王芳 高瑾 張東華 馬煥成 伍建榕

摘要：為了探討不同根瘤茵對臺灣相思幼苗的影響，采用分離自干熱河谷地區(qū)野生豆科樹種根瘤的根瘤菌菌株接種到臺灣相思盆栽無菌幼苗上，60天后，測定臺灣相思幼苗的苗高、地徑，并對其結(jié)瘤情況進(jìn)行了統(tǒng)計，結(jié)果表明，接種不同根瘤菌菌株對臺灣相思幼苗的苗高及地徑生長的影響是不同的，且與菌株的系統(tǒng)發(fā)育地位無關(guān)，其中接種菌株sxfu-02對臺灣相思幼苗的生長有較大的促進(jìn)作用，其結(jié)瘤率也最高，可初步評選為促進(jìn)臺灣相思幼苗生長的根瘤菌菌株。

關(guān)鍵詞：干熱河谷；臺灣相思；根瘤茵；生長

豆科樹臺灣相思（ Acacia confusa）別名相思樹、臺灣柳，為多年生豆科常綠喬木。分布于我國臺灣、福建、廣東、廣西、云南等省區(qū)，菲律賓、印尼、斐濟(jì)也有分布。臺灣相思樹高可達(dá)15～18 m，胸徑可達(dá)70cm，樹干稍彎，最喜光，畏寒，生長迅速且萌發(fā)力強(qiáng)，極耐干旱和瘠薄。根系發(fā)達(dá)，根深材韌，抗風(fēng)力強(qiáng)，并且根系有根瘤，能固定大氣中的游離氮，改良土壤營養(yǎng)結(jié)構(gòu)，是荒山荒地造林的先鋒樹種，已逐漸成為西部干熱河谷地區(qū)的主要造林樹種剛。干熱河谷地帶由于其干旱、高溫、土壤瘠薄等立地條件的限制，決定了在該地區(qū)造林工作的特殊性和艱巨性。因此，除了在樹種的選擇上盡量做到適地適樹，對于相應(yīng)樹種共生的根瘤菌的應(yīng)用也需篩選適合該地區(qū)生態(tài)特點(diǎn)的菌株。在相同立地條件下，篩選固氮效率高且能促進(jìn)苗木生長的根瘤菌，對提高現(xiàn)有共生體系的固氮效率有重要的實(shí)際意義。本文選取分離白相同立地條件下，干熱河谷地區(qū)元陽、元江、元謀、東川及攀枝花5個地區(qū)的野生豆科樹種根瘤的15株菌株為研究對象，進(jìn)行了16SrRNA序列測定，并用MEGA軟件構(gòu)建了其系統(tǒng)發(fā)育樹，通過分析15株供試菌株分別屬于快生根瘤菌屬（Rhizobium）、中慢根瘤菌屬（Mesorhizobium）和慢生根瘤菌屬（Bradyrhizobium），接著將這些菌株接種到相思盆栽無菌幼苗中，通過測定接種了不同菌株的臺灣相思幼苗的結(jié)瘤狀況及生長情況來研究根瘤菌對臺灣相思幼苗生長的影響，篩選最能促進(jìn)臺灣相思幼苗生長的優(yōu)良菌株，為進(jìn)一步研究和合理利用干熱河谷的固氮資源提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 供試菌株

本試驗(yàn)利用前期分離白干熱河谷地區(qū)野生豆科植物根瘤的菌株，菌株信息見表l。

1.2 干熱河谷臺灣相思根瘤菌菌株的系統(tǒng)發(fā)育地位

將上述供試菌株活化后，轉(zhuǎn)接于TY液體培養(yǎng)基，在搖床上28℃震蕩培養(yǎng)制成菌液，收集菌體，用細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒中供試菌株的DNA，利用引物Pl和P6，擴(kuò)增16S rRNA基因。基因PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)電泳檢測后，送生物公司直接測序。所得序列在GenBank數(shù)據(jù)庫中利用Blastn軟件在線比對，并下載相近的參比16S rRNA序列，在Mega軟件中，采用鄰接法（Neighhor-Joining），以Jukes&Cantor;模型構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。

1.3 臺灣相思幼苗培育

挑選籽粒飽滿的臺灣相思種子，用0.2%～0.5%的高錳酸鉀液浸泡約20min進(jìn)行表面消毒后，用清水沖洗2～3次，于40～60℃水浸泡24h，使種子充分吸水膨脹，然后點(diǎn)種在已滅菌的發(fā)芽皿中，放置在28℃恒溫人工氣候箱中催芽。待幼苗的胚根長至0.5～lcm時，將苗木移植到經(jīng)過高壓滅菌的沙質(zhì)基質(zhì)中，并澆灌無氮培養(yǎng)液。

1.4 根瘤菌的培養(yǎng)及臺灣相思苗木接種 將上述15株干熱河谷地區(qū)豆科樹木根瘤菌菌株（見表1）接人YMA固體斜面培養(yǎng)基，在28℃培養(yǎng)3d，活化后，挑取菌體，接入YMA液體培養(yǎng)基，在搖床上280C震蕩培養(yǎng)制成菌液，將菌液澆在長出真葉的種子周圍，每個菌株接種6盆（6個重復(fù)）。同時培養(yǎng)不接種根瘤菌的苗木，作為接種有根瘤菌苗木的對照組（對照）。

1.5 生長指標(biāo)的測定

待苗木長出根瘤后，即相思苗生長60d后，測定苗木的苗高、地徑、葉片數(shù)及新發(fā)葉片的葉長及葉寬。用鋼尺量取苗木的苗高，用千分尺量取苗木的地徑，計算苗木的葉片數(shù)，并用直尺量取葉片的長度和寬度。

1.6 臺灣相思幼苗的結(jié)瘤情況

測定苗木的生長指標(biāo)后，取出苗木，記錄每株植株的根瘤的個數(shù)、顏色、測量根瘤的直徑，并轉(zhuǎn)換求植株的結(jié)瘤率。結(jié)瘤率（%）=結(jié)瘤植株數(shù)/該處理總植株數(shù)×100。

2 結(jié)果與分析

2.1 干熱河谷臺灣相思根瘤菌菌株的系統(tǒng)發(fā)育地位

目前，細(xì)菌系統(tǒng)發(fā)育學(xué)研究的主要方法是16SrRNA全基因序列分析，而且該方法也是根瘤菌系統(tǒng)發(fā)育研究的首選方法。本研究中，挑選的15株干熱河谷臺灣相思根瘤菌采用Mega4.0分析軟件對序列進(jìn)行比對并構(gòu)建其系統(tǒng)發(fā)育樹（圖1），所有的菌株均位于a一變形桿菌綱根瘤菌目的系統(tǒng)發(fā)育分支，并分別歸屬于根瘤菌屬（Rhizobium）、中慢根瘤菌屬（Mesorhizo-bium）及慢生根瘤菌屬（Badyrhizobium）。

2.2 接種根瘤菌對臺灣相思幼苗生長狀況的影響

接種不同根瘤菌菌株后臺灣相思幼苗的生長情況見表2。從表2可看出，不同根瘤菌對臺灣相思幼苗生長的影響不同，在接種60天后，苗高、地徑及葉片數(shù)都有不同程度的增加（與對照相比），增幅分別為5.19%～72.79%、3.88%～23.69%、10.35%～65.53%，眾所周知，苗木的生長需要吸收氮素，在相同的處理?xiàng)l件（無氮營養(yǎng)液）下，接種根瘤菌的幼苗均比未接種的幼苗長勢好，這說明根瘤菌的固氮作用促進(jìn)了臺灣相思幼苗的生長，但地徑增加的幅度較小。對于苗高，增加幅度最大的是接種swfu-05菌株的幼苗，達(dá)72.79%，其次為接種swfu-01號和swfu-12號菌株的幼苗，均高于60%，最低的是接種swfu-04菌株的幼苗，低于10%。對于地徑，其中增加幅度最大的是接種swfu-02菌株的幼苗，為23.69%，其次為接種swfu-05和swfu-01菌株的幼苗，分別為21.82%和17.52%，最低的是接種sWfu-07的幼苗，僅為3.88%。對于葉片數(shù)，增幅最大的是接種swu-01菌株的幼苗，為65.53%，其次為接種sWfu-08和swfu-02菌株的幼苗，均為55.18%，最低的是接種swfu-12，為10.35%。綜上，接種菌株swfu-05和sw-fu -02，其苗高、地徑、葉片數(shù)的增幅分別為72.79%、21.82%、44.84%和54.73%、23.69%、55.18%，接種菌株swfu-02對臺灣相思幼苗的生長有更大的促進(jìn)作用。

接種不同根瘤菌菌株的苗木與未接種根瘤菌的苗木（對照）的苗高、地徑及葉片數(shù)的方差分析結(jié)果見表3。其方差分析結(jié)果顯示，接種各根瘤菌菌株的臺灣相思苗木與未經(jīng)接種的對照相比，其苗木高的生長存在顯著差異（O.01

2.3 接種根瘤菌臺灣相思幼苗的結(jié)瘤情況統(tǒng)計

接種供試菌株的臺灣相思，接種60d后，均可見根系根瘤，接種不同根瘤菌菌株后臺灣相思幼苗的結(jié)瘤情況見表4。在臺灣相思幼苗上的根瘤主要呈圓形、橢圓形，顏色多為淡黃色，接種菌株swfu-01及swfu-15為白色，為無效根瘤。從表4可看出，接種菌株sw-fu-02、swfu-05、swfu-10幼苗結(jié)瘤率最高，結(jié)瘤率均為100%；其次為接種菌株swfu-03、swfu-12及菌株sw-fu-09的臺灣相思幼苗，結(jié)瘤率均為83.335。結(jié)瘤量最多的是接種菌株swfu-02的臺灣相思幼苗，為9.33顆/株，其次是接種菌株swfu-03的幼苗，為8.67顆/株，其它結(jié)瘤狀況均屬中等。

3 結(jié)論與討論

接種不同根瘤菌菌株對臺灣相思幼苗的苗高、地徑、葉片數(shù)的影響是不相同的，菌株swfu-01、swfu-02、swfu-05、swfu-08和swfu-12對其有較明顯的效果，其中swfu-01、swfu-02、swfu-05和swfu-12分屬于慢生根瘤菌屬，sWfu-08分屬于中慢生根瘤菌屬，可見不同根瘤菌株的系統(tǒng)發(fā)育地位與臺灣相思幼苗的生長情況沒有直接關(guān)系。接種菌株swfu-02的幼苗的長勢最好，結(jié)瘤數(shù)目及結(jié)瘤率也相對較高。從苗高、地徑及葉片數(shù)的增幅來看，接種菌株sWfu-02對臺灣相思幼苗的生長有較大的促進(jìn)作用，可初步評選為促進(jìn)臺灣相思幼苗生長的根瘤菌菌株。但是本文進(jìn)行的優(yōu)良臺灣相思樹種根瘤菌菌株的篩選工作還是初步的，要篩選出真正能大規(guī)模應(yīng)用于生產(chǎn)的優(yōu)良菌株仍需進(jìn)一步的深入研究。

據(jù)報道凹，利用外生菌根菌與根瘤菌雙接種馬占相思，其接種效應(yīng)優(yōu)于單接種效應(yīng)，且外生菌根菌能產(chǎn)生大量孢子，可進(jìn)行人工純培養(yǎng)，易于生產(chǎn)中大規(guī)模使用，所以該法值得深入研究。同時，VA菌根在促進(jìn)宿主植物抗逆能力和抗病能力等方面具有優(yōu)勢，也可考慮進(jìn)行根瘤菌、外生菌根菌和VA菌根三接種效應(yīng)的研究。由于相思根瘤菌共生體系的固氮過程從根本上是由根瘤菌、相思類樹種和立地環(huán)境三者共同決定的，因此固氮效率的提高，不應(yīng)局限于菌株的篩選與改良上，也應(yīng)挖掘后兩者的潛力，如利用遺傳工程方法進(jìn)行相思林木有關(guān)性狀的基因?qū)哟胃牧迹x擇具有優(yōu)良性狀的相思類樹種，進(jìn)行精細(xì)的耕作管理等等。這是當(dāng)前擺在我國林業(yè)工作者面前的一項(xiàng)緊迫任務(wù)，仍需付出長期艱辛的努力。