠原纖維分區(qū)包繞殘余材料，正常材料結(jié)構(gòu)基本消失(見圖4(c))。

圖4 植入3種支架后Masson染色圖像(每行從左至右分別為6、12、18、24周時照片, 400×; CF-膠原; ★-血管)。 (a) SF1; (b) SF2; (c) SF3Fig.4 Images of Masson staining for 3 silk fibroin scaffolds postoperative 6, 12, 18 and 24 weeks(From left to right each line, 400×; CF- collagen; ★- blood vessel). (a) SF1; (b) SF2; (c) SF3

3 討論

天然蠶絲作為手術(shù)縫線已有超過100年的歷史，其主要成分絲素蛋白作為一種天然高分子材料，因其固有的低免疫原性、良好的生物相容性、緩慢的降解速度和特有的理化性質(zhì)在組織工程研究中備受關(guān)注。

具備良好的生物相容性是作為組織工程或組織誘導(dǎo)支架的一個必要前提，生物材料的降解性能同樣至關(guān)重要，材料的降解速率必須與組織的再生速率相匹配，并且滿足組織的功能需求。因此，需要弄清絲素蛋白材料的生物可降解程度、降解機(jī)理及影響其降解速度的因素。

絲素蛋白在體內(nèi)降解并非單一機(jī)理，而是一個復(fù)雜的生物物理、生物化學(xué)協(xié)同作用、相互促進(jìn)的過程。多孔絲素的降解行為與材料制備工藝、孔徑、絲素蛋白的濃度、材料表面粗糙度、結(jié)晶度，材料植入部位、周圍受力情況密切相關(guān)[15-16]。體外研究顯示，多種蛋白酶如彈性蛋白酶、放線菌蛋白酶、膠原蛋白酶等對絲素蛋白材料具有降解作用[17-18]。生物體內(nèi)環(huán)境復(fù)雜，通過活體實驗?zāi)軌蛑苯?、?zhǔn)確地了解材料在動物體內(nèi)的降解行為及機(jī)體對材料的組織學(xué)反應(yīng)。本實驗中3種絲素蛋白支架的差別主要是孔徑不同，通過觀察不同孔徑絲素蛋白支架體內(nèi)降解過程，為我們了解材料結(jié)構(gòu)特性對絲素蛋白體內(nèi)降解的影響提供幫助。

在形貌特征方面，絲素蛋白具有的疏松多孔結(jié)構(gòu)有利于細(xì)胞黏附[19]。本實驗制備的材料具有疏松多孔結(jié)構(gòu)，3種絲素蛋白支架的平均孔徑分別為20、100、200 μm，孔隙率均在85%以上。絲素蛋白屬于天然可降解生物活性材料，通過觀察上述3種不同孔徑絲素蛋白支架在體內(nèi)降解速率，孔徑最小的SF1植入SD大鼠皮下24周基本沒有降解，孔徑較大的SF2植入24周后材料降解約40%，孔徑最大的SF3植入24周后基本崩解。因此，孔徑較大的SF3、SF2較孔徑小的SF1降解速率明顯加快，這種體內(nèi)降解速率的差異是由孔徑不同造成的。我們考慮大孔徑、高孔隙率一方面能夠降低了植入材料密度，另一方面提高了支架材料與細(xì)胞的接觸面積，有利于細(xì)胞黏附生長進(jìn)入支架內(nèi)部，有利于營養(yǎng)物質(zhì)進(jìn)入及代謝產(chǎn)物排出。

我們在取材時發(fā)現(xiàn)，6周時植入物周圍炎癥反應(yīng)已不明顯，且材料表面有半透明纖維膜包裹。3種絲素蛋白支架降解速率明顯不同，隨著材料的降解，周圍組織逐漸長入支架內(nèi)部，難以分離。HE染色發(fā)現(xiàn)絲素蛋白嗜伊紅染色，植入初期材料表面可見炎性細(xì)胞聚集及成纖維細(xì)胞緊貼材料的不規(guī)則表面沿腔隙向內(nèi)部生長，后期炎性細(xì)胞明顯減少，血管及成纖維組織逐漸向材料內(nèi)部生長，大孔徑材料結(jié)構(gòu)逐漸崩解，形態(tài)不規(guī)整。Masson染色可見降解較快的SF2與SF3被大量膠原纖維長入、包繞，降解較慢的SF1未見膠原纖維長入。實驗結(jié)果提示，絲素蛋白在體內(nèi)的降解，早期主要與宿主的炎性細(xì)胞聚集有關(guān)，而后期似與成纖維細(xì)胞有關(guān)，炎性細(xì)胞中的巨噬細(xì)胞與生物材料在體內(nèi)的降解有關(guān)。

4 結(jié)論

綜上所述，絲素蛋白支架具有良好的組織相容性，孔徑大小對絲素材料降解有明顯相關(guān)性，提示可通過改變絲素蛋白支架的孔徑有效干預(yù)其在生物體內(nèi)的降解速率以匹配不同組織修復(fù)的要求。但是，根據(jù)不同部位組織修復(fù)的特點，除了考慮支架材料降解與局部組織修復(fù)速度相匹配這一因素外，對支架材料在不同時間點的機(jī)械強(qiáng)度也有相應(yīng)要求，因此實現(xiàn)絲素蛋白的降解與其功能發(fā)揮的同步仍需進(jìn)一步研究。

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Degradation Behaviors of Silk Fibroin Scaffolds with Different Pore Sizesinvivo

Qian Jianfeng1, 3Cai Lihui1Qi Weidong1*Zhao Xia1Chen Xin2

1(DepartmentofOtolaryngologyHeadandNeckSurgery,HuashanHospitalFudanUniversity,Shanghai200040,China)2(StateKeyLaboratoryofMolecularEngineeringofPolymers,CollaborativeInnovationCenterofPolymersandPolymerCompositeMaterials,DepartmentofMacromolecularScience,LaboratoryofAdvancedMaterials,FudanUniversity,Shanghai200433,China)3(DepartmentofOtolaryngologyHeadandNeckSurgery,ZhengzhouPeople′sHospital,Zhengzhou450012,China)

silk fibroin; scaffolds; tissue engineering; degradation

10.3969/j.issn.0258-8021. 2016. 04.018

2015-06-28， 錄用日期:2016-04-15

國家自然科學(xué)基金項目(81271094)

R318

D

0258-8021(2016) 04-0507-05

*通信作者(Corresponding author)， E-mail:drqiweidong@126.com